En raison du chevauchement spectral des longueurs d'onde d'excitation et d'émission des analogues NADH et fura-2, l'interférence du signal des deux produits chimiques dans les cellules vivantes est inévitable lors de la mesure quantitative de [Ca2']. Ainsi, une nouvelle méthode de correction en ligne de l'interférence du signal NADH pour mesurer [Ca2]a été développée.
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Article de méthode
Une nouvelle nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Méthode pour la mesure intracellulaire Ca2 avec Fura-2-Analog dans les cellules vivantes
Dans cet article
Résumé
Résumé
Pour mesurer [Ca2'] quantitativement, les analogues fura-2, qui sont des fluoroprobes ratiométriques, sont fréquemment utilisés. Cependant, l'utilisation de colorant est intrinsèquement limitée dans les cellules vivantes en raison de l'interférence d'autofluorescence, principalement du dinucleotide d'adénine de nicotinamide (NADH). Plus précisément, il s'agit d'un obstacle majeur lors de la mesure de la mitochondriale [Ca2 ]quantitativement en utilisant des analogues fura-2 parce que la majorité de NADH est dans les mitochondries. Si la concentration de colorant fluorescent est la même, une certaine intensité d'excitation devrait produire la même intensité d'émission. Par conséquent, le rapport d'intensité des émissions de deux longueurs d'onde d'excitation différentes devrait être constant. Sur la base de ce principe, une nouvelle méthode de correction en ligne de l'interférence de signal NADH pour mesurer [Ca2]a été développée, et l'intensité réelle de signal de NADH et fura-2 peut être obtenue. En outre, une nouvelle équation à calculer [Ca2]a été développée avec une excitation ou une excitation isosbestique à 400 nm. Avec cette méthode, les changements dans les mitochondries [Ca2]pourraient être mesurés avec succès. En outre, avec un ensemble différent des longueurs d'onde d'excitation et d'émission, plusieurs paramètres, y compris NADH, [Ca2],et le pH ou le potentiel de membrane mitochondriale(M),pourraient être mesurés simultanément. Les mitochondries [Ca2m]etm ou pH ont été mesurées à l'aide de fura-2-FF et de téramethylrhodamine ester éthylin (TMRE) ou carboxy-seminaphtorhodafluor-1 (carboxy-SNARF-1).
Introduction
Le rôle significatif de ca2 intracellulaire est largement connu1. La quantification de [Ca2'] est essentielle pour comprendre les processus des fonctions physiologiques cellulaires. Les analogues Fura-2 sont très utiles parce qu'ils sont excités dans la gamme UV (400 nm), et la méthode ratiométrique peut être appliquée pour la mesure quantitative. Par conséquent, d'autres paramètres physiologiques tels que le pH, le potentiel membranaire, etc., peuvent être mesurés avec d'autres colorants fluorescents. La concentration mitochondriale de Ca2 '([Ca 2']m)aurait été de 0,08 à 20 m2,3,4,5. Parmi les analogues fura-2, fura-2-FF est approprié pour mesurer cette gamme de [Ca2]. Cependant, les cellules vivantes contiennent malheureusement NADH/NADPH pour leurs processus métaboliques, et NADH génère l'interférence de signal en raison du chevauchement des spectres d'excitation et d'émission avec l'analogique fura-2. Cette interférence limite considérablement l'utilisation des analogues fura-2. Plus précisément, si l'analogique est appliqué pour mesurer les mitochondries [Ca2],cette interférence est le plus grand obstacle parce que la plus grande quantité de NADH est dans les mitochondries. Ceci est encore compliqué par les changements NADH étant liés au potentiel de membrane mitochondriale(m) et le changement de'm affecte [Ca2 ']m6,7,8 , 9. En outre, pour étudier la dynamique [Ca2]m, il est essentiel de connaître l'état d'autres paramètres mitochondriaux, tels que nADH,m, et pH.
Les émissions à 450 nm et 500 nm avec des excitations à 353 nm, 361 nm, et 400 nm contiennent les signaux de NADH et fura-2-FF, et les équations sont les suivantes. Ici, 353 nm et 361 nm sont les points isosbestic de fura-2-FF pour les émissions à 450 nm et à 500 nm, respectivement.
