Une nouvelle nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Méthode pour la mesure intracellulaire Ca2 avec Fura-2-Analog dans les cellules vivantes

Résumé

En raison du chevauchement spectral des longueurs d'onde d'excitation et d'émission des analogues NADH et fura-2, l'interférence du signal des deux produits chimiques dans les cellules vivantes est inévitable lors de la mesure quantitative de [Ca^2']. Ainsi, une nouvelle méthode de correction en ligne de l'interférence du signal NADH pour mesurer [Ca^2]a été développée.

Résumé

Pour mesurer [Ca^2'] quantitativement, les analogues fura-2, qui sont des fluoroprobes ratiométriques, sont fréquemment utilisés. Cependant, l'utilisation de colorant est intrinsèquement limitée dans les cellules vivantes en raison de l'interférence d'autofluorescence, principalement du dinucleotide d'adénine de nicotinamide (NADH). Plus précisément, il s'agit d'un obstacle majeur lors de la mesure de la mitochondriale [Ca^{2 ]}quantitativement en utilisant des analogues fura-2 parce que la majorité de NADH est dans les mitochondries. Si la concentration de colorant fluorescent est la même, une certaine intensité d'excitation devrait produire la même intensité d'émission. Par conséquent, le rapport d'intensité des émissions de deux longueurs d'onde d'excitation différentes devrait être constant. Sur la base de ce principe, une nouvelle méthode de correction en ligne de l'interférence de signal NADH pour mesurer [Ca^2]a été développée, et l'intensité réelle de signal de NADH et fura-2 peut être obtenue. En outre, une nouvelle équation à calculer [Ca^2]a été développée avec une excitation ou une excitation isosbestique à 400 nm. Avec cette méthode, les changements dans les mitochondries [Ca^2]pourraient être mesurés avec succès. En outre, avec un ensemble différent des longueurs d'onde d'excitation et d'émission, plusieurs paramètres, y compris NADH, [Ca^2],et le pH ou le potentiel de membrane mitochondriale_(M),pourraient être mesurés simultanément. Les mitochondries [Ca^2m]et_m ou pH ont été mesurées à l'aide de fura-2-FF et de téramethylrhodamine ester éthylin (TMRE) ou carboxy-seminaphtorhodafluor-1 (carboxy-SNARF-1).

Introduction

Le rôle significatif de ca^{2 intracellulaire} est largement connu¹. La quantification de [Ca^2'] est essentielle pour comprendre les processus des fonctions physiologiques cellulaires. Les analogues Fura-2 sont très utiles parce qu'ils sont excités dans la gamme UV (400 nm), et la méthode ratiométrique peut être appliquée pour la mesure quantitative. Par conséquent, d'autres paramètres physiologiques tels que le pH, le potentiel membranaire, etc., peuvent être mesurés avec d'autres colorants fluorescents. La concentration mitochondriale de Ca^{2 '([Ca} 2^']_m)aurait été de 0,08 à 20 m

Protocole

Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le comité local de soins et d'utilisation des animaux en établissement.

1. Préparation de la solution

1. Préparer des myocytes cardiaques isolés simples¹¹.
   REMARQUE : Chaque laboratoire peut avoir une solution de stockage cellulaire différente. Ici, les myocytes sont stockés dans le milieu de culture (DMEM).
2. Préparer 100 ml de ca²- solution gratuite (tableau 1).
3. Préparer 50 ml de milieu de culture dans un bécher de 50 ml. Aliquot 5 ml et le mettre dans un bain d'eau à 37 oC. Gardez la solution restante à ....

Résultats

Changements mitochondriaux Ca^2mD dus à la correction¹⁰
La figure 4 montre les changements dans [Ca^{2 '}_{] m} avant et après la correction. Les résultats ont clairement montré les changements substantiels dans [Ca^{2 '}_m. La concentration mitochondriale de calcium au repos sans cytosolique Ca^{2 '} ([Ca^{2 '}]_c) était de 1,03 à 0,13 M (moyenne , S.E., n ' 32), et le maximum [Ca^{2 '}]_m .......

