Method Article

Interactions avec et perméabilisation des membranes des mitochondries cérébrales par amyloïde Fibrils

DOI:

10.3791/59883

⸱

September 28th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Institute for Advanced Studies in Basic Sciences (IASBS), Zanjan, 45137-66731, Iran

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fourni ici est un protocole pour étudier les interactions entre la forme indigène, préfibrillaire, et les fibrilles amyloïdes matures de différents peptides et protéines avec des mitochondries isolées de différents tissus et diverses zones du cerveau.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un corps croissant de preuves indique que la perméabilisation de membrane, y compris les membranes internes telles que des mitochondries, est une caractéristique commune et le mécanisme primaire de la toxicité amyloïde d'agrégat-induite dans les maladies neurodegenerative. Cependant, la plupart des rapports décrivant les mécanismes de la perturbation de membrane sont basés sur des systèmes de modèle de phospholipid, et les études ciblant directement des événements se produisant au niveau des membranes biologiques sont rares. Décrit ici est un modèle pour étudier les mécanismes de la toxicité amyloïde au niveau de la membrane. Pour l'isolement mitochondrial, le milieu de gradient de densité est utilisé pour obtenir des préparations avec une contamination minimale de la myéline. Après confirmation d'intégrité de membrane mitochondriale, l'interaction des fibrilles amyloïdes résultant de la synuclein, de l'insuline bovine, et du lysozyme blanc d'oeuf de poule (HEWL) avec des mitochondries de cerveau de rat, comme modèle biologique in vitro, est étudiée. Les résultats démontrent que le traitement des mitochondries cérébrales avec des assemblages fibrillaires peut causer différents degrés de perméabilisation de la membrane et l'amélioration de la teneur en ROS. Ceci indique des interactions structure-dépendantes entre les fibrilles amyloïdes et la membrane mitochondriale. On lui suggère que les propriétés biophysiques des fibrilles amyloïdes et leur liaison spécifique aux membranes mitochondriales puissent fournir des explications pour certaines de ces observations.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les troubles amyloïdes, connus sous le nom d'amyloïdes, constituent un grand groupe de maladies définies par l'apparition de dépôts insolubles de protéines dans différents tissus et organes1,2. Parmi eux, les troubles neurodégénératifs sont les formes les plus fréquentes dans lesquelles les agrégats protéiques apparaissent dans le système nerveux central ou périphérique2. Bien qu'un certain nombre de mécanismes aient été proposés pour être impliqués dans la toxicité des agrégats amyloïdes3, un corps croissant de preuves indique la perturbation et la perméabilisation de membrane cellulaire comme mécanisme primaire de la pathologie amyloïde4, 5. En plus de la membrane plasmatique, les organites internes (c.-à-d. les mitochondries) peuvent également être affectés.

Fait intéressant, les preuves émergentes suggèrent que le dysfonctionnement mitochondrial joue un rôle critique dans la pathogénie des désordres neurodegenerative, y compris la maladie d'Alzheimer et la maladie de Parkinson6,7. Conformément à ce numéro, de nombreux rapports ont indiqué la liaison et l'accumulation de l'amyloïde- peptide, de la synucléine, de la huntingtine et des protéines SOD1 mutantes liées à la SLA aux mitochondries8,9,10, 11. On pense que le mécanisme de perméabilisation de la membrane par les agrégats amyloïdes se produit soit par la formation de canaux discrets (pores) et/ou par un mécanisme non spécifique de détergent-like5,12, 13. Il est à noter que la plupart de ces conclusions ont été basées sur des rapports impliquant des systèmes modèles phospholipides, et les études ciblant directement les événements se produisant dans les membranes biologiques sont rares. De toute évidence, ces bicouches lipidiques artificielles ne reflètent pas nécessairement les propriétés intrinsèques des membranes biologiques, y compris celles des mitochondries, qui sont des structures hétérogènes et composées d'une grande variété de phospholipides et de protéines.