F361 450 ' F361 450,NADH ' F361 450,Fura Equation 1
F353 500 ' F353 500,NADH ' F353 500,Fura Equation 2
F400 500 et F400 500,NADH et F400 500,Fura Equation 3
où Fx,y est l'intensité d'émission mesurée à y-nm par x-nm excitation, Fx,y,NADH représente l'intensité pure d'émission NADH-dépendante, et Fx,y,Fura représente l'intensité pure d'émission fura-2-FF-dépendante. Sous la même concentration du colorant fluorescent, une certaine intensité d'excitation devrait produire la même intensité d'émission. Par conséquent, le rapport d'intensité des émissions de deux longueurs d'onde d'excitation différentes devrait être constant. Ca2 et fura-2 n'ont pas affecté les caractéristiques de fluorescence du NADH; par conséquent, le rapport de l'émission à 450 nm et à 500 nm de NADH était constant à n'importe quelle longueur d'onde d'excitation. La même règle peut être utilisée pour le fura-2-FF en partant de l'hypothèse que le NADH ou [Ca2]n'affecte pas les spectres d'émission et d'excitation de fura-2-FF. Cependant, Ca2 a causé un changement spectral de l'émission de fura-2-FF. Par conséquent, pour supprimer l'effet de Ca2, excitation isosbestique, qui est indépendant de Ca2, doit être utilisé. Chaque longueur d'onde d'émission (c.-à-d., 450 nm et 500 nm) a un point isosbestic différent, et de notre configuration expérimentale, 353 nm à 500 nm et 361 nm à 450 nm ont été choisis. De ceux-ci, les équations suivantes sont valides10.
Rf f F361 450,Fura/F353 500,Fura Equation 4
RN1 - F400,500,NADH/F361 450,NADH Equation 5
RN2 - F353,500,NADH/F361 450,NADH Equation 6
Avec ces constantes, les équations suivantes de (Equation 1) (Equation 2) et (Equation 3) sont valides.
F361 450 ' F361 450,NADH ' Rf ' F353 500,Fura Equation 7
F353 450 ' RN2 'F361,450,NADH ' F353,500,Fura Equation 8
F400,500 ' RN1 'F361,450,NADH 'F400,500,Fura Equation 9
De ces équations, si Rf, RN1, et RN2 sont connus, des signaux purs de NADH et fura-2 peuvent être obtenus comme suit.
F361 450,NADH (F361 450 - Rf - F353 500)/(1 ' Rf ' RN2) Équation 10
F353 500,Fura (RN2 - F361 450 - F353 500)/(Rf ' RN2 ' 1) Équation 11
F400,500,Fura ' F400,500 ' RN1 ' F361,450,NADH Équation 12
RFura - F353 500,Fura/F400 500,Fura Equation 13
La forme Ca2-bound de fura-2-FF était pratiquement non-fluorescent à la longueur d'onde d'excitation de 400 nm. Sur la base de cette propriété, la nouvelle équation d'étalonnage suivante peut être dérivée.
[Ca2 '] ' Kd ' (F400,500,max/F353,500,max) '(RFura ' Rmin) Équation 14
où Kd est une constante de dissociation, F400,500,max et F353,500,max sont les valeurs maximales des signaux émis à 500 nm avec des excitations à 400 nm et 353 nm, respectivement, et Rmin est le minimum RFura en Ca2 --condition libre. Puisque les excitations isosbestic ont été utilisées, l'équation peut être simplifiée plus loin comme suit.
[Ca2 '] ' Kd ' (1 / Rmin) ' (RFura ' Rmin) Équation 15
Par conséquent, seules les valeurs Kd et Rmin sont nécessaires pour calculer [Ca2'].
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Protocole
Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le comité local de soins et d'utilisation des animaux en établissement.
1. Préparation de la solution
- Préparer des myocytes cardiaques isolés simples11.
REMARQUE : Chaque laboratoire peut avoir une solution de stockage cellulaire différente. Ici, les myocytes sont stockés dans le milieu de culture (DMEM). - Préparer 100 ml de ca2- solution gratuite (tableau 1).
