Mesurer la prolifération des cellules musculaires vasculaires lisses à l'aide de la chimie de clic

Résumé

La prolifération est une partie essentielle de la fonction cellulaire, et une lecture commune utilisée pour évaluer la toxicité potentielle de nouveaux médicaments. La mesure de la prolifération est donc un résultat fréquemment utilisé en biologie cellulaire. Nous présentons ici une méthode simple et polyvalente de mesure de la prolifération qui peut être utilisée dans les cellules adhérentes et non adhérentes.

Résumé

La capacité d'une cellule à proliférer fait partie intégrante de la fonction normale de la plupart des cellules, et la dysrégulation de la prolifération est au cœur de nombreux processus de la maladie. Pour ces raisons, la mesure de la prolifération est un outil courant utilisé pour évaluer la fonction cellulaire. La prolifération cellulaire peut être mesurée simplement par comptage; cependant, il s'agit d'un moyen indirect de mesurer la prolifération. Un moyen courant de détecter directement les cellules se préparant à se diviser est par l'incorporation d'analogues nucléosides étiquetés. Il s'agit notamment de la nucléoside radioactive analogique ³H-thymidine plus non-radioactifs analogues nucléoside tels que 5-bromo-2' deoxyuridine (BrdU) et 5-ethynyl-2-deoxyuridine (EdU). L'incorporation d'EdU est détectée par la chimie de clic, qui a plusieurs avantages par rapport à BrdU. Dans ce rapport, nous fournissons un protocole pour mesurer la prolifération par l'incorporation de l'UE. Ce protocole comprend des options pour diverses lectures, ainsi que les avantages et les inconvénients de chacun. Nous discutons également des endroits où le protocole peut être optimisé ou modifié pour répondre aux besoins spécifiques de l'expérience planifiée. Enfin, nous touchons à la façon dont ce protocole de base peut être modifié pour mesurer d'autres métabolites cellulaires.

Introduction

La prolifération est une partie essentielle de la fonction cellulaire^1,2. Le contrôle de la prolifération influence les processus normaux tels que le développement, et les processus pathologiques tels que le cancer et les maladies cardiovasculaires. La croissance hyperplastique des cellules musculaires lisses vasculaires, par exemple, est pensé pour être un précurseur de l'athérosclérose³. Les changements dans la prolifération cellulaire sont également utilisés pour évaluer la toxicité potentielle de nouveaux médicaments. Compte tenu de son impact généralisé, la mesure de