Dans la présente étude, les mitochondries isolées du cerveau des rats sont utilisées comme modèle biologique in vitro pour examiner les effets destructeurs des fibrilles amyloïdes résultant de la synucléine (en tant que protéine amyloïdogénique), de l'insuline bovine (comme modèle de peptide montrant homologie structurale significative avec l'insuline humaine impliquée dans l'amyloidosis injection-localisée), et lysozyme blanc d'oeuf de poule (HEWL ; comme protéine modèle commune pour l'étude de l'agrégation amyloïde). Les interactions et les dommages possibles des membranes mitochondriales induites par les fibrilles amyloïdes sont alors étudiés en observant la libération de la déshydrogénase mitochondriale (MDH) (située dans la matrice mitochondriale) et de l'oxygène réactif des mitochondries l'amélioration des espèces (ROS).

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément au Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) des sciences médicales de l'Université de Téhéran. Des efforts maximaux ont été faits pour minimiser la souffrance et les effets néfastes pour les rats en aiguisant les lames de guillotine et en appliquant des mouvements résolus et rapides de la lame.

1. Homogénéisation du cerveau et isolement mitochondrial

REMARQUE: Tous les réactifs pour l'isolement mitochondrial ont été préparés selon Sims et Anderson14.

  1. Préparation de tampons pour l'isolement mitochondrial
    1. Préparer une solution Tris-HCl de 100 mM : peser 0,605 g de Tris-HCl et la dissoudre dans environ 40 ml d'eau déionisée (DW) dans un bécher. Transférer la solution sur un flacon volumétrique de 50 ml et augmenter le volume final à 50 ml en ajoutant DW.
    2. Préparer une solution EDTA de 10 mM : peser 0,202 g d'EDTA et la dissoudre dans environ 40 mL de DW dans un bécher. Transférer la solution sur un flacon volumétrique de 50 ml et augmenter le volume final à 50 ml en ajoutant DW.
      REMARQUE : Les deux solutions peuvent être stockées à 4 oC pendant au moins 4 semaines.
    3. Préparer une solution de bouillon Tris-HCl/EDTA/sucrose : ajouter 30 ml de 100 mL de Tris-HCl et 30 ml de 10 mM EDTA dans un bécher. Peser 32,86 g de saccharose et l'ajouter au bécher en remuant avec un agitateur magnétique. Lorsque le saccharose est dissous, transférer la solution sur un flacon volumétrique de 100 ml et augmenter le volume final à 100 ml en ajoutant DW.
      REMARQUE : Cette solution peut être entremise à 4 oC jusqu'à 3 jours.
    4. Préparer un tampon d'isolement (IB) : ajouter 100 ml de bouillon de Tris-HCl/EDTA/sucrose à environ 150 ml de DW. Ajustez le pH à 7,4 en ajoutant 0,1 M HCl. Augmentez le volume final à 300 ml en ajoutant DW.
    5. Préparer 15 % (v/v) milieu de gradient de densité avec IB en ajoutant 1,5 ml de gradient de densité moyen à 8,5 ml d'IB froid.
    6. Préparer 10 mg/mL d'albumine bovine (BSA) solution: peser 20 mg de BSA sans acide gras et le dissoudre dans environ 1,5 mL DW dans un flacon de 2 ml. Augmenter le volume final à 2 ml en ajoutant DW et le stocker sur la glace jusqu'à l'utilisation.
      REMARQUE : Préparez fraîchement les solutions à partir des étapes 1.1.4-1.1.6 le jour de l'isolement mitochondrial et entreposez-les sur la glace jusqu'à leur utilisation.
  2. Isolement du cerveau de rat
    REMARQUE : La décapitation et l'ablation du cerveau des rats mâles (150 à 200 g) ont été effectuées selon Sims et Anderson14.
