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Article de méthode

Les deux règles d'ADN étudieront le mécanisme de la translocation de Ribosome avec la résolution d'un seul nucléotide

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⸱

DOI :

10.3791/59918

⸱

8 juillet 2019

 ,  , 
1Department of Chemistry, University of Houston, 2Department of Biology and Biochemistry, University of Houston

Dans cet article

Résumé

L'analyse double de règle d'ADN est développée pour déterminer la position d'ARNm pendant la translocation de ribosome, qui s'appuie sur les forces de dissociation des duplex d'ADN-ARNm formés. Avec la résolution d'un nucléotide simple et la capacité d'atteindre les deux extrémités de l'ARNm, il peut fournir des aperçus mécanistes pour la translocation de ribosome et sonder d'autres déplacements d'acide nucléique.

Résumé

La translocation ribosome se réfère au mouvement ribosomal sur l'ARNm par exactement trois nucléotides (nt), qui est l'étape centrale dans la synthèse des protéines. Pour étudier son mécanisme, il y a deux exigences techniques essentielles. La première est la résolution mono-nt qui peut résoudre la translocation normale de frameshifting, au cours de laquelle le ribosome se déplace par d'autres que 3 nt. La deuxième est la capacité de sonder à la fois les côtés d'entrée et de sortie de l'ARNm afin d'élucider l'ensemble de l'image de la translocation. Nous rapportons l'analyse de règle d'ADN double qui est basée sur les forces critiques de dissociation des duplex d'ADN-ARNm, obtenues par spectroscopie de magnétisation résiduelle induite par la force (FIRMS).  Avec la résolution de force de 2-4 pN, l'assay de double règle est suffisant pour distinguer différentes étapes de translocation. En mettant en œuvre un long lien sur les ANN sondants, ils peuvent atteindre l'ARNm de l'autre côté du ribosome, de sorte que la position de l'ARNm peut être déterminée pour les deux côtés. Par conséquent, l'exemple de règle double est particulièrement adapté pour étudier la translocation ribosome, et le mouvement de l'acide nucléique en général. Nous montrons des résultats représentatifs qui ont indiqué une conformation d'ARNm en boucle et résolu la translocation normale du changement de cadre.

Introduction

Le déplacement biomoléculaire est un paramètre fondamental dans l'étude du mécanisme des fonctions biologiques connexes. Un exemple particulier est la translocation ribosome1,2, au cours de laquelle le ribosome se déplace par exactement trois nucléotides (nt) sur l'ARN messager (ARNm) normalement, et par un, deux, ou d'autres nombres de nt sauf trois dans le cas de frameshifting. Par conséquent, une résolution mono-nt du système de règle moléculaire est nécessaire pour distinguer les différentes tailles d'étape. Un plus grand défi est de sonder le mouvement ribosome sur les côtés d'entrée et de sortie. En d'autres termes, ce n'est qu'avec un système de double règle que nous serons en mesure de révéler si l'ARNm est fileté en douceur à travers le ribosome, ou il ya des étapes intermédiaires dans lesquelles les deux côtés ont des tailles d'étapes différentes conduisant à une conformation arnde plissée ou en boucle à l'intérieur de la Ribosome.

Plusieurs méthodes ont été développées pour relever le premier défi de résoudre différentes étapes sur le côté de sortie du ribosome (l'extrémité 3' de l'ARNm). Le double bifuséré résout les différents cadres de lecture en mesurant les rapports des différentes protéines résultantes3,4. Il n'est applicable que pour la fin 3' de l'ARNm et donc insuffisant pour fournir une image complète de la translocation. La spectrométrie de masse peut analyser les différents fragments de peptides comme conséquence des réarrangements de code correspondants5. Mais il ne peut pas identifier combien nt le ribosome se déplace sur l'ARNm. L'assay d'impression d'orteil est une autre méthode commune qui emploie une transcriptase inverse amorcée àl'extrémité 3'-distal pour transcrire l'ARNm vers le ribosome 6. Cependant, il n'est pas applicable pour la fin de 5' de l'ARNm qui entre dans le ribosome. D'autres techniques, y compris les approches à molécule unique et les méthodes de fluorescence7, sont difficiles à atteindre une résolution unique.

