Article de méthode

Tests d'activité basés sur la RMN pour déterminer l'inhibition des composés, les valeurs IC50, l'activité artifactual et l'activité à cellules entières des ribohydrolases nucléoside

DOI :

10.3791/59928

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30 juin 2019

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1Department of Chemistry, Adelphi University, 2Department of Chemistry, Washington University in St. Louis, 3Department of Chemistry, Boston University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Des essais d'activité basés sur la RMN ont été développés pour identifier et caractériser les inhibiteurs de deux enzymes nucléoside de ribohydrolase. Des protocoles sont fournis pour les essais composés initiaux à 500 m et 250 M, des tests dose-réponse pour déterminer les valeurs IC50, des essais de contre-écran de détergent, des essais de contre-écran de dilution de saut, et des essais dans les cellules entières d'E. coli.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La spectroscopie RMN est souvent utilisée pour l'identification et la caractérisation des inhibiteurs des enzymes dans la découverte de médicaments, en particulier dans le contexte du dépistage des fragments. Les essais d'activité basés sur la RMN sont idéalement adaptés pour travailler aux concentrations plus élevées de composés d'essai nécessaires pour détecter ces inhibiteurs plus faibles. La plage dynamique et la dispersion des décalages chimiques dans une expérience rmN peuvent facilement résoudre les résonances du substrat, du produit et des composés d'essai. Cela contraste avec les essais spectrophotométriques, dans lesquels les problèmes d'interférence de lecture proviennent souvent de composés avec des profils d'absorption UV-vis qui se chevauchent. En outre, puisqu'ils manquent d'enzymes de journaliste, les essais de RMN à enzyme unique ne sont pas enclins à coupler-assay faux positifs. Cet attribut les rend utiles en tant qu'essais orthogonaux, complétant les essais traditionnels de dépistage à haut débit et les essais de triage sur le banc. Des protocoles détaillés sont fournis pour les essais composés initiaux à 500 m et 250 M, des tests dose-réponse pour déterminer les valeurs IC50, des essais de contre-écran de détergent, des essais de contre-écran de dilution de saut, et des essais dans les cellules entières d'E. coli. Les méthodes sont démontrées à l'aide de deux enzymes de ribohydrolase nucléoside. L'utilisation de 1H NMR est montrée pour l'enzyme purine-spécifique, alors que 19NMR de F est montrée pour l'enzyme pyrimidine-spécifique. Les protocoles sont généralement applicables à toute enzyme où les résonances de substrat et de produit peuvent être observées et distinguées par la spectroscopie de RMN. Pour être le plus utile dans le contexte de la découverte de médicaments, la concentration finale de substrat ne doit pas être plus de 2-3x sa valeur Km. Le choix de l'expérience RMN dépend de la réaction enzymatique et des substrats disponibles ainsi que de l'instrumentation RMN disponible.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) est bien établie pour caractériser et surveiller les réactions enzymatiques1,2. Les différences dans les changements chimiques et les modèles d'accouplement sont utilisées pour distinguer les résonances du substrat et du produit, et des intensités de résonance relative sont utilisées pour quantifier le pourcentage de la réaction. La consommation de substrat et la création de produits sont directement observées dans le spectre de la RMN. Cela contraste avec la spectrophotométrie ou la spectroscopie fluorescence, dans laquelle le cours du temps de réaction est indiqué par un changement d'absorption attribuable à certaines espèces chimiques consommées ou créées. Tout comme avec les autres méthodes, la RMN peut être utilisée pour étudier les réactions enzymatiques en fonction de la température, du pH ou d'autres conditions de solution, et les effets des inhibiteurs peuvent être déterminés.

Plus récemment, des tests d'activité enzymatiques à base de RMN ont été démontrés pour le dépistage des fragments3,4. Les essais basés sur la RMN sont idéalement adaptés pour travailler aux concentrations plus élevées de composés d'essai (souvent aussi élevés que 1 mM) nécessaires pour détecter ces inhibiteurs plus faibles. La plage dynamique et la dispersion des décalages chimiques dans l'expérience rmnpeut peuvent facilement résoudre les résonances du substrat, du produit et des composés d'essai. Cela se compare favorablement aux essais spectrophotométriques où les problèmes d'interférence de lecture proviennent souvent de composés avec des profils d'absorption UV-vis qui se chevauchent. En outre, puisqu'ils manquent d'enzymes de journaliste, les essais de RMN à enzyme unique ne sont pas enclins à coupler-assay faux positifs. Cet avantage les rend utiles comme essais orthogonaux, complétant les essais traditionnels de dépistage à haut débit et les essais de triage de banc5.