- Préparer 50 ml de milieu de culture dans un bécher de 50 ml. Aliquot 5 ml et le mettre dans un bain d'eau à 37 oC. Gardez la solution restante à température ambiante.
- Préparer 50 ml de la solution de saponine en ajoutant 5 mg de saponine à 50 ml de solution sans Ca2.
REMARQUE : La saponine est utilisée pour perméabiliser les myocytes cardiaques, pour enlever les compartiments cytosoliques et pour visualiser la fluorescence mitochondriale seulement. - Préparer 16 l de 1 mM de fura-2-FF-AM dissous dans du sulfoxide de diméthyle (DMSO).
REMARQUE : Faire dissoudre la solution de stock de 1 mM de fura-2-FF-AM dissous dans le DMSO et l'aliquot 16 L dans un tube de 2 ml. Conservez-les à -20 oC jusqu'à utilisation. - Préparer 50 mL de solution sans NADH Ca2mD(tableau 1) et 50 mL de solution saturée Ca2mD sans NADH (tableau 1) lorsque les points isosbestic doivent être mesurés. Ajuster le pH à 7,0 avec KOH.
REMARQUE : Solution sans Ca2 MDsans NADH(tableau 1) contient 10 M FCCP et 100 M ADP sans substrat mitochondrial pour minimiser le NADH dans les mitochondries. - Préparer 50 ml de solution sans Ca2,50 ml de solution de malate, 50 ml de solution de pyruvate, 50 ml de solution de malate-pyruvate et 50 mL de solution rotenone à utiliser pour les mesures des facteurs de correction NADH (tableau 1).
2. Procédure de chargement de fluoroprobe dans les mitochondries
- Préparer la solution de chargement de teinture en ajoutant 2 ml du milieu de culture à 16 oL de 1 mm fura-2-FF-AM.
REMARQUE : Le colorant fluorescent est fragile sous la lumière. Préparer la solution juste avant l'utilisation. Gardez la solution contenant le colorant fluorescent dans un endroit sombre. La concentration finale de fura-2-FF-AM est de 8 M. Si carboxy-SNARF-1 a été utilisé, préparez la solution de chargement de colorant avec 2 M carboxy-SNARF-1-AM. - Prendre 2 ml des cellules isolées et placer dans un tube à essai de 5 ml en position verticale.
- Attendez 15 min pour que les myocytes s'enfoncent au fond et retirez le supernatant.
REMARQUE : Le supernatant peut contenir des débris cellulaires. Ne pas centrifuger le tube pour éviter les dommages cellulaires. - Ajouter 2 ml de la solution de chargement de teinture.
- Incuber la solution de teinture avec des cellules pendant 60 min à 4 oC.
- Ensuite, placez le tube à essai dans un bain d'eau de 37 oC pendant 30 min en position verticale.
- Retirer le supernatant et ajouter 4 ml du milieu de culture préchauffé de 37 oC. Incuber les cellules pendant 60 min dans un bain d'eau de 37 oC.
- Enfin, retirer le supernatant, ajouter 4 ml de culture moyenne à température ambiante et garder le tube à température ambiante.
3. Introduction du système de mesure multiparamétrique
REMARQUE : La figure 1 montre un diagramme de l'ensemble du système.
- Pour une source de lumière d'excitation, utilisez un monochromator rapide (polychrome II) qui peut changer la lumière en 3 ms.
- Utilisez une lentille d'immersion à l'huile (40x, NA 1.3) avec un microscope inversé pour augmenter l'intensité du signal.
- Utilisez un filtre proche infrarouge et une caméra couplée à la charge (CCD) pour surveiller le champ de l'objet sans interférence de signal fluorescent.
- Capturez l'image de champ d'objet pour obtenir la zone.
- Ajuster le champ d'objet dans l'écran de moniteur avec un diaphragme de champ juste pour montrer la cellule pour réduire l'arrière-plan.
- Utilisez quatre tubes photomultiplicateurs avec chaque filtre de passage de bande (450, 500, 590 et 640 nm) pour détecter les longueurs d'onde d'émission avec la méthode de comptage des photons. Utilisez les miroirs dichroiques appropriés pour diviser et rediriger la lumière d'émission.
