Article de méthode

Analyse de la démarche à faible coût pour le phénotypage comportemental des modèles de souris de la maladie neuromusculaire

DOI :

10.3791/59878

⸱

18 juillet 2019

 ,  ,  , 
1Department of Neurology, Duke University School of Medicine, 2Duke Center for Neurodegeneration & Neurotherapeutics, Duke University School of Medicine, 3Biomedical Sciences Graduate Program, University of California San Diego, 4Department of Neurobiology, Duke University School of Medicine, 5Department of Cell Biology, Duke University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'analyse de l'empreinte est une alternative peu coûteuse aux programmes numérisés d'analyse de la démarche pour les chercheurs quantifiant les anomalies du mouvement chez la souris. En raison de sa vitesse, de sa simplicité et de son potentiel longitudinal, il est idéal pour le phénotypage comportemental des modèles murins.

Résumé

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La mesure de la locomotion animale est un outil comportemental commun utilisé pour décrire le phénotype d'une maladie, d'une blessure ou d'un modèle de drogue donné. La méthode à faible coût de l'analyse de la démarche démontrée ici est une mesure simple mais efficace des anomalies de la démarche dans les modèles murins. Les empreintes de pas sont analysées en peignant les pieds d'une souris avec de la peinture lavable non toxique et en permettant au sujet de marcher à travers un tunnel sur une feuille de papier. La conception du tunnel d'essai tire parti du comportement naturel de la souris et de leur affinité pour les petits endroits sombres. La longueur de foulée, la largeur de foulée et la propagation des orteils de chaque souris sont facilement mesurées à l'aide d'une règle et d'un crayon. Il s'agit d'une méthode bien établie et fiable, et elle génère plusieurs mesures qui sont analogues aux systèmes numériques. Cette approche est suffisamment sensible pour détecter les changements de foulée au début de la présentation du phénotype, et en raison de son approche non invasive, elle permet d'tester des groupes à travers la durée de vie ou la présentation phénotypique.

Introduction

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La locomotion nécessite une coordination neurologique et musculo-squelettique complexe, et les déficits dans un seul aspect des voies motrices peuvent produire des anomalies observables de la démarche1,2. L'analyse de la démarche est un outil essentiel pour les chercheurs qui testent des modèles murins parce qu'elle fournit des données comportementales quantifiables sur la façon dont une maladie, une blessure ou un médicament donné affecte le mouvement d'un animal3. Cependant, l'analyse numérisée de la démarche nécessite l'achat d'un tapis roulant, d'une caméra et d'un logiciel connexe, ce qui peut être prohibitif pour les chercheurs. L'analyse de la démarche est souvent utilisée par intermittence pour suivre les changements longitudinals dans la fonction motrice, d'où il peut être difficile de justifier les dépenses si sporadiquement utilisé4. Bien que les analyses numérisées puissent fournir des mesures de démarche plus détaillées que la simple analyse de l'empreinte, ces mesures plus complexes ne sont pas toujours nécessaires ou pertinentes pour la caractérisation d'un phénotype comportemental5.

Ici, nous présentons une méthode d'analyse manuelle à faible coût de l'empreinte comme une alternative rapide et sensible aux programmes numérisés d'analyse de la démarche6,7. L'analyse manuelle d'empreinte a été démontrée pour détecter des différences significatives de démarche dans une multitude de modèles de maladie surine4,7,8,9,10,11 ,12,13,14,15,16,17, et dans au moins un cas, cette méthode à faible coût a identifié des changements dans la démarche qui n'ont pas été détectés par un programme d'analyse de la démarche numérisée commune12. Le coût total des matériaux est nominal, et il peut être facilement adapté à d'autres modèles de recherche sur les rongeurs.

Bien qu'il existe de nombreuses mesures de démarche différentes à partir desquelles les données peuvent être tirées, la méthode que nous décrivons se concentre sur trois mesures spécifiques: la longueur de foulée, la largeur de foulée (alias "largeur de piste"), et la propagation des orteils. Il est important de noter que les paramètres à évaluer doivent être déterminés selon le modèle. Cette méthode d'analyse de la démarche n'est pas conçue pour mesurer la fonction cognitive, et elle n'est pas recommandée pour les études qui nécessitent des mesures biomécaniques complexes de la démarche16.