Dans notre laboratoire de recherche, des essais d'activité basés sur la RMN sont utilisés pour identifier et évaluer les inhibiteurs des ribohydrolases nucléoside de Trichomonas vaginalis. Le parasite T. vaginalis cause la maladie sexuellement transmissible non virale la plus répandue6. L'augmentation de la résistance aux thérapies existantes7 est à l'origine de la nécessité de nouveaux traitements basés sur des mécanismes, avec des enzymes essentielles de voie de récupération nucléoside représentant des cibles de premier plan8. Des essais d'activité basés sur la RMN ont été développés pour les enzymes spécifiques à la pyrimidine et à la purine, la ribohydrolase nucléoside d'uridine (UNH)9, et l'adénosine/guanosine préférant la ribohydrolase nucléoside (AGNH)10. Les réactions catalysées par ces deux enzymes sont montrées dans la figure 1. Les essais de RMN sont utilisés pour dépister les bibliothèques de fragments à la recherche de points de départ chimiques, déterminer les valeurs de l'IC50 et éliminer les inhibiteurs de liaison à base d'agrégation ou covalents11. Les mêmes essais sont également traduits pour évaluer l'activité enzymatique dans les cellules entières12.

Des protocoles détaillés sont fournis pour les essais composés initiaux à 500 m et 250 M, des tests dose-réponse pour déterminer les valeurs IC50, des essais de contre-écran de détergent, des essais de contre-écran de dilution de saut, et des essais dans les cellules entières d'E. coli. Les protocoles sont généralement applicables à toute enzyme dans laquelle les résonances de substrat et de produit peuvent être observées et distinguées par la spectroscopie de RMN. Trois hypothèses ont été faites pour la simplicité. Tout d'abord, le substrat n'est pas spécifié. Pour que les essais d'activité basés sur la RMN soient utiles, la concentration finale du substrat ne devrait pas dépasser 2-3x la valeur Km 4. Dans les exemples montrés, les concentrations finales d'adénosine et defluorouridine 5 sont de 100 M (Km 54 'M) et de 50 'M (Km '15 'M), respectivement. Dans les protocoles, la réalisation de ces concentrations correspond à 12 l de 5 mM d'adénosine ou 12 à L de 2,5 mM 5-fluorouridine.

Deuxièmement, la quantité d'enzyme prévue dans les protocoles, 5 L, a été choisie pour correspondre à la quantité requise pour entraîner une conversion d'environ 75 % du substrat en produit en 30 min. Cette quantité représente généralement une dilution importante à partir d'un stock d'enzymes purifiées, et la dilution doit être déterminée à l'avance pour chaque enzyme. Les solutions de stock d'enzymes AGNH et UNH purifiées sont stockées à -80 oC dans des aliquots qui fournissent suffisamment d'enzymes pour plusieurs milliers de réactions. Ainsi, le facteur de dilution ne doit idéalement être déterminé ou validé que tous les quelques mois. Troisièmement, l'expérience spécifique 1D NMR n'est pas spécifiée. Dans les résultats représentatifs, 1H NMR est montré pour AGNH10 et 19F NMR est montré pour UNH9, avec l'expérience RmN décrite dans les références correspondantes. Le choix de l'expérience RMN dépend de la réaction enzymatique et des substrats disponibles ainsi que de l'instrumentation RMN disponible. Enfin, il convient de souligner que l'approche expérimentale décrite ne respecte pas les exigences strictes de la RMN quantitative (RMQ)13,14. Dans le protocole, une réaction en pourcentage est déterminée en utilisant les changements relatifs de l'intensité de la même résonance dans chaque spectre, plutôt qu'en déterminant les concentrations absolues. Cette approche élimine le besoin de modifications à l'acquisition et au traitement des données ainsi que des normes internes ou externes, qui sont requises pour le MRQ.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Essais de composés d'essai initiaux à 500 M et 250 M