REMARQUE : La lumière d'excitation est très forte comparée à la lumière d'émission. Ainsi, choisissez le filtre bande-passe avec les caractéristiques de blocage les plus élevées pour réduire l'arrière-plan. Un système de comptage de photons comprend une combinaison de PMT, d'unités de compteur de photons et d'un compteur à grande vitesse. Pour contrôler le système et échantillonner les données, un logiciel de conduite sur mesure a été utilisé. Il est nécessaire de trouver un moyen d'appliquer cette méthode avec d'autres systèmes.
4. Méthodes de correction NADH avec un système de mesure multiparamétrique
- Identification des points isosbestic de Fura-2-FF in situ.
REMARQUE : De nombreux rapports ont indiqué que les caractéristiques fluorescentes sont modifiées dans les cellules. Par conséquent, effectuer toutes les procédures pour obtenir les paramètres pour corriger l'interférence in situ.- Montez la cellule chargée de colorant sur le microscope et attendez 3 min pour couler les cellules au fond.
REMARQUE : Ajuster le nombre de cellules pour voir autour d'une cellule par champ objectif avec une lentille objective de 40x. - Perfuse la solution sans NADH Ca2 -freeà 37 oC.
- Après avoir ciblé la cellule, mesurez l'arrière-plan sans cellule et la zone cellulaire comme le montre la section 4.1. Calculer l'arrière-plan de la cellule à partir de la zone cellulaire.
REMARQUE : Les deux signaux d'arrière-plan doivent être corrigés dans chaque expérience. - Perfil la solution de saponine pour 60 s et revenir à la solution Sans NADH Ca2 libre.
- Mesurez les signaux émis par Fura-2-FF à 450 nm et 500 nm simultanément par le balayage d'excitation de 350 nm à 365 nm avec l'étape de 0,1 nm.
- Perfuse la solution Sans NADH Ca2-saturéet et répéter l'étape 4.2.5.
- Soustrayez les signaux dans la solution Ca2 'saturée des signaux dans les conditions Sans Ca2.
- Répétez les procédures de 4.2.2 à 4.2.7 avec d'autres myocytes cardiaques simples.
REMARQUE : Si l'intensité du signal s'affaiblit, répétez à partir de 4,2,1. Répétez la procédure pour, au moins, 5 cellules différentes. - À partir de tous les signaux obtenus, calculez les écarts types de l'émission à chaque excitation et choisissez la longueur d'onde de l'excitation indiquant la valeur minimale de l'écart standard (DD) comme point isosbestique.
REMARQUE : Les chiffres représentatifs figurent à la figure 2.
- Montez la cellule chargée de colorant sur le microscope et attendez 3 min pour couler les cellules au fond.
- La détection de signal d'arrière-plan et les méthodes de correction avec la zone cellulaire
REMARQUE: Il existe deux types d'arrière-plans. L'un vient des cellules et l'autre de la réflexion sur le bordereau de couverture (le fond sans cellules). Les deux arrière-plans doivent être corrigés dans chaque expérience.- Montez les cellules sans colorant dans le bain sur le microscope et attendez 3 min pour couler les cellules au fond. Perfuse NADH-free Ca2 -freesolution pendant environ 5 min.
REMARQUE : Tout le taux de perfusion de solution est de 2-3 mL/min à 37 oC.
REMARQUE : Ajuster le nombre de cellules pour voir autour d'une cellule par champ objectif avec une lentille objective de 40x. - Définir le champ d'objet pour couvrir la cellule ciblée.
- Après avoir déplacé la cellule hors du champ, mesurez les signaux d'arrière-plan de la fenêtre sans cellule et fixez-les sous forme de décalages.
REMARQUE : Le signal signifie que le signal lumineux doit être détecté dans le système de comptage des photons. - Remettez la cellule à la position initiale et mesurez les signaux de fond de la cellule et la zone cellulaire.
REMARQUE : Même si la lumière d'excitation est filtrée avec le filtre bandpass, elle contient toujours une assez grande quantité de la lumière filtrée. Cette lumière est dispersée lorsqu'on frappe les cellules et provoque un signal de fond considérable parce que le système de comptage des photons est très sensible. Il faut le corriger.