Nous présentons des données comportementales d'une cohorte de souris pré- et post-symptomatiques modelant l'atrophie musculaire spinale et Bulbar X-liée (SBMA), une maladie neuromusculaire caractérisée par la dégénérescence de neurone moteur et l'atrophie de muscle. Ces souris développent des déficits progressifs dans la démarche qui coïncident avec le début d'autres phénotypes spécifiques à la maladie. Cela démontre la validité et la spécificité de cette méthode, et confirme qu'elle peut faire une distinction fiable entre les animaux touchés et les animaux non touchés.

Les souris expérimentales dans cette étude étaient 2.5 (pré-symptomatique) et 9 mois-vieux (post-symptomatique) souris transgéniques de BAC fxAR121 sur un fond c57BL/6 (nexpt'12). Ce modèle a été généré dans notre laboratoire et a été entièrement caractérisé comme un modèle de souris puissant de SBMA9. Les litières non transgéniques ont été utilisées comme témoins (nctrlno 8). SBMA est une maladie sex-limited qui se manifeste entièrement chez les mâles seulement, de sorte que les souris mâles ont été utilisés exclusivement pour cette étude. Au cours des étapes de planification, les chercheurs doivent tenir compte des considérations des National Institutes of Health relatives au sexe en tant que variable biologique pour déterminer la taille et la composition des groupes18.

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Protocole

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Tous les tests effectués sur des souris ont été examinés et approuvés par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université Duke. Le personnel responsable des tests et de la notation doit être aveuglé par le génotype des animaux ou l'état expérimental jusqu'à ce que l'analyse de la démarche et la notation des documents aient été effectuées pour l'ensemble de la cohorte.

1. Test de la préparation des matériaux

  1. Effectuez des essais avec un tunnel construit à partir de 3 panneaux acryliques clairs prédécoupés d'une épaisseur de 0,375 pouce. Assembler le tunnel en collant les panneaux avec un scellant qui lie spécifiquement l'acrylique et n'émettra pas d'odeurs lorsqu'il est séché.
    1. Pour les souris C57BL/6 standard, utilisez les mesures de tunnel suivantes : 2,5 po de large, 3 po de haut et 13 po de long. Les souris doivent être en mesure de marcher confortablement à travers le tunnel et de prendre suffisamment de mesures pour que la démarche puisse être mesurée.
  2. Construire la chambre d'objectif avec pré-coupé panneaux acryliques gris 0.375 pouces d'épaisseur, collé avec le même scellant comme utilisé sur le tunnel. Les mesures intérieures de la chambre sont de 4 po de large, 4 po de long et 3 po de hauteur. Associez l'ouverture de cette chambre à l'ouverture du tunnel (2,5 po de large x 3,0 po). Parce que les souris préfèrent naturellement les espaces obscurcis aux espaces bien éclairés, utilisez un matériau qui est opaque et de couleur foncée.
  3. Utilisez du papier pour suivre les étapes qui sont épaisses et lisses (le papier aquarelle fonctionne bien). Couper les bandes de papiers individuels pour qu'elles soient légèrement plus larges et plus longues que la largeur et la longueur du tunnel. Si vous utilisez les dimensions du tunnel décrites ici, coupez les papiers à 15 po de long par 3,5 po de large.
  4. Utilisez deux couleurs contrastées (p. ex., vert et violet) de peinture à base d'eau lavable non toxique. Attribuez une couleur pour les pattes postérieures, la seconde pour les membres antérieurs. Les souris lécheront la peinture restante de leurs pieds après essai, ainsi la peinture choisie doit être complètement non-toxique.
  5. Utilisez deux pinceaux ronds en barrique, un pour chaque couleur de peinture (0,5 cm de diamètre, pointe de brosse effilée/pointue).
  6. Sélectionnez une règle avec des marques jusqu'à millimètres, et un étrier avec des mesures jusqu'à 0,1 mm. Crayon est recommandé d'écrire sur les papiers de notation.
  7. Facultatif: Pour les animaux ayant une forte anxiété ou une faible motivation, fournir une incitation comportementale dans la chambre de but. Cela peut inclure de petites quantités de graines de tournesol stérilisées (placées dans la cage de la maison 2 jours avant l'essai pour permettre l'accouturation). Le jour de l'essai, placez les graines de tournesol à l'intérieur de la chambre d'objectif pour encourager les souris à marcher à travers sans s'arrêter.