    1. Mettre un bécher de 30 ml dans un seau à glace et ajouter 10 ml d'IB froid au bécher.
    2. Décapiter le rat avec une guillotine petite animal et enlever le cerveau du crâne dans un délai de 1 min de décapitation pour limiter la détérioration des propriétés mitochondriales.
    3. Transférez rapidement le cerveau au bécher contenant de l'IB froid.
  3. Homogénéisation et préparation du cerveau des mitochondries
    REMARQUE: Les fractions mitochondriales ont été isolées selon le protocole décrit par Sims et Anderson14, avec quelques modifications comme décrit précédemment15. Il est important de travailler rapidement et de garder tout sur la glace tout au long de la procédure.
    1. Laver le tissu 2x avec 30 ml d'IB, transférer dans un bécher contenant de l'IB froid, et hacher finement le cerveau avec des ciseaux.
    2. Ajouter 10 volumes d'IB pré-réfrigéré (environ 10 ml d'IB par cerveau de rat).
    3. Transférer la suspension tissulaire dans un homogénéisateur Dounce froid de 20 ml.
    4. Homogénéiser les morceaux de tissu à l'aide de neuf coups de haut en bas avec un pilon motorisé.
      REMARQUE : Laissez le mélange sur la glace pendant environ 30 s après chaque ensemble de trois coups d'homogénéisation pour s'assurer que l'homogénéité reste froide.
    5. Transférer l'homogénéisation dans un tube de centrifugeuse préréfrigéré de 10 ml et une centrifugeuse à 1 300 x g et 4 oC pendant 3 min.
    6. Décanter soigneusement le supernatant et le transférer dans un tube de centrifugeuse préréfrigéré de 10 ml et une centrifugeuse à 21 000 x g à 4 oC pendant 10 min.
    7. Jeter le supernatant et resuspendre la pastille dans une solution froide de 15% de gradient de densité moyenne (5 ml pour chaque cerveau) en remuant doucement le mélange avec une pipette.
    8. Centrifugeuse dans un rotor à angle fixe à 30 700x g à 4 oC pendant 5 min à l'aide d'une accélération lente (45 s de 0 tr/min à 500 tr/min suivie d'une accélération normale) et de décélération (pas de freins). Cela devrait produire deux bandes distinctes de matériel(figure 1A, à gauche).
    9. À l'aide d'une pipette Pasteur, retirez la bande pointue de matière accumulée en haut du gradient, qui contient principalement de la myéline. Ensuite, retirez la solution moyenne de gradient de densité qui recense le matériau (dans la bande 2) autant que possible sans perdre la fraction mitochondriale enrichie de la bande 2.
      REMARQUE : La bande 2 contient à la fois les mitochondries synaptiques et non synaptiques.
    10. Ajouter 8 ml d'IB à la fraction mitochondriale tout en remuant doucement le mélange avec une pipette.
    11. Centrifugeuse à 16 700x g à 4 oC pendant 10 min et retirez soigneusement le supernatant, en laissant le fond de granulés lâches intacts.
    12. Ajouter 1 ml de 10 mg/mL de BSA sans acide gras au tube de centrifugeuse tout en remuant doucement le mélange avec la pointe d'une pipette. Augmenter le volume final à 5 ml par cerveau en ajoutant IB.
    13. Centrifugeuse à 6 900x g à 4 oC pendant 10 min, ce qui devrait produire une granule ferme(figure 1A, à droite).
    14. Décant le supernatant et resuspend doucement le granule mitochondrial dans L'IB, les aliquot dans des tubes de 0,5 ml, et stocker dans l'azote liquide jusqu'à l'utilisation.

2. Détermination de la concentration en protéines

REMARQUE : La concentration en protéines est mesurée à l'aide de la méthode Lowry et coll.16.