REMARQUE : La zone cellulaire peut être calculée à l'aide d'une image cellulaire capturée et d'un logiciel d'imagerie disponible. L'unité de la zone cellulaire peut être n'importe quelle unité, y compris le nombre de pixels. Une simple normalisation est nécessaire. - Répétez l'opération de 4.1.1 à 4.1.4 pendant 10 fois pour obtenir la relation entre la zone cellulaire et les signaux de fond cellulaire.
REMARQUE : Plus tard, les signaux de fond cellulaire peuvent être calculés à partir de la zone cellulaire de la relation. Depuis l'ampoule d'excitation deviennent le vieillissement, cette procédure doit être répétée, au moins, chaque mois.
- Montez les cellules sans colorant dans le bain sur le microscope et attendez 3 min pour couler les cellules au fond. Perfuse NADH-free Ca2 -freesolution pendant environ 5 min.
- Mesure des facteurs R
- Calculer Rf avec l'équation 4 à partir des signaux obtenus à la section 4.2.
- Montez les cellules sans colorant sur le microscope et perflez la solution sans Ca2.
- Mesurer les signaux tels que F361, 450, NADH, F400, 500, NADH, F361, 450, NADH, et F353, 500, NADH.
- Perfil la solution de malate et répéter 4.3.3. et mesurer les signaux.
- Perfil la solution pyruvate et répéter 4.3.3. et mesurer les signaux.
- Perfiez la solution malate-pyruvate et répétez 4.3.3. et mesurer les signaux.
- Perfssez la solution rotenone et répétez 4.3.3. et mesurer les signaux.
REMARQUE : L'exemple du signal NADH enregistré sur 5 mM de pyruvate, 5 mM de malate plus 5 mM de pyruvate et d'ajout de rotenone de 10 M m est illustré à la figure 3. - Calculer chaque pente de F361, 450, NADH vs F400, 500, NADH et F361, 450, NADH vs F353, 500, NADH. Comme le montre la figure 3. Chaque pente indique RN1 et RN2.
5. Sélection de l'excitation et de la lumière d'émission pour TMRE ou carboxy-SNARF-1
- Si TMRE pour mesurer le potentiel mitochondrial a été utilisé en plus, utilisez la longueur d'onde d'excitation de 530 nm et la longueur d'onde d'émission de 590 nm.
- Si carboxy-SNARF-1 pour mesurer le potentiel mitochondrial a été utilisé en plus, utilisez la longueur d'onde d'excitation de 540 nm et les longueurs d'onde d'émission de 590 nm et 640 nm12.
6. Sélection de kd valeur de fura-2-FF
- Le changement de pH peut affecter les valeurs Kd pour la liaison Ca2sur fura-2-FF10. Utilisez la valeur Kd de 5,28 au pH 7,5 pour les mitochondries.
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Résultats
Changements mitochondriaux Ca2mD dus à la correction10
La figure 4 montre les changements dans [Ca2 '] m avant et après la correction. Les résultats ont clairement montré les changements substantiels dans [Ca2 'm. La concentration mitochondriale de calcium au repos sans cytosolique Ca2 ' ([Ca2 ']c) était de 1,03 à 0,13 M (moyenne , S.E., n ' 32), et le maximum [Ca2 ']m ...