Discussion

La méthode de correction des interférences a été développée avec succès pour mesurer les signaux des analogues NADH et fura-2. La mesure exacte des signaux est essentielle pour la correction exacte. Cependant, la nature inhérente de l'appareil fluorescent produit un signal de fond sans rapport avec celui de NADH de fura-2. Le filtre de bande-passe de la plus haute qualité ne peut passer que jusqu'à 10^{à 8} des longueurs d'onde indésirables de la lumière. Cependant, le signal fluorescent d'une seule cellule est t.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2 mL Tube eppendorf	Axygen	MCT-200-C	Tube de 2 mL
convertisseur AD/DA	Instrutech	ITC-18	Equipment
ADP, Adénosine 5&prime ;-diphosphate monopotassique salt dihydraté	Sigma-aldrich	A5285	Produits chimiques
Filtre passe-bande	Ealing Electro-Optics, Inc	35-3920	Équipement, 640± ; 11nm
Filtre passe-bande	Omega Optical	690-9823	Equipment, 590± ; 15nm
Filtre passe-bande	Omega Optical	500DF20-9916	Équipement, 500± ; 20nm
Band pass filter	Chroma Technology Corp.	60685	Équipement, 450± ; 30nm
Chlorure de calcium solution	Sigma-aldrich	21114	Chemicals
carboxy-SNARF-1(AM)	Invitrogen	C1272	Chemicals
Caméra CCD	Philips	FTM1800NH/HGI	Equipment
Dichroic mirror	Chroma Technology Corp.	86009	Equipement, Miroir dichroïque multibande, Réflexion : < 400 nm, 490&plus ; 10, 560&plus ; 10, transmission : 460± ; 15, 510± ; 20, >580nm
Dichroic mirror	Chroma Technology Corp.	567DCXRU	Équipement, réflexion : < 560nm, Transmission : > 580 nm
Dichroic mirror	Chroma Technology Corp.	480dclp	Équipement, Réflexion : < 470nm, Transmission : > 490 nm
Dichroic mirror	Chroma Technology Corp.	20728	Equipement, Miroir dichroïque multibande, Réflexion : < 405 nm, 470± ; 30, transmission : 430nm ~ 520nm, > 640 nm
sulfoxyde de diméthyle (DMSO)	Sigma-aldrich	154938	Chemicals
DMEM, Dulbecco' s Aigle modifié' s Moyen	Sigma-aldrich	D5030	Produits chimiques
EGTA, Acide égtazique, Acide éthylène-bis(oxyéthylènenitrilo)tétraacétique, Éther de glycol Acide diamine tétraacétique	Sigma-aldrich	E4378	Produits chimiques
FCCP, Mésoxalonitrile 4-trifluorométhoxyphénylhydrazone	Sigma-aldrich	21857	Produits chimiques
champ fort	Équipement		86506
Fura-2-FF(AM)	TEFLABS	137	produits chimiques
Tube vert	Tube à essai	DWM
HEPES,  ; Acide 4-(2-Hydroxyéthyl)Pipérazine-1-Éthanesulfonique, N-(2-Hydroxyéthyl)Pipérazine-N&prime ;-(Acide 2-éthanesulfonique))	Sigma-aldrich	H3375	Chemicals
Compteur haute vitesse	Instruments	NI-6022	Equipment
Hot mirror	Chroma Technology Corp.	21002	Équipement, 50:50
Microscope inversé	Nikon	TE-300	Equipment
Malate	Sigma-aldrich	27606	Chemicals
Near infrared filter	Chroma Technology Corp.	Équipement D750/100X	, 750± ;
Objectif à immersion dans l’huile 100 nm	Nikon	MRF01400	40x, NA 1,3 ; Equipement
Unité de comptage de photons	Hamamatsu	C3866	Equipement
Tube multiplicateur de photons	Hamamatsu	R2949	Equipement
Polychrome II	Till Photonics	SA3/MG04	Equipement
Chlorure de potassium	Merck	1.04936	Produits chimiques
Solution d’hydroxyde de potassium	Sigma-aldrich	P4494	Produits chimiques
Pyruvate	Sigma-aldrich	107360	Produits chimiques
Roténone	Sigma-aldrich	R8875	Produits chimiques
Saponine	Sigma-aldrich	S4521	Produits chimiques
TMRE, tétraméthylrhodamine, ester éthylique	sondes moléculaires	T669	Produits chimiques

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