  1. Préparer le substrat et le composé d'essai pour les réactions.
    1. Préparer des solutions de stock de substrat (adénosine ou 5-fluorouridine) dans l'eau et 50 mM composé d'essai dans le sulfoxide de diméthyle dilué (DMSO). Consultez la section d'introduction pour les concentrations de solution de substrat à utiliser.
    2. Ajouter 12 l de substrat (adénosine ou 5-fluorouridine) à chacun des quatre tubes de microfuge de 1,5 ml, 1 à 4.
    3. Ajouter 6 ll de DMSO deuterated aux tubes 1 (0 min de contrôle) et 4 (contrôle de 30 min). Ajouter 6 ll de composé d'essai au tube 2. Ajouter 3 ll de composé d'essai et 3 'L de DMSO dilué au tube 3.
  2. Préparer une solution de stock de réaction suffisante.
    REMARQUE : La solution de stock est pour cinq réactions qui contiennent chacune 517 l de tampon, 60 l d'oxyde de deutérium et 5 l de solution enzymatique (AGNH ou UNH). Consultez la section d'introduction pour les concentrations de solution enzymatique à utiliser.
    1. Ajouter 2,59 ml de tampon de réaction (50 mM de phosphate de potassium, 0,3 M KCl, pH 6,5) à un tube conique de 15 ml. Ajouter 300 l'oxyde de deutérium au tube conique. Ajouter 25 l de solution enzymatique (AGNH ou UNH) au conique.
    2. Inverser délicatement le tube conique deux fois pour mélanger.
  3. Simultanément initier et étancher la réaction de contrôle 0 min. Transférer 582 L de la solution de stock de réaction à un tube de microfuge propre. Ajouter 10 L de 1,5 M HCl à ce tube de microfuge. Transférer les 592 l combinés au tube de microfuge 1. Aspirer et distribuer l'échantillon deux fois de façon lente mais délibérée.
  4. Initier et exécuter les trois réactions restantes de façon décalée. À l'heure 0 min, transférer 582 l de la solution de stock de réaction au tube de microfuge 2. Aspirer et distribuer l'échantillon deux fois de façon lente mais délibérée. Répéter l'opération à intervalles de 30 s pour les tubes de microfuge 3 et 4. Attendez 30 min.
  5. Étancher les réactions. À la fois 30 min, ajouter 10 'L de 1,5 M HCl au microfuge 2. Répéter l'opération à intervalles de 30 s pour les tubes de microfuge 3 et 4. Transférer 600 l de solution de chaque microfuge vers les tubes RMN.
  6. Acquérir un spectre de RMN 1D sur chaque échantillon. Traiter les données pour assurer un phasage correct et des lignes de base plates.
  7. Calculer la conversion en pourcentage du substrat pour les spectres de contrôle.
    1. Recalibrez les spectres pendant 0 min et 30 min de commandes. Échelle du signal de substrat dans le contrôle de 0 min pour correspondre à la commande de 30 min. Notez ce pourcentage.
    2. Calculez la conversion en pourcentage comme (100 - pourcentage déterminé à l'étape 1.7.1).
  8. Calculer la conversion en pourcentage du substrat pour les réactions contenant composé d'essai.
    1. Resplant les spectres pour le contrôle de 0 min et la première réaction contenant le composé d'essai de 500 M. Échelle du signal de substrat dans le contrôle de 0 min pour correspondre au spectre avec le composé d'essai. Notez ce pourcentage. Calculer la conversion en pourcentage comme (100 - pourcentage déterminé).
    2. Répétez l'opération pour la deuxième réaction contenant le composé d'essai de 250 M.
  9. Calculez la réaction en pourcentage et l'inhibition pour cent pour chaque concentration composée d'essai.
    1. Calculez la réaction en pourcentage comme (1.8.1/1.7.2) x 100.
    2. Calculez l'inhibition en pourcentage comme (100 - pourcentage déterminé à l'étape 1.9.1).