Nous avons développé le double test de règle d'ADN qui peut déterminer de façon unique les positions d'entrée et de sortie de l'ARNm découvert dans les complexes ribosome-mRNA.  Les ADN souverains sont des oligomères de l'ADN qui forment des duplex de certains nombres de paires de base (bp) avec l'ARNm découvert par le ribosome, quelle que soit l'extrémité de l'ARNm. Les nombres de bp révèlent alors précisément la position de ribosome sur l'ARNm pendant la translocation. Les nombres de bp des duplex sont déterminés par leurs forces critiques de dissociation obtenues à partir de la spectroscopie de magnétisation résiduelle induite par la force (FIRMS)8. Avec l'incertitude de la force de 2-3 pN, les forces critiques sont suffisantes pour offrir la résolution simple-nt. En mettant en œuvre une molécule de liaison sur les règles d'ADN, le côté stérilement entravé de l'ARNm par le ribosome peut être sondé. Différents déplacements ribosomal peuvent ainsi être résolus avec précision. Nous avons avec succès révélé une conformation unique en boucle de l'ARNm piégé par les antibiotiques au cours de la translocation9, et résolu différents cadres de lecture qui coexistaient sur une séquence d'ARNm glissante10. Cet article décrit les détails de l'essai de règle double, qui incluent la préparation des complexes de ribosome, la fonctionnalisation de surface des glissières en verre, l'immobilisation des complexes de ribosome et leur hybridation avec la règle magnétiqued d'ADN molécules, la détection magnétique et l'analyse du spectre de force par firms.

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Protocole

1. Préparation des complexes de ribosome

  1. Faire 1 000 mL de tampon TAM10, qui se compose de 20 mM tris-HCl (pH 7,5), 10mM Mg (OAc)2, 30 mN 4 Cl, 70 mM KCl, 5 mM EDTA, 7 mM BME (2-mercaptoethanol), et 0,05% Tween20.
  2. Préparer les cinq mélanges énumérés dans le tableau 1.
    REMARQUE: Le ribosome était de la souche MRE60011. EF-Tu: facteur d'allongement thermo instable. EF-Ts: facteur d'allongement thermo stable. GTP: triphosphate de guanosine. PEP: phospho(enol)pyruvate.
  3. Incuber les cinq mélanges séparément à 37 oC pendant 25 min avant de faire les complexes de ribosome. Préparer les cinq complexes ribosome selon le tableau 2.
    REMARQUE: Post: post-translocation; Pré: pré-translocation.
  4. Ajouter chacun des cinq complexes de ribosome sur un coussin de saccharose de 1,1 M séparément, avec un rapport de volume 1:1. Purifie chacun avec 450 000 g pour 2 h dans une ultra-centrifugeuse. Utilisez une pipet pour enlever le supernatant et restaurer les complexes de ribosome à -80 oC après la suspension de la pastille avec tampon TAM10.

2. Préparation de lames en verre recouvertes de biotine

  1. Nettoyage préliminaire des lames de verre
    1. Placer 12 lames de verre d'une largeur de 60,0 à 4,0 mm 3 (L et W et T) dans un plat en verre court et large.
    2. Remplir le plat en verre d'acétone et sonicate pendant 5 min. Ensuite, lavez les toboggans avec de l'eau ultrapure 5 fois et remplissez les 3/4 du plat avec de l'eau.
    3. Ajouter 10 M KOH pour remplir le plat et sonicate les lames de verre pendant 20 min. Laver les toboggans avec de l'eau 5 fois.
    4. Ajouter l'éthanol et le sonicate pendant 5 min, verser l'éthanol et les sécher séparément à 300 oC pendant 3 h.
  2. Enduit d'aminosilane
    1. Placez les 12 lames nettoyées dans le plat en verre contenant du méthanol. Nettoyez un flacon de PEGylation avec du méthanol en soniquant pendant 5 min, puis remplissez-le de 25 ml de méthanol, 1,25 ml d'eau, 0,125 mL HAc, 0,25 mL 3-aminopropyltriethoxysilane (AMEO).
    2. Remplacez immédiatement le méthanol dans le plat en verre par la solution AMEO préparée. Incuber à température ambiante pendant 30 min.
    3. Rincer les glissières à l'eau plusieurs fois, puis les sécher par purge d'azote. Placer les lames séchées dans des plats en verre propre.
  3. PEGlation (EN)
    1. Préparer la solution NaHCO3 (8,4 mg/mL) et le tampon DE PÉGylation (37,5 mg PEG, 6 mg de PEG biotinylated, 150 'L NaHCO3 solution). Bien mélanger en tournant à 6 000 tr/min pendant 1 min.
    2. Placez 25 ll de solution PEG sur chaque diapositive. Couvrez-le avec l'autre diapositive sur le dessus. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles entre les deux diapositives.  Placez les diapositives dans une boîte à épissaume vide. Assurez-vous que la boîte est nivelée et placez-la dans un tiroir sombre pendant environ 3 h.
    3. Rincer les toboggans à l'eau et les sécher à nouveau. Conserver les lames séchées à température ambiante sous vide jusqu'à 2 semaines.

