Des essais d'activité basés sur la RMN ont été développés pour identifier et caractériser les inhibiteurs de deux enzymes nucléoside de ribohydrolase. Des protocoles sont fournis pour les essais composés initiaux à 500 m et 250 M, des tests dose-réponse pour déterminer les valeurs IC50, des essais de contre-écran de détergent, des essais de contre-écran de dilution de saut, et des essais dans les cellules entières d'E. coli.
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Article de méthode
Tests d'activité basés sur la RMN pour déterminer l'inhibition des composés, les valeurs IC50, l'activité artifactual et l'activité à cellules entières des ribohydrolases nucléoside
Dans cet article
Résumé
Résumé
La spectroscopie RMN est souvent utilisée pour l'identification et la caractérisation des inhibiteurs des enzymes dans la découverte de médicaments, en particulier dans le contexte du dépistage des fragments. Les essais d'activité basés sur la RMN sont idéalement adaptés pour travailler aux concentrations plus élevées de composés d'essai nécessaires pour détecter ces inhibiteurs plus faibles. La plage dynamique et la dispersion des décalages chimiques dans une expérience rmN peuvent facilement résoudre les résonances du substrat, du produit et des composés d'essai. Cela contraste avec les essais spectrophotométriques, dans lesquels les problèmes d'interférence de lecture proviennent souvent de composés avec des profils d'absorption UV-vis qui se chevauchent. En outre, puisqu'ils manquent d'enzymes de journaliste, les essais de RMN à enzyme unique ne sont pas enclins à coupler-assay faux positifs. Cet attribut les rend utiles en tant qu'essais orthogonaux, complétant les essais traditionnels de dépistage à haut débit et les essais de triage sur le banc. Des protocoles détaillés sont fournis pour les essais composés initiaux à 500 m et 250 M, des tests dose-réponse pour déterminer les valeurs IC50, des essais de contre-écran de détergent, des essais de contre-écran de dilution de saut, et des essais dans les cellules entières d'E. coli. Les méthodes sont démontrées à l'aide de deux enzymes de ribohydrolase nucléoside. L'utilisation de 1H NMR est montrée pour l'enzyme purine-spécifique, alors que 19NMR de F est montrée pour l'enzyme pyrimidine-spécifique. Les protocoles sont généralement applicables à toute enzyme où les résonances de substrat et de produit peuvent être observées et distinguées par la spectroscopie de RMN. Pour être le plus utile dans le contexte de la découverte de médicaments, la concentration finale de substrat ne doit pas être plus de 2-3x sa valeur Km. Le choix de l'expérience RMN dépend de la réaction enzymatique et des substrats disponibles ainsi que de l'instrumentation RMN disponible.
Introduction
La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) est bien établie pour caractériser et surveiller les réactions enzymatiques1,2. Les différences dans les changements chimiques et les modèles d'accouplement sont utilisées pour distinguer les résonances du substrat et du produit, et des intensités de résonance relative sont utilisées pour quantifier le pourcentage de la réaction. La consommation de substrat et la création de produits sont directement observées dans le spectre de la RMN. Cela contraste avec la spectrophotométrie ou la spectroscopie fluorescence, dans laquelle le cours du temps de réactio....
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Protocole
1. Essais de composés d'essai initiaux à 500 M et 250 M
- Préparer le substrat et le composé d'essai pour les réactions.
- Préparer des solutions de stock de substrat (adénosine ou 5-fluorouridine) dans l'eau et 50 mM composé d'essai dans le sulfoxide de diméthyle dilué (DMSO). Consultez la section d'introduction pour les concentrations de solution de substrat à utiliser.
- Ajouter 12 l de substrat (adénosine ou 5-fluorouridine) à chacun des quatre tubes de microfuge de 1,5 ml, 1 à 4.
- Ajouter 6 ll de DMSO deuterated aux tubes 1 (0 min de contrôle) et 4 (contrôle de 30 min). Ajouter 6 ll de composé d'essai au tube 2. Ajouter 3 ll de co....
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Résultats
La figure 2 montre les résultats de l'essai de deux composés contre AGNH à l'aide de 1RmNH H suivant la section 1. La réaction enzymatique est plus facilement observée et quantifiée par la disparition des résonances de singlet et de doublet d'adénosine à 8,48 ppm et 6,09 ppm, respectivement, et l'apparition d'une résonance de singlet adénine à 8,33 ppm comme observé dans le contrôle de 30 min spectre. En présence d'un composé 1 de 500 M, aucun produit n'est formé comme en témoigne.......
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Discussion
Les protocoles décrits s'appliquent généralement à de nombreuses enzymes, à condition que les substrats et/ou les produits aient des signaux résolvables dans le spectre de la RMN. Cependant, il est essentiel que la concentration de substrat soit proche de sa valeur Km et suffisamment élevée pour être détectée dans une expérience de RMN dans un délai raisonnable. Une concentration de substrat ne s'est pas supérieure à 2-3x la valeur de Km est optimale pour détecter les inhibiteurs c.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Nous remercions le Dr Dean Brown d'avoir fourni des composés de la bibliothèque de fragments d'AstraZeneca et le Dr David Parkin d'avoir fourni les enzymes AGNH et UNH. La recherche publiée dans cette publication a été appuyée par le National Institute of Allergy and Infectious Diseases des National Institutes of Health sous le numéro de prix R15AI128585 à B. J. S. Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les points de vue officiels des National Institutes of Health.Research a également été soutenu par une bourse de recherche d'été Horace G. McDonell décernée à S. N. M., une famille Landesberg Bourse décernée à J. ....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| AGNH | Purifié en interne | N/A | TVAG_213720 |
| UNH | Purifié en interne | N/A | TVAG_092730 |
| Adénosine | Sigma | A9251 | |
| 5-Fluorouridine | Sigma | F5130 | |
| Diméthylsulfoxyde-D6 | Cambridge Isotope Labs | DLM-10-100 | D, 99,9 % |
| Phosphate de potassium monobasique | Sigma | P0662 | |
| Phosphate de potassium dibasique | Sigma | P3786 | |
| Chlorure de potassium | Sigma | P9541 | |
| Oxyde de deutérium | Cambridge Isotope Labs | DLM-4-100 | D, 99,9 |
| Acide chlorhydrique | Fisher Chemical | A144212 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Sel sodique acide 3-(Trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3,-d4 (TSP) | Sigma | 269913 | D, 98% |
| 2,2,2-Trifluoroethanol-1,1-d2 | Sigma | 612197 | D, 99,5 |
| Pipette | Gilson | F123602 | PIPETMAN Classic P1000 |
| Pipette | Gilson | F123601 | PIPETMAN Classic P200 |
| Pipette | Gilson | F123600 | PIPETMAN Classic P20 |
| Tubes microfuges | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Tubes coniques | Corning | 352099 | |
| Microcentrifugeuse | Eppendorf | 5418 | |
| Mélangeur vortex | Fisher Scientific | 02215365 | |
| tubes RMN | Norell | 502-7 | Ou, selon le cas, pour le |
| spectromètre RMN RMN | Bruker | N/ Un | AvanceIII500 |
| Prism | GraphPad | N/A | Version 5.04 |
Références
- Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. NMR in Molecular Biology. , Academic Press. New York. (1981).
- Evans, J. N. S. Biomolecular NMR spectroscopy. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1995).
- Dalvit, C., et al.
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Réimpressions et autorisations