2. Collecte de données

  1. Si les tests sont effectués dans une pièce séparée, acclimater les souris à la nouvelle pièce pendant 30 minutes, puis commencer les essais comportementaux. De plus, comme les souris sont naturellement nocturnes, assurez-vous que toutes les souris sont complètement éveillées et alertes pendant au moins 5 minutes avant l'essai.
  2. Préparer la configuration des tests en plaçant le tunnel sur le papier et en marquant le papier avec l'iD de la souris et la date d'essai. Placez la chambre de but au bout du tunnel, reliant les deux extrémités ouvertes. Ajouter les graines de tournesol au bout du tunnel (à l'intérieur de la chambre d'objectif) pour la motivation si nécessaire.
  3. Retirez la souris pour qu'elle soit testée de sa cage et saisissez-la fermement par ses éraflures, en veillant à saisir la queue pour stabiliser le mouvement de ses membres postérieurs.
  4. Peignez les pattes avant de sorte que tout le dessous de tous les orteils et le centre du pied sont entièrement recouverts de peinture. Répétez cette opération avec une couleur contrastante de peinture sur ses pattes postérieures. Essuyez toute peinture que la souris obtient sur d'autres parties de son corps avec un chiffon propre et humide pour prévenir les taches qui peuvent interférer avec la collecte de données.
    REMARQUE : La manipulation de la souris doit être effectuée par des chercheurs expérimentés afin de minimiser le stress chez les animaux.
  5. Placez la souris au début du tunnel et laissez-la marcher jusqu'à la chambre de but, puis récupérez la souris, essuyez doucement ses pieds avec un chiffon amorti et retournez-la dans sa cage d'origine.
  6. Laissez le papier avec des empreintes de pas sécher complètement avant de marquer. Essuyez la zone d'essai et le tunnel avec de l'éthanol ou une solution de nettoyage équivalente entre chaque animal.