3. Préparation de l'échantillon avant les mesures magnétiques et de force

  1. Machine un échantillon en plastique bien avec des dimensions de 4 ' 3 '2 mm3 (L 'W 'D). Coller un morceau de verre recouvert de biotine (environ 5 mm de long, coupé à partir des toboggans de 60 mm de long préparés dans la section 2) sur la surface inférieure à l'aide d'époxy.
  2. Ajouter 20 oL de 0,25 mg/mL de solution aqueuse de streptavidindanse dans le puits d'échantillon et couver à température ambiante pendant 40 min. Ensuite, rincez bien l'échantillon deux fois avec le tampon TAM10.
  3. Immobiliser les complexes ribosome.
    1. Sans antibiotiques : Utilisez une pipette pour enlever le tampon du puits de l'échantillon, puis ajoutez 20 l de complexe de ribosome de 0,1 M (MF-Pre ou MF-Post) dans le puits de l'échantillon. Le complexe de ribosome se liera avec le streptavidin sur la surface par l'intermédiaire de la biotine de 5'-extrémité sur l'ARNm. Incuber à 37 oC pendant 1 h, puis rincer une fois avec le tampon TAM10.
    2. Pour l'expérience utilisant à la fois de la néomycine et de l'acide fusidique : incuber le complexe MF-Pre avec de la néomycine à 37 oC pendant 10 min; incubez ef-G avec de l'acide fusidique à 37 oC pendant 20 min. Les concentrations sont les suivantes : complexe de ribosome de 0,1 M, 2 M EF-G, 4 mM DE GTP, 4 mM PEP, 0,02 mg/mL de pyruvate kinase, 0,2 mM de néomycine et 0,25 mm d'acide fusidique.
    3. Effectuez les autres expériences antibiotiques de la même façon. Les concentrations sont les suivantes: 0,2 mM de viomycine, 0,4 mM d'hygromycine B, et 0,25 mM d'acide fusidique.
    4. Pour l'étude de changement de cadre, répétez les étapes ci-dessus pour les complexes MFNF-Pre et MFNF-Post impliquant le motif glissant U6A. Utilisez des antibiotiques acide fusidique plus néomycine, et l'acide fusidique seul, respectivement.
  4. Retirez le tampon du puits de l'échantillon, puis ajoutez 20 l de 1 brin d'ADN biotinylated biotinylated et incuber à température ambiante pendant la nuit. Rincer le duplex ADN-ARNm formé une fois avec le tampon TAM10.
  5. Retirez bien le tampon du puits de l'échantillon. Ajouter ensuite 20 l de perles magnétiques enduites de streptavidin de 0,5 mg/mL dans le puits de l'échantillon et couver à température ambiante pendant 2 h.
  6. Insérez soigneusement l'échantillon bien dans un support et placez-le dans une centrifugeuse. Retirer les particules magnétiques libres de la surface en centrifugeant à 84 x g pendant 5 min.