  1. Préparation de solutions pour l'essai Lowry
    1. Préparer la solution A : peser 0,4 g de NaOH et 2 g de Na2CO3 et dissoudre en 80 ml de DW, puis transférer la solution sur un flacon volumétrique de 100 ml et augmenter le volume à 100 ml en ajoutant DuW.
    2. Préparer la solution B : peser 0,1 g de tartrate de sodium de potassium et 0,05 g de CuSO4 et dissoudre en 8 ml de DW, puis transférer la solution sur un flacon volumétrique de 10 ml et augmenter le volume à 10 ml en ajoutant DuW.
      REMARQUE : Les deux solutions A et B peuvent rester stables à 4 oC jusqu'à 6 mois.
    3. Préparer la solution C : Ajouter 0,5 ml de solution de feuillin à 7,5 ml de DW.
      REMARQUE : Préparer la solution C fraîche et garder à l'écart de la lumière jusqu'à l'utilisation.
    4. Préparer les normes BSA avec des concentrations finales de 0, 20, 40, 60, 80, 100 et 120 g/mL en combinant 0, 20, 40, 60, 80, 100 et 120 oL de 1 mg/mL de BSA, respectivement, avec assez de DW pour faire 1000 l de solution.
  2. Mesure de la concentration en protéines
    REMARQUE : Pour une plus grande précision, exécutez cette étape en tripler.
    1. Ajouter 50 L de solutions standard et d'homogénéiser mitochondrial à chaque puits d'une plaque de puits de 96, suivi de l'ajout de 45 l de la solution A. Ensuite, incuber l'assiette pendant 10 min dans un bain d'eau chaude fixé à 50 oC.
    2. Ajouter 5 ll de la solution B et couver la plaque pendant 10 min dans l'obscurité à température ambiante (RT).
    3. Ajouter 150 l de solution C et incuber la plaque pendant 10 min dans un bain d'eau chaude fixé à 50 oC.
    4. Chargez la plaque dans un lecteur de plaque et enregistrez les valeurs d'absorption pour les normes et la suspension mitochondriale à 650 nm. Ensuite, à l'aide d'une courbe d'étalonnage, calculer la teneur en protéines des mitochondries.

3. Détermination de l'intégrité de la membrane mitochondriale

REMARQUE : L'intégrité mitochondriale de membrane est confirmée en mesurant l'activité de déshydrogénase de malate (MDH) dans les mitochondries isolées avant et après la perturbation de membrane par Triton X-100.

  1. Diluer l'homogénéisation mitochondriale à 1 mg/mL avec l'IB froid et placé dans deux tubes de 1,5 ml (généralement 195 l de mitochondries par tube).
  2. Ajouter 5 'L de 20% (v/v) Triton X-100 (dilué avec DW) à un tube (comme un contrôle positif pour l'activité enzymatique maximale) et 5 'L de DW à un autre tube (pour le contrôle) suivi d'un mélange avec un agitateur.
  3. Incuber les tubes pendant 10 min dans un bain d'eau chaude fixé à 30 oC.
  4. Pellet mitochondries par centrifugation des tubes dans un rotor à angle fixe à 16 000 x g et 4 oC pendant 15 min.
  5. Recueillir soigneusement les supernatants résultants pour l'analyse de l'activité de MDH mitochondrial en utilisant un essai spectrophotométrique standard décrit dans la section suivante.
  6. Calculez l'intégrité de la membrane mitochondriale comme suit :
    figure-protocol-1

4. Détermination de l'activité MDH

REMARQUE : L'activité de MDH a été mesurée spectrophotométriquement comme décrit par Sottocasa et autres17.