2. Détermination des valeurs IC50

  1. Préparer le substrat et le composé d'essai pour les réactions.
    1. Préparer des solutions de stock de substrat (adénosine ou 5-fluorouridine) dans l'eau et 10 mM composé d'essai dans d'un DMSO dilué. Consultez la section d'introduction pour les concentrations de solution de substrat à utiliser.
  2. Préparer des dilutions en série de 10 mM de composé d'essai (dans le DMSO dilué).
    1. Ajouter 36 DMSO deulés de 36 L à cinq tubes de microfuge de 1,5 ml, 1 à 5.
    2. Ajouter le composé d'essai de 12 l 10 mm au tube 1 et taper légèrement pour mélanger. Le composé d'essai est maintenant de 2,5 mM.
    3. Transférer 12 l du tube 1 au tube 2 et taper légèrement pour mélanger. Le composé d'essai est maintenant de 0,63 mM. Transférer 12 l du tube 2 au tube 3 et taper légèrement pour mélanger. Le composé d'essai est maintenant de 0,16 mM. Transférer 12 l du tube 3 au tube 4 et taper légèrement pour mélanger. Le composé d'essai est maintenant de 0,04 mM. Transférer 12 l du tube 4 au tube 5 et taper légèrement pour mélanger. Le composé d'essai est maintenant de 0,01 mM.
  3. Préparer 14 tubes de microfuge de 1,5 ml pour les réactions.
    1. Ajouter 12 ll de substrat (adénosine ou 5-fluorouridine) à chacun des 14 tubes microfuge de 1,5 ml, 1-14.
    2. Ajouter 12 lde de DMSO dilué aux tubes 1 (0 min de contrôle) et 14 (contrôle de 30 min).
    3. Ajouter 12 l de composé d'essai de 10 mm aux tubes 2 et 3. Ajouter 12 l de composé d'essai de 2,5 mm aux tubes 4 et 5. Ajouter 12 l de composé d'essai de 0,63 mM aux tubes 6 et 7. Ajouter 12 l de composé d'essai de 0,16 mm aux tubes 8 et 9. Ajouter 12 l de composé d'essai de 0,04 mM aux tubes 10 et 11. Ajouter 12 l de composé d'essai de 0,01 mM aux tubes 12 et 13.
  4. Préparer une solution de stock de réaction suffisante pour exécuter 15 réactions qui contiennent 511 l de tampon, 60 l d'oxyde de deutérium et 5 l de solution enzymatique (AGNH ou UNH) chacune. Consultez la section d'introduction pour les concentrations de solution enzymatique à utiliser.
    1. Ajouter 7,67 ml de tampon de réaction (50 mM de phosphate de potassium, 0,3 M KCl, pH et 6,5) à un tube conique de 15 ml. Ajouter 900 l'oxyde de deutérium au tube conique. Ajouter 75 l de solution enzymatique (AGNH ou UNH) au conique.
    2. Inverser délicatement le tube conique 2x pour mélanger.
  5. Suivez les étapes décrites dans les étapes 1.3-1.9 à (en utilisant 576 L de solution de stock de réaction) pour déterminer la réaction en pourcentage pour chaque concentration de composé d'essai.
  6. Calculez la valeur IC50 à l'aide de GraphPad Prism.
    1. Créer un tableau de données corrélé le journal des concentrations composées d'essais de réaction (200 M, 50 M, 12,5 M, 3,13 M, 0,78 M, 0,20 M) avec une réaction en pourcentage (deux valeurs chacune).
    2. Utilisez une courbe non linéaire pour déterminer la valeur IC50 et l'erreur standard.

