Visualisation de la dynamique des récepteurs T-Cell de surface à quatre dimensions à l'aide de microscopie à feuilles de lumière en treillis

Summary

Le but de ce protocole est de montrer comment utiliser la microscopie lattice Light-Sheet pour visualiser en quatre dimensions la dynamique des récepteurs de surface dans les cellules vivantes. Ici, les récepteurs des lymphocytes T sur les lymphocytes T CD4^et primaires sont montrés.

Abstract

La signalisation et la fonction d'une cellule sont dictées par les structures dynamiques et les interactions de ses récepteurs de surface. Pour vraiment comprendre la relation structure-fonction de ces récepteurs in situ, nous devons les visualiser et les suivre sur la surface des cellules vivantes avec une résolution spatiotemporal suffisante. Ici, nous montrons comment utiliser récemment développé Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM) pour l'image des récepteurs à cellule T (TCRs) en quatre dimensions (4D, l'espace et le temps) à la membrane cellulaire vivante. Les lymphocytes T sont l'une des principales cellules effectrices du système immunitaire adaptatif, et ici nous avons utilisé les lymphocytes T comme exemple pour montrer que la signalisation et la fonction de ces cellules sont entraînées par la dynamique et les interactions des TCR. LLSM permet une imagerie 4D avec une résolution spatiotemporal sans précédent. Cette technique de microscopie peut donc être généralement appliquée à un large éventail de molécules de surface ou intracellulaires de différentes cellules en biologie.

Introduction

La dynamique précise du trafic et de la diffusion des molécules sur la surface tridimensionnelle des cellules en temps réel a été une énigme à résoudre. La microscopie a toujours été un équilibre de vitesse, de sensibilité et de résolution; si un ou deux sont maximisés, le troisième est minimisé. Par conséquent, en raison de la petite taille et de la vitesse immense avec laquelle les récepteurs de surface se déplacent, le suivi de leur dynamique est resté un défi technologique majeur dans le domaine de la biologie cellulaire. Par exemple, de nombreuses études ont été menées à l'aide de la microscopie interne totale de fluorescence (TIRF)^1,....

Protocol

5C. C7 TCR-transgénique RAG2 knock-out souris en B10. Un fond ont été employés dans cette étude selon un protocole approuvé par le comité institutionnel de soin et d'utilisation des animaux de l'université de Chicago.

1. Récolter et activer les lymphocytes T

REMARQUE : Cette partie du protocole est basée sur des protocoles précédents. Voir les citations pour plus de détails^20,21.

1. Euthanasier un 5C de 10-12 semaines. Souris transgénique C7 de l'un ou l'autre sexe (de 20 à 25 g) selon le protocole approuvé de l'IACUC (c.-à-d. la chambre CO₂

Results

Ici, nous décrivons l'isolement, la préparation, et l'imagerie de la souris primaire 5C. Cellules T C7 à l'aide d'un microscope à feuilles de lumière en treillis. Pendant la section 3, il est impératif d'aligner correctement le microscope et de recueillir quotidiennement des FPS pour décongestionner les données après la collecte. Dans la figure 2, nous montrons les images d'alignement correctes qui seront vues lors de l'alignement du microscope. La figure 2

Discussion

Le protocole présenté a été optimisé pour l'utilisation des cellules CD4^et T isolées de 5C. Les souris transgéniques C7 sur l'instrument LLSM utilisé, et donc d'autres systèmes cellulaires et LLSM peuvent avoir besoin d'être optimisés différemment. Cependant, ce protocole montre la puissance de l'imagerie 4D, car il peut être utilisé pour quantifier la dynamique d'un récepteur de surface sur une cellule entière avec le moins de distorsion dans les conditions physiologiques. Par conséquent, il existe de nombreu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seringue de 1 mL	BD	309659	Pour la récolte de cellules T
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148-25ML	Pour la culture de cellules T
Lamelles rondes de 5 mm	World Precision Instruments	502040	Pour l’imagerie
Filtre de cellules stériles de 70um	Corning	7201431	Pour la récolte de cellules T
Alexa Fluor 488 anti-souris TCR &beta ; chaîne Anticorps	BioLegend	109215	pour l’imagerie
sérum bovin fœtal (FBS)	X& Y Cell Culture	FBS-500	Pour la culture de cellules T
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	Réactif à gradient Denisty pour la récolte des cellules
T Sel de fluorescéine sodique	Sigma-Aldrich	F6377	Pour l’alignement du microscope
FluoSpheres Microsphères modifiées au carboxylate	Thermo Fisher Scientific	F8810	Pour l’alignement du microscope
Imaris	Bitplane	N/A	Logiciel de suivi ; D’autres options pour les logiciels de suivi incluent Amira ou Trackmate (Fidji).
Microscope à feuillet de lumière sur réseau	3i	N/A	Microscope utilisé
L-15 de Leibovitz, sans rouge de phénol	Thermo Fisher Scientific	21083027	Pour l’imagerie
la L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030-081	Pour la culture de cellules
T LLSpy	Janelia Research Campus	N/A	LLSpy a été utilisé sous licence de l’Institut médical Howard Hughes, Janelia Research Campus. Contactez-innovation@janelia.hhmi.org pour y accéder. D’autres méthodes de déconvolution et de deksewing sont disponibles dans les logiciels de traitement d’images tels que Fiji, Slidebook, Amira et autres. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/
Moth Cytochrome C (MCC), séquence ANERADLIAYLKQATK	Elimbio	Synthèse personnalisée	Pour la récolte des lymphocytes
T Penacillin/Streptamycin	Life Technologies	15140122_3683884612	Pour la culture des lymphocytes
T Poly-L-Lysine	Phenix Produits de recherche	P8920-100ML	Pour l’imagerie
Tampon de lyse RBC	eBioscience	00-4300-54	Pour la récolte de cellules T
Souris recombinante IL-2	Sigma-Aldrich	I0523	Pour la culture de cellules
T RPMI 1640 Medium	Corning	MT10040CV	Pour la culture de cellules T
Slidebook	3i	N/A	Logiciel d’imagerie LLSM
Outils	de dissection chirurgicaleNova-Tech International	DSET10	Pour la récolte de cellules
T Flacons T-25	Eppendorf	2231710126	Pour la culture de cellules T
Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits	Thermo Fisher Scientific	44685	Pour la préparation