4. Mesures magnétiques et de force

  1. Allumer le laser
    1. Allumez le laser à l'aide de la clé. Appuyez ensuite sur le bouton d'alimentation.
    2. Ajustez la sensibilité de l'amplificateur de verrouillage 1 (LIA1) à 500 mV et attendez environ 2 h pour réchauffer et stabiliser le magnétomètre atomique.
  2. Mise en place du magnétomètre atomique
    1. Exécutez le logiciel de contrôle d'instrument et configurez les paramètres de mesure. Certains paramètres peuvent varier légèrement dans chaque mesure.
      REMARQUE : Le magnétomètre atomique comprend un laser (décrit ci-dessus), un amplificateur de verrouillage SR830 (appelé LIA1), un amplificateur de verrouillage SR530 (appelé LIA2), DS345 (appelé FG1) et ATF20B (appelé FG2) générateurs de fonction, une haute résolution moteur et un ordinateur. Tous ces éléments devraient être activés à cette étape du protocole.
    2. Configurez le mode de déplacement du moteur vers le bruit et la position par défaut à 0. Appuyez sur le verrou sur le panneau avant, ajuster la sensibilité de LA LIA1 à 200 mV.
    3. Ajustez le courant et la tension du laser et trouvez le pic de résonance approprié et le niveau de signal au bruit. Appuyez sur Balayez sur le panneau avant. Notez que le rapport amplitude/largeur doit être supérieur à 0,5 et que la valeur de la phase doit être inférieure à 5 degrés. Si ce n'est pas le cas, refaites l'étape de balayage.
    4. Branchez la sortie de LIA2 à la rétroaction du laser pour verrouiller sa fréquence. Cet amplificateur mesure la rotation optique d'une cellule auxiliaire de césium pour maintenir la fréquence de laser sur la résonance12. L'état reste jusqu'à la fin de la mesure.
    5. Générateur de fonction de branchement FG2 pour entrer une onde carrée (500 mVpp, 100 mHz) comme signal de référence. L'onde carrée correspond à 100 pT et est utilisée pour convertir la sortie actuelle de l'amplificateur en signal magnétique. Débranchez le générateur de fonction.
    6. Configurez le mode de déplacement du moteur en position bidirectionnelle et par défaut à 260 mm. Vérifiez l'état du contrôleur de température pour assurer la température appropriée (37 oC) du capteur atomique.
    7. Vérifiez la stabilité de l'ensemble du système en mesurant les signaux du titulaire de l'échantillon vide deux fois. Évaluer la stabilité et le niveau de bruit après avoir soustrait les deux traces. Le niveau de bruit et la fluctuation typiques doivent être de 2 pT à 30 ms de temps d'intégration.
  3. Magnétisation de l'échantillon
    1. Placez délicatement l'échantillon sur la station de magnétisation et laissez-le rester pendant 2 min.
      REMARQUE : La station de magnétisation se compose d'un aimant permanent (0,5 T) et d'un espaceur en plastique.
    2. Remettre l'échantillon dans le porte-échantillon. Utilisez une force centrifuge de 335,4 g pour éliminer les particules magnétiques non spécifiquement liées.
  4. Mesures magnétiques après l'application des forces
    1. Utilisez une pince à épiler pour charger l'échantillon sur le moteur. Cliquez sur Verrouiller sur le panneau avant pour exécuter le programme. Pendant ce temps, utilisez une pince à épiler pour charger l'autre échantillon dans le support et placez-le dans la centrifugeuse. Notez que le côté en verre enduit doit faire face au centre de la centrifugeuse.
      REMARQUE : La technique de la spectroscopie de magnétisation résiduelle induite par la force (FIRMS) est utilisée, qui utilise un magnétomètre atomique pour mesurer le signal magnétique de l'échantillon après avoir appliqué une force mécanique sur les interactions moléculaires dans l'échantillon. Ici, les interactions moléculaires sont entre les molécules de règle d'ADN et l'ARNm dans le complexe de ribosome. La force est augmentée dans le sens des étapes en augmentant la vitesse centrifuge. Après avoir appliqué chaque force, le moteur traduit l'échantillon au capteur atomique, puis se déplace en arrière. Par conséquent, deux profils de champ magnétique sont obtenus, l'un pendant l'analyse vers l'avant et l'autre pendant l'analyse vers l'arrière13. Nous n'utilisons ce dernier que pour extraire la hauteur de pointe en raison de son meilleur rapport signal-bruit. La hauteur maximale du courant (nA) est convertie en amplitude du signal magnétique (pT) basée sur l'onde carrée d'étalonnage.
    2. Chaque mesure dure environ 5 min. Lorsque le moteur revient à 0, cliquez sur Enregistrer sur le panneau avant. Utilisez soigneusement une pince à épiler pour prélever des échantillons de moteur et de centrifugeuse. Utiliser la vitesse initiale correspondant à 335,4 g (2000 tr/min, révolution par minute pour la centrifugeuse figurant dans le Tableau des matériaux).
    3. Échangez les deux échantillons et appliquez une force plus forte en augmentant la vitesse centrifuge de 100 tr/min ou taille d'étape similaire. Traiter alternativement pour augmenter graduellement la force; un spectre de force complet est obtenu après 10-12 points de données.
  5. Terminer l'expérience
    1. Lorsque toutes les expériences prévues sont terminées, éteignez l'équipement, en procédant dans l'ordre opposé comme il a été allumé.
    2. Retirer les échantillons du support et les immerger dans de l'éthanol pour le nettoyage et l'utilisation future. Nettoyez le porte-échantillon avec de l'acétone en cas de contamination par les perles magnétiques.
  6. Analyse des données
    1. Ouvrez le script d'analyse Python et entrez toutes les données expérimentales. Cliquez sur Charger carré pour entrer l'onde carrée comme référence. Cliquez ensuite sur La ligne de base de la charge pour entrer le signal magnétique résiduel en arrière-plan.
    2. Définir la diminution globale du signal magnétique comme B0. Normalisez chaque diminution de signal magnétique B à B0 et exprimez-le en pourcentage. Tracer le pourcentage (B/B0) par rapport à la force centrifuge pour obtenir le spectre FIRMS.
      REMARQUE : La force centrifuge F est calculée à partir de la masse flottante des perles magnétiques m (4,6 x 10kg), de la vitesse centrifuge w, et du rayon de la centrifugeuse r (7,5 cm ici) par l'équation F 2 (en) r. La résolution de force typique est 2-4 pN et la portée de force est 15-95 pN dans ce travail.