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Discussion
La méthode de correction des interférences a été développée avec succès pour mesurer les signaux des analogues NADH et fura-2. La mesure exacte des signaux est essentielle pour la correction exacte. Cependant, la nature inhérente de l'appareil fluorescent produit un signal de fond sans rapport avec celui de NADH de fura-2. Le filtre de bande-passe de la plus haute qualité ne peut passer que jusqu'à 10à 8 des longueurs d'onde indésirables de la lumière. Cependant, le signal fluorescent d'une seule cellule est t...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été partiellement soutenu par le Programme de recherche en sciences fondamentales par l'intermédiaire de la National Research Foundation of Korea (NRF) financé par le Ministère de l'éducation (2018R1A6A3A01011832), par le Ministère des sciences, des TIC et de la Planification de l'avenir (NRF-2016M3C1A6936606) et par le Ministère du commerce, de l'industrie et de l'énergie (10068076).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 2 mL Tube eppendorf | Axygen | MCT-200-C | Tube de 2 mL |
| convertisseur AD/DA | Instrutech | ITC-18 | Equipment |
| ADP, Adénosine 5&prime ;-diphosphate monopotassique salt dihydraté | Sigma-aldrich | A5285 | Produits chimiques |
| Filtre passe-bande | Ealing Electro-Optics, Inc | 35-3920 | Équipement, 640± ; 11nm |
| Filtre passe-bande | Omega Optical | 690-9823 | Equipment, 590± ; 15nm |
| Filtre passe-bande | Omega Optical | 500DF20-9916 | Équipement, 500± ; 20nm |
| Band pass filter | Chroma Technology Corp. | 60685 | Équipement, 450± ; 30nm |
| Chlorure de calcium solution | Sigma-aldrich | 21114 | Chemicals |
| carboxy-SNARF-1(AM) | Invitrogen | C1272 | Chemicals |
| Caméra CCD | Philips | FTM1800NH/HGI | Equipment |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 86009 | Equipement, Miroir dichroïque multibande, Réflexion : < 400 nm, 490&plus ; 10, 560&plus ; 10, transmission : 460± ; 15, 510± ; 20, >580nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 567DCXRU | Équipement, réflexion : < 560nm, Transmission : > 580 nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 480dclp | Équipement, Réflexion : < 470nm, Transmission : > 490 nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 20728 | Equipement, Miroir dichroïque multibande, Réflexion : < 405 nm, 470± ; 30, transmission : 430nm ~ 520nm, > 640 nm |
| sulfoxyde de diméthyle (DMSO) | Sigma-aldrich | 154938 | Chemicals |
| DMEM, Dulbecco' s Aigle modifié' s Moyen | Sigma-aldrich | D5030 | Produits chimiques |
| EGTA, Acide égtazique, Acide éthylène-bis(oxyéthylènenitrilo)tétraacétique, Éther de glycol Acide diamine tétraacétique | Sigma-aldrich | E4378 | Produits chimiques |
| FCCP, Mésoxalonitrile 4-trifluorométhoxyphénylhydrazone | Sigma-aldrich | 21857 | Produits chimiques |
| champ fort | Équipement | 86506 | |
| Fura-2-FF(AM) | TEFLABS | 137 | produits chimiques |
| Tube vert | Tube à essai | DWM | |
| HEPES, ; Acide 4-(2-Hydroxyéthyl)Pipérazine-1-Éthanesulfonique, N-(2-Hydroxyéthyl)Pipérazine-N&prime ;-(Acide 2-éthanesulfonique)) | Sigma-aldrich | H3375 | Chemicals |
| Compteur haute vitesse | Instruments | NI-6022 | Equipment |
| Hot mirror | Chroma Technology Corp. | 21002 | Équipement, 50:50 |
| Microscope inversé | Nikon | TE-300 | Equipment |
| Malate | Sigma-aldrich | 27606 | Chemicals |
| Near infrared filter | Chroma Technology Corp. | Équipement D750/100X | , 750± ; |
| Objectif à immersion dans l’huile 100 nm | Nikon | MRF01400 | 40x, NA 1,3 ; Equipement |
| Unité de comptage de photons | Hamamatsu | C3866 | Equipement |
| Tube multiplicateur de photons | Hamamatsu | R2949 | Equipement |
| Polychrome II | Till Photonics | SA3/MG04 | Equipement |
| Chlorure de potassium | Merck | 1.04936 | Produits chimiques |
| Solution d’hydroxyde de potassium | Sigma-aldrich | P4494 | Produits chimiques |
| Pyruvate | Sigma-aldrich | 107360 | Produits chimiques |
| Roténone | Sigma-aldrich | R8875 | Produits chimiques |
| Saponine | Sigma-aldrich | S4521 | Produits chimiques |
| TMRE, tétraméthylrhodamine, ester éthylique | sondes moléculaires | T669 | Produits chimiques |
Références
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Réimpressions et autorisations