  1. Préparation de solutions pour l'essai d'activité MDH
    1. Préparer une solution Tris-HCl de 50 mM (pH à 7,5) : préparer une solution de 7,9 mg/mL en DW à l'aide de Tris-HCl, et ajuster le pH à 7,5 à 25 oC avec 1,0 M NaOH.
    2. Préparer une solution d'oxaloacée de 50 mM : préparer une solution de 6,6 mg/mL à l'aide d'oxaloacée dans Tris-HCl.
      REMARQUE : Cette solution n'est pas stable une fois en solution et doit être préparée immédiatement avant l'utilisation.
    3. Préparez une solution de 10 mM-NADH : préparez une solution de 7,81 mg/mL à l'aide de l'InSA-NADH dans Tris-HCl.
  2. Détermination de l'activité MDH
    REMARQUE : Les concentrations finales d'assay dans un mélange de réaction de 1,0 ml sont de 50 mM Tris-HCl, 5 mM d'oxaloacetate et 0,1 mM de NADH.
    1. Définir le spectrophotomètre à 25 oC et 340 nm. Pipette 890 'L Tris-HCl tampon, 100 'L de solution d'oxaloacetate, et 10 'L de solution NADH à une cuvette vierge et 880 'L Tris-HCl tampon, 100 'L de solution d'oxaloacetate, et 10 'L de solution NADH dans un échantillon cuvette.
    2. Incuber les cuvettes dans le spectrophotomètre pendant 3 à 4 min et la référence contre le blanc.
    3. Ensuite, ajoutez 10 L d'homogénéité mitochondriale (1 mg/mL) à la cuvette de l'échantillon, mélangez immédiatement par inversion, et enregistrez des diminutions d'absorption dues à l'oxydation NADH à 340 nm pendant 1 min.

5. Formation in vitro de synucléine, d'insuline bovine et de fibril HEWL

  1. Préparation des protéines
    1. -synuclein:
      REMARQUE : L'expression et la purification de la recombinante -synuclein est exécutée comme décrit par Hoyer et autres18 avec quelques modifications, et la pureté de la synucleine est confirmée par SDS-PAGE.
      1. Dialyze purifiée -synuclein pendant la nuit contre la saline tamponnée de phosphate (PBS).
      2. Déterminer la concentration en protéines à l'aide d'un coefficient d'extinction de 5600 M-1 cm-1 à 275 nm19.
      3. Aliquots protéines dans des tubes de 1,5 ml et stocker à -80 oC jusqu'à l'utilisation.
    2. Insuline bovine et HEWL :
      1. Fournir à la fois de l'insuline bovine et de la HEWL.
      2. Dissoudre chaque protéine dans un tampon de glycine de 50 mM (pH à 1,6; ajuster le pH avec HCl).
      3. Déterminer la concentration d'insuline bovine et de HEWL à l'aide d'un coefficient d'extinction de 1,0 et 2,63 pour 1,0 mg/mL à 276 nm et 280 nm, respectivement20,21.
  2. Induction de fibrillation amyloïde
    1. Préparation de solutions pour la fibrillation amyloïde :
      1. Préparer le tampon thioflavine T (ThT) : pesez 0,3 g de NaH2PO4 et dissoutez-le en 80 ml de DW, ajustez le pH à 6,5 et augmentez le volume à 100 ml en ajoutant DW.
      2. Préparer la solution de bouillon ThT (5 mM) : peser 1,6 mg de ThT et le dissoudre dans 1 ml de tampon ThT, passer à travers un papier filtre de 0,22 m et se tenir à l'écart de la lumière à 4 oC jusqu'à l'utilisation.
        REMARQUE : Cette solution peut être entremise à 4 oC jusqu'à 4 semaines.
      3. Préparer la solution ThT (1 mM) : ajouter 200 l de solution de stock ThT (5 mM) à 800 oL de tampon ThT.
        REMARQUE : Cette solution peut être stockée à 4 oC jusqu'à 1 semaine.
    2. Formation fibril amyloïde in vitro de synucléine :
      1. Ajouter des aliquots (294 l) de solution protéinée (200 M) et 6 l de la solution ThT (1 mM) à 1,5 ml de tubes suivis d'une agitation.
      2. Incuber les tubes dans un thermomélangeur à 37 oC sous un mouvement constant à 800 tr/min pendant 4 jours.
      3. Prenez des aliquots (10 l) d'échantillons incubés après intervalles de temps réguliers et ajoutez 490 l de tampon ThT, mélangés à fond, et incubés pendant 5 min à RT.
      4. Fixez les largeurs d'excitation et d'émission de 5 nm et 10 nm, respectivement, et mesurez la fluorescence thT par excitation à 440 nm et émettant à 485 nm à l'aide d'un spectrophotomètre de fluorescence.
    3. Formation in vitro d'amyloïde d'insuline bovine amyloïde :
      1. Ajouter 637 l de solution protéinée (250 m) à 1,5 ml tube. Ensuite, ajouter 13 l de la solution ThT (1 mm) puis en remuant.
      2. Ajouter des aliquots (200 l) de solution protéinée (250 M) contenant 20 M ThT à chaque puits d'une plaque de puits à fond clair de 96 et sceller la plaque avec du ruban adhésif cristallin.
      3. Chargez la plaque dans un lecteur de plaque de fluorescence et incubez à 57 oC sans agitation.
      4. Mesurer la fluorescence thT à intervalles de 30 min, avec une excitation à 440 nm et une émission à 485 nm, pendant 12 h.
        REMARQUE : Secouez la plaque pendant 5 s avant chaque mesure.
    4. Formation fibrile amyloïde HEWL in vitro :
      1. Ajouter des aliquots (200 l) de solution protéinée )1 mM) contenant 20 M thT à chaque puits d'une plaque de puits à fond clair de 96 et sceller la plaque avec du ruban adhésif cristallin.
      2. Chargez la plaque dans un lecteur de plaque de fluorescence et incubez à 57 oC sans agitation.
      3. Mesurer la fluorescence thT à 2 h d'intervalle, avec une excitation à 440 nm et une émission de 485 nm, pendant 4 jours.
        REMARQUE : Pour les trois protéines, la formation de fibril amyloïde est confirmée par microscopie par force atomique (figure 2B).