3. Critères de notation

  1. Utilisez des étapes qui sont constamment espacées avec des empreintes claires et non tachées pour la notation. Figure 1B est un bon exemple d'une séquence d'empreinte qui peut être notée. Afin de générer suffisamment de données de notation, il doit y avoir au moins 2 étapes consécutives de chaque pied, mais 4-6 étapes par pied est recommandé. N'incluez pas les premières et dernières empreintes de pas sur le papier, car il est peu probable qu'elles représentent une démarche normale parce que la souris change sa vitesse de marche.
  2. Utilisez la longueur de foulée, la largeur de foulée et la propagation des orteils comme trois mesures différentes de la démarche qui peuvent être analysées à l'aide de cette méthode.
    REMARQUE : La longueur et la largeur de la foulée exigent des impressions séquentielles claires où la région de l'avant-pied est bien définie dans la peinture. La propagation des orteils ne nécessite pas d'impressions séquentielles pour la notation, seulement des impressions claires du premier et du dernier orteil sur un seul pied. Toutefois, si une empreinte donnée n'est pas incluse dans les mesures de la longueur ou de la largeur de la foulée, elle ne peut pas être notée pour la propagation des orteils. Les trois mesures sont évaluées en centimètres.
    1. Définir la longueur de la foulée comme la distance entre deux empreintes séquentielles créées par le même pied (c.-à-d. une foulée) (Figure 1A, 1B).
      1. À l'aide d'un crayon, tracez un cercle de 2 à 4 mm autour de la région avant-pied des deux empreintes de pas antérieurs (identifiées par la couleur indiquée ci-dessus) en une seule foulée et tracez une ligne entre elles à l'aide d'une règle.
      2. Enregistrez la distance entre deux tirages du milieu de chaque cercle (c.-à-d. le centre de chaque coussinet) comme Right-Fore 1 (RF1) ou Left-Fore 1 (LF1).
      3. Répétez pour toutes les étapes qui peuvent être notées (RF2, LF2, RF3, LF3 et ainsi de suite).
      4. Répétez l'opération pour les empreintes de pas arrière droite et gauche.
      5. Moyenne de toutes les distances de foulée enregistrées pour chaque membre. Pour l'analyse statistique, les membres individuels de la cohorte peuvent être mis en moyenne ensemble.
    2. Définir la largeur des foulées comme mesure de la distance entre les membres antérieurs gauche et droit ou les membres postérieurs (figure 1A, 1B).
      1. Pour évaluer cette distance, tracez et mesurez une ligne de la région encerclée de l'avant-pied d'un arrière-membre qui se croise perpendiculairement avec la ligne pour la longueur de foulée sur l'arrière-membre contralatéral.
      2. Répétez cette opération pour toutes les empreintes postérieures qui peuvent être notées, puis faites la moyenne des mesures. La méthode de calcul de la largeur des foulées est la même pour les pattes avant et arrière.
    3. Définir la propagation des orteils comme la distance entre le premier et le dernier orteil sur une empreinte avant ou arrière (figure1A, 1B).
      1. Utilisez des étriers pour mesurer la distance entre la pointe de l'impression du premier orteil et la pointe de l'impression du dernier orteil.
      2. Répétez l'opération pour toutes les empreintes postérieures qui peuvent être notées et la moyenne des mesures. La méthode de calcul de la propagation des orteils est la même pour les pattes avant et arrière.
  3. Si le papier ne peut pas être noté, laisser reposer l'animal pendant 10 minutes avant d'essayer à nouveau.

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Résultats

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Avec un nombre suffisant d'animaux, cette procédure est capable de détecter les différences de démarche entre les génotypes de souris, dans la même souche au fil du temps. La figure 1B montre des traces représentatives d'images d'empreintes recueillies dans notre laboratoire, à l'aide d'un modèle de souris d'atrophie musculaire spinale et boulbar (SBMA) liée à l'X, un trouble neurodégénératif affectant les neurones moteurs inférieurs et le muscle squelettique. Nous avons précédemment rapport...

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Discussion

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En utilisant la méthode d'analyse de démarche à faible coût décrite ci-dessus, nous montrons l'identification réussie de plusieurs paramètres du dysfonctionnement de démarche aux âges post-symptomatiques dans le modèle de souris de FXFX121 de BAC de SBMA. Les diminutions de la longueur de foulée sont compatibles avec les études antérieures de SBMA des modèles de souris et des patients humains9. Nous montrons également pour la première fois qu'il y a des différences significatives dans la propagati...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs tiennent à remercier A.M. pour son aide à l'identification des animaux. Ces travaux ont été soutenus par des subventions des National Institutes of Health des États-Unis (R01 7 RF1 AG057264 à A.R.L.S. et C.J.C. et R01 NS100023 à A.R.L.S) et de la Muscular Dystrophy Association (Basic Research Grant to A.R.L.S., Development Grant to C.J.C.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
L’étriern/an/adoit avoir des marquages jusqu’à 0,1 mm
Colle artisanaleE6000n/a
Peinture pour empreintes de pas (peinture à la détrempe)Artmindn/adoit être non toxique
Pinceaux à canon rond SymplySimmonsn/a0,5 cm de diamètre
Règlen/an/adoit avoir des marquages au millimètre
prèsPapier à marquer (blocs d’aquarelle)Cansonn/acoupé à la taille
Tunnel et chambre de butInterstate Plasticsn/acoupé à la taille

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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