3. Essais d'écran de compteur de détergent à 100 M et 50 M

  1. Préparer le substrat et le composé d'essai pour les réactions.
    1. Préparer des solutions de stock de substrat (adénosine ou 5-fluorouridine) dans l'eau et 10 mM composé d'essai dans d'un DMSO dilué. Consultez la section d'introduction pour les concentrations de solution de substrat à utiliser.
    2. Ajouter 12 ll de substrat (adénosine ou 5-fluorouridine) à chacun des huit tubes de microfuge de 1,5 ml, 1 à 8.
    3. Ajouter 6 ll de DMSO deuterated aux tubes 1 et 5 (0 min de commandes) et 4 et 8 (30 min de commandes). Ajouter 6 ll de composé d'essai aux tubes 2 et 6. Ajouter 3 ll de composé d'essai et 3 l de DMSO dilué aux tubes 3 et 7.
  2. Préparer une solution de stock de réaction suffisante SANS détergent pour exécuter cinq réactions qui contiennent 517 l de tampon, 60 l d'oxyde de deutérium et 5 l de solution enzymatique (AGNH ou UNH) chacune. Consultez la section d'introduction pour les concentrations de solution enzymatique à utiliser.
    1. Ajouter 2,59 ml de tampon de réaction (50 mM de phosphate de potassium, 0,3 M KCl, pH et 6,5) à un tube conique de 15 ml. Ajouter 300 l'oxyde de deutérium au tube conique. Ajouter 25 l de solution enzymatique (AGNH ou UNH) au conique.
    2. Inverser délicatement le tube conique 2x pour mélanger.
  3. Préparer une solution de stock de réaction suffisante avec 0,01% v/v Triton X-100 détergent pour exécuter cinq réactions qui contiennent 517 l de tampon, 60 l d'oxyde de deutérium, et 5 l de solution enzymatique (AGNH ou UNH) chacune.
    1. Ajouter 2 ll de détergent Triton X-100 à 20 ml de tampon de réaction (50 mM de phosphate de potassium, 0,3 M KCl, pH et 6,5). Les solutions de détergent doivent être utilisées dans un délai d'un jour.
    2. Ajouter 2,59 ml de tampon de réaction contenant 0,01 % de détergent Triton X-100 dans un tube conique de 15 ml. Ajouter 300 l'oxyde de deutérium au tube conique. Ajouter 25 l de solution enzymatique (AGNH ou UNH) au conique.
    3. Inverser délicatement le tube conique 2x pour mélanger.
  4. Pour les tubes 1 à 4, à l'aide de la solution de stock de réaction SANS détergent, suivez les étapes décrites dans les étapes 1.3-1.9 pour déterminer l'inhibition en pourcentage pour chaque concentration de composé d'essai.
  5. Pour les tubes 5 à 8, en utilisant la solution de stock de réaction AVEC 0,01 % v/v Triton X-100 détergent, suivez les étapes décrites dans les étapes 1.3-1.9 pour déterminer l'inhibition en pourcentage pour chaque concentration de composé d'essai.

4. Saut-dilution contre-écran essais

  1. Préparer le substrat et tester les composés pour les réactions
    1. Préparer des solutions de stock de substrat (adénosine ou 5-fluorouridine) dans l'eau et 10 mM composé d'essai dans d'un DMSO dilué. Consultez la section d'introduction pour les concentrations de solution de substrat à utiliser.
    2. Ajouter 53,8 l de tampon de réaction (50 mM de phosphate de potassium, 0,3 M KCl, pH et 6,5) à deux tubes microfuge de 1,5 ml (chacun), 1 et 2. Ajouter 5 ll d'enzyme (AGNH ou UNH) aux tubes 1 et 2.
    3. Ajouter 511 ll de tampon de réaction à deux tubes de microfuge de 1,5 ml, 3 et 4 (chacun). Ajouter 60 l'oxyde de deutérium aux tubes 3 et 4. Ajouter 5 ll d'enzyme (AGNH ou UNH) aux tubes 3 et 4.
    4. Ajouter 1,2 L de DMSO dilué au tube 1 (30 min de contrôle). Ajouter 1,2 l de composé d'essai au tube 2. Ajouter 12 L de DMSO dilué au tube 3 (30 min de contrôle). Ajouter 12 ll de composé d'essai au tube 4. Incuber pendant 30 min.
  2. Préparer deux tubes de microfuge de 1,5 ml avec une solution de dilution.
    1. Ajouter 468 ll de tampon de réaction à chacun des deux tubes de microfuge de 1,5 ml, 5 et 6. Ajouter 60 l'oxyde de deutérium à chaque tube (5 et 6).
  3. Préparer quatre tubes de microfuge de 1,5 ml pour les réactions.
    1. Ajouter 12 l l de substrat (adénosine ou 5-fluorouridine) à chacun des quatre tubes de microfuge de 1,5 ml, 7 à 10.
  4. Effectuez des dilutions de saut et déclenchez les réactions.
    1. Transférer 528 l de solution du tube 5 au tube 1. Aspirer et distribuer l'échantillon deux fois de façon lente mais délibérée. Transférer 528 l de solution du tube 6 au tube 2. Aspirer et distribuer l'échantillon deux fois de façon lente mais délibérée.
    2. À la fois 0 min, transférer 588 l de solution du tube 1 au tube 7. Aspirer et distribuer l'échantillon 2x d'une manière lente mais délibérée. À intervalles de 30 s, transférez 588 l de solution du tube 2 au tube 8, du tube 3 au tube 9, et du tube 4 au tube 10. Aspirer et distribuer l'échantillon deux fois de façon lente mais délibérée. Attendez 30 min.
  5. Pour les tubes 7 à 10, suivez les étapes décrites dans les étapes 1.5-1.9 pour déterminer l'inhibition pour cent pour chaque concentration composée d'essai.