6. Traitement des mitochondries avec des fibrilles amyloïdes, test de libération de MDH, et mesure de ROS

  1. Incubation de mitochondries isolées avec des fibrilles amyloïdes
    1. Allumer la centrifugeuse et le bain d'eau chaude et les mettre à 4 oC et 30 oC, respectivement.
    2. À l'aide de SI, diluer l'homogénéisation mitochondriale jusqu'à une concentration finale de 1 mg/mL.
    3. Préparer deux séries de tubes de 1,5 ml contenant des homogénéates mitochondriaux (une série pour l'analyse de libération de MDH et une autre pour la mesure mitochondriale de ROS).
    4. Ajouter des aliquots de fibrilles fraîches ou amyloïdes de 'synuclein, d'insuline bovine ou de HEWL (aux concentrations finales de 5 M, 10 M, 20 et 25 'M; utiliser pbS ou tampon glycine comme un contrôle) à l'homogénéité mitochondriale (volume final de 200 l) (voir tableau 1, tableau 2 , et tableau 3) suivi d'une brassage en douceur de la solution à l'aube d'une pipette.
      REMARQUE : Pour l'essai de libération de MDH, utilisez Triton X-100 (à une concentration finale de 0,5 % [v/v]) comme un contrôle positif pour la libération maximale d'enzymes.
    5. Incuber les tubes contenant des suspensions mitochondriales pendant 30 min dans un bain d'eau chaude réglé à 30 oC.
    6. Mesurer la libération mitochondriale de MDH et la teneur en ROS telles qu'indiquées dans les sections 6.2 et 6.3.
  2. Test de libération de MDH mitochondrial
    1. Centrifugeles les homogénéités mitochondriales incubées à 16 000 x g pendant 15 min, puis recueillez soigneusement les supernatants résultants pour l'analyse de l'activité de MDH mitochondrial tel que décrit dans la section 4.
    2. Calculez la libération de MDH comme une fraction de l'effet maximum (Triton X-100) comme suit :