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Résultats

La figure 1 montre le schéma de détection et les photographies des principaux composants. La détection magnétique est réalisée par un magnétomètre atomique utilisant le schéma de balayage (Figure 1A)13. L'échantillon est placé sur une tige montée sur un moteur linéaire. Le moteur transporte l'échantillon au capteur atomique à l'intérieur d'un bouclier magnétique, puis de retour au site d'origine pour le déchargement. Le m...

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Discussion

Dans notre double test de règle, les perles magnétiques jouent deux rôles essentiels. Premièrement, ils servent de transducteurs de force parce que la force centrifuge est proportionnelle à leur masse flottante. Deuxièmement, les perles sont des porteurs de signaux détectés par un magnétomètre atomique, qui est actuellement le capteur magnétique le plus précis. Combinant manipulation mécanique et détection magnétique, la technique FIRMS est capable de résoudre un grand nombre d'interactions moléculaires basées sur leurs ...

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Déclarations de divulgation

Aucun conflit d'intérêts potentiel n'a été signalé par les auteurs.

Remerciements

Ce travail est soutenu par les National Institutes of Health des États-Unis (R01GM111452, Y.W., S.X.). Y. W. reconnaît le soutien de la Fondation Welch (E-1721).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Bande de styrèneVille de l’industrieMS-861
Lames de verreRevêtements60.0 × ; 4.0 × ; 0.3 mm3
Acide acétiqueMillipore SigmaA6283-500ML
3-AminopropyltriethoxysilaneUCTspécialités 21400088
mPEG-SVALaysan Bio154-82
Biotin-PEG-SVALaysan Bio152-84
Bicarbonate de sodiumMillipore SigmaS5761-500G
Colle époxyDevcon31345
StreptavidineThermoFisher434301
Acide fusidiqueMillipore SigmaF0756-1G
Sulfate de néomycineMillipore Sigma
Sulfate de viomycineMillipore Sigma1715000
Hygromycineinvitrogen10687-010
Tris-HClMillipore SigmaT5941-100G
Acétate de magnésiumMillipore SigmaM5661-50G
Chlorure d’ammoniumMillipore SigmaA9434-500G
Potassium chlorureMillipore SigmaP9333-500G
EDTAGIBCO774750
2-mercaptoéthanolMillipore SigmaM6250-500ML
Tween20Millipore SigmaP1379-250ML
GTPMillipore SigmaG8877-100MG
PEPMillipore SigmaP7127-100MG
Pyruvate kinaseMillipore SigmaP1506-5KU
Saccharose  ;Millipore SigmaS7903-5KG
Dynabeads M-280 StreptavidinThermoFisher11205D
mRNA Oligo IntegratedDNA Technologies1338997275&prime ;-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU AAA AAA AAU AAU AAU AAU AUG UUU AAU UAU UUU UU UGG CGC AAU CUA CUG CUG CUG AAC UC-3&prime ;   ;
DNA OligoIntegrated DNA Technologies1574686303 ?- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5 ?  ;
DNA OligoIntegrated DNA Technologies1648453703 ?-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5'   ;
DNA OligoIntegrated DNA Technologies1574686283 ?-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5'   ;
DNA OligoIntegrated DNA Technologies1634727053 ?-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5'   ;
DNA OligoIntegrated DNA Technologies1386781303 ?-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5'
DNA OligoIntegrated DNA Technologies1386781313 ?-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5'   ;
DNA OligoIntegrated DNA Technologies1386781323 ?-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5 ?  ;
DNA OligoIntegrated DNA Technologies1386781333 ?-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5'   ;
CentrifugeuseEppendorf5427R
Micro UltracentrifugeuseHitachiCS150FNX
Mélangeur VortexVWRVM-3000
Amplificateur Lock-InStanford Research SystemsSR530
Amplificateur Lock-InStanford Research SystemsSR830
LaserNewportTLB-6918-D
Générateur de fonctionsStanford Research SystemsDS345
PhotodétecteursThorlabsDET36A
évaporés 1458009

Références

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