5. Essais composés dans les cellules entières d'E. coli

  1. Préparer la culture de 10 ml d'E. coli la veille des expériences.
  2. Préparer les cellules E. coli pour les expériences rmN.
    1. Centrifuger les cellules en 1 ml d'aliquots pendant 10 min à 15 000 x g.
    2. Jeter le supernatant et resuspendre chaque aliquot de cellules dans 1 ml de tampon de réaction (50 mM de phosphate de potassium, 0,3 M KCl, pH - 6,5) par vortex.
  3. Suivez les sections 1 ou 2 pour l'exemple souhaité avec les modifications suivantes :
    1. Remplacer 280 l de tampon dans la solution de stock de réaction par 280 l de cellules rechargées.
    2. Remplacer 5 ll d'enzyme (AGNH ou UNH) dans la solution de stock de réaction par 5 ll de tampon.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La figure 2 montre les résultats de l'essai de deux composés contre AGNH à l'aide de 1RmNH H suivant la section 1. La réaction enzymatique est plus facilement observée et quantifiée par la disparition des résonances de singlet et de doublet d'adénosine à 8,48 ppm et 6,09 ppm, respectivement, et l'apparition d'une résonance de singlet adénine à 8,33 ppm comme observé dans le contrôle de 30 min spectre. En présence d'un composé 1 de 500 M, aucun produit n'est formé comme en témoigne...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les protocoles décrits s'appliquent généralement à de nombreuses enzymes, à condition que les substrats et/ou les produits aient des signaux résolvables dans le spectre de la RMN. Cependant, il est essentiel que la concentration de substrat soit proche de sa valeur Km et suffisamment élevée pour être détectée dans une expérience de RMN dans un délai raisonnable. Une concentration de substrat ne s'est pas supérieure à 2-3x la valeur de Km est optimale pour détecter les inhibiteurs c...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions le Dr Dean Brown d'avoir fourni des composés de la bibliothèque de fragments d'AstraZeneca et le Dr David Parkin d'avoir fourni les enzymes AGNH et UNH. La recherche publiée dans cette publication a été appuyée par le National Institute of Allergy and Infectious Diseases des National Institutes of Health sous le numéro de prix R15AI128585 à B. J. S. Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les points de vue officiels des National Institutes of Health.Research a également été soutenu par une bourse de recherche d'été Horace G. McDonell décernée à S. N. M., une famille Landesberg Bourse décernée à J. A. G., subventions de perfectionnement du corps professoral et prix de recherche Frederick Bettelheim de l'Université Adelphi à B. J. S.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AGNHPurifié en interneN/ATVAG_213720
UNHPurifié en interneN/ATVAG_092730
AdénosineSigmaA9251
5-FluorouridineSigmaF5130
Diméthylsulfoxyde-D6Cambridge Isotope LabsDLM-10-100D, 99,9 %
Phosphate de potassium monobasiqueSigmaP0662
Phosphate de potassium dibasiqueSigmaP3786
Chlorure de potassiumSigmaP9541
Oxyde de deutériumCambridge Isotope LabsDLM-4-100D, 99,9
Acide chlorhydriqueFisher ChemicalA144212
Triton X-100SigmaX100
Sel sodique acide 3-(Trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3,-d4 (TSP)Sigma269913D, 98%
2,2,2-Trifluoroethanol-1,1-d2Sigma612197D, 99,5
PipetteGilsonF123602PIPETMAN Classic P1000
PipetteGilsonF123601PIPETMAN Classic P200
PipetteGilsonF123600PIPETMAN Classic P20
Tubes microfugesFisher Scientific05-408-129
Tubes coniquesCorning352099
MicrocentrifugeuseEppendorf5418
Mélangeur vortexFisher Scientific02215365
tubes RMNNorell502-7Ou, selon le cas, pour le
spectromètre RMN RMNBrukerN/ UnAvanceIII500
PrismGraphPadN/AVersion 5.04
 %  % logiciel