figure-protocol-2

  1. Mesure mitochondriale DE ROS
    REMARQUE : La teneur mitochondriale de ROS est déterminée avec le précurseur fluorogenic sensible dihydrodichlorochlorocarboxyfluorescein diacète (DCFDA)22.
    1. Préparer des solutions pour la mesure mitochondriale ROS. Préparer une solution DCFDA de 50 MM en se dissolvant dans le méthanol (préparer frais) et une solution de succinate de 200 mM en se dissolvant en DW.
    2. Pipette 191 L d'homogénéisation mitochondriale incubée à chaque puits d'une plaque de puits de 96 et ajouter 4 L de 50 M DCFDA (1 m de concentration finale) et 5 l de 200 mM de succinate (concentration finale de 5 mM).
    3. Incuber l'assiette pendant 30 min dans un bain d'eau chaude fixé à 30 oC tout en remuant doucement.
    4. Chargez la plaque dans un lecteur de plaque de fluorescence et mesurez l'intensité de fluorescence, avec une excitation de 485 nm et une émission de 530 nm.

7. Analyse statistique

  1. Effectuez toutes les expériences au moins 2x ou 3x avec des essais tripliques et effectuez des tests statistiques appropriés. Ici, les résultats sont présentés comme étant la moyenne de la DD, et le test tapparié d'un étudiant a été utilisé pour calculer la signification statistique. Les valeurs P inférieures à 0,01 et 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives (p 'lt; 0.05; 'p 'lt; 0.01).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole décrit un modèle pour étudier les interactions du fibril amyloïde avec les mitochondries de cerveau de rat comme modèle biologique in vitro. Pour la préparation mitochondriale, 15% (v/v) milieu de gradient de densité a été utilisé pour enlever la myéline comme contamination majeure du tissu cérébral14. Comme le montre la figure 1A, la centrifugation à 30 700 x g a produit deux bandes distinctes de matériel, la myéline

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une multitude de résultats expérimentaux appuie l'hypothèse que la cytotoxicité des agrégats fibrillaires est significativement associée à leur capacité d'interagir avec les membranes biologiques et de perméabilize4,5. Cependant, la plupart des données sont basées sur des bicouches lipidiques artificielles qui ne reflètent pas nécessairement les propriétés intrinsèques des membranes biologiques, qui sont des structures hétérogènes avec une grande variété de phosp...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ces travaux ont été soutenus par des subventions du Conseil de recherche de l'Institute for Advanced Studies in Basic Sciences (IASBS), À Zanjan, en Iran.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2&prime ;,7&prime ;-Dichlorodihydrofluorescéine diacétateSigma35845
Sulfate d’ammoniumMerck1012171000
Noir Plaque à 96 puitsCorning
Noir Plaque à fond transparent à 96 puitsCorning
Insuline bovineSigmaI6634
Sérum bovin Albumine (BSA)SigmaA2153
BSA essentiellement sans acides grasSigmaA6003
CentrifugeuseSigma Ruban d’étanchéité
transparentCorning
CuSO4Sigma451657
Sac de dialyse (coupé 2 KDa)SigmaD2272
HomogénéisateurDouncePotter Elvehjem
EDTASigmaE9884
Lecteur de plaques de fluorescenceBioTek
Spectrophotomètre de fluorescenceCary Eclipse VARIAN
FolinMerckF9252
GlycineSigmaG7126
GuillotineFabriqué en Iran
HClMerckH1758
Blanc d’oeuf de poule Lysozyme (HEWL)SigmaL6876
Na2CO3SigmaS7795
NaH2PO4SigmaS7907
NaOHMerckS8045
OxaloacétateSigmaO4126
PercollGE Healthcare
Tampon phosphate salin (PBS)SigmaCS0030
PMSFSigmaP7626
Tartrate de sodium de potassiumSigma217255
Cuvette de quartzSigma
Spectrophotomètreanalytik jenaSPEKOL 2000 modèle
SuccinateSigmaS2378
SucroseMerck1076871000
ThermomixeurEppendorph
Thioflavin TSigmaT3516
Tris-HClMerck1082191000
Triton X-100SigmaT9284
TryptoneQUELAB
Bain-marieMemmert
Extrait de levureQUELAB
&beta ;-NADHSigmaN8129

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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