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. NMR in Molecular Biology. , Academic Press. New York. (1981).
  2. Evans, J. N. S. Biomolecular NMR spectroscopy. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1995).
  3. Dalvit, C., et al. A general NMR method for rapid, efficient, and reliable biochemical screening. Journal of the American Chemical Society. 125, 14620-14625 (2003).
  4. Dalvit, C. Ligand- and substrate-based 19F NMR screening: Principles and applications to drug discovery. Progress in NMR Spectroscopy. 51, 243-271 (2007).
  5. Stockman, B. J., et al. Identification of allosteric PIF-pocket ligands for PDK1 using NMR-based fragment screening and 1H-15N TROSY experiments. Chemical Biology & Drug Design. 73, 179-188 (2009).
  6. Hirt, R. P., Sherrard, J. Trichomonas vaginalis origins, molecular pathobiology and clinical considerations. Current Opinion in Infectious Diseases. 28, 72-79 (2015).
  7. Conrad, M. D., Bradic, M., Warring, S. D., Gorman, A. W., Carlton, J. M. Getting trichy: Tools and approaches to interrogating Trichomonas vaginalis in a post-genome world. Trends in Parasitology. 29 (2013), 17-25 (2013).
  8. Versées, W., Steyaert, J. Catalysis by nucleoside hydrolases. Current Opinion in Structural Biology. 13, 731-738 (2003).
  9. Shea, T. A., et al. Identification of proton-pump inhibitor drugs that inhibit Trichomonas vaginalis uridine nucleoside ribohydrolase. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 24, 1080-1084 (2014).
  10. Beck, S., Muellers, S. N., Benzie, A. L., Parkin, D. W., Stockman, B. J. Adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase is a distinct, druggable antitrichomonal target. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25, 5036-5039 (2015).
  11. Muellers, S. N., et al. Ligand-efficient inhibitors of Trichomonas vaginalis adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase. ACS Infectious Diseases. 5, 345-352 (2019).
  12. Veronesi, M., et al. Fluorine nuclear magnetic resonance-based assay in living mammalian cells. Analytical Biochemistry. 495, 52-59 (2016).
  13. Holzgrabe, U. Quantitative NMR spectroscopy in pharmaceutical applications. Progress in NMR Spectroscopy. 57, 229-240 (2010).
  14. Bharti, S. K., Roy, R. Quantitative 1H NMR spectroscopy. Trends in Analytical Chemistry. 35, 5-26 (2012).
  15. Dalvit, C., et al. Sensitivity improvement in 19F NMR-based screening experiments: Theoretical considerations and experimental applications. Journal of the American Chemical Society. 127, 13380-13385 (2005).
  16. Lambruschini, C., et al. Development of fragment-based n-FABS NMR screening applied to the membrane enzyme FAAH. ChemBioChem. 14, 1611-1619 (2013).
  17. Stockman, B. J. 2-Fluoro-ATP as a versatile tool for 19F NMR-based activity screening. Journal of the American Chemical Society. 130, 5870-5871 (2008).
  18. Aldrich, C., et al. The ecstasy and agony of assay interference compounds. ACS Central Science. 3, 143-147 (2017).
  19. Feng, B. Y., Shoichet, B. K. A detergent-based assay for the detection of promiscuous inhibitors. Nature Protocols. 1, 550-553 (2006).
  20. Copeland, R. A., Basavapathruni, A., Moyer, M., Scott, M. P. Impact of enzyme concentration and residence time on apparent activity recovery in jump dilution analysis. Analytical Biochemistry. , 206-210 (2011).
  21. Griveta, J. -P., Delort, A. -M. NMR for microbiology: In vivo and in situ applications. Progress in NMR Spectroscopy. 54, 1-53 (2009).
  22. Nijman, S. M. B. Functional genomics to uncover drug mechanism of action. Nature Chemical Biology. 11, 942-948 (2015).

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Essais d activit RMNinhibition enzymatiqued termination de l IC50contre criblage aux d tergentsessai de dilution rapideRMN du protonRMN du fluorconversion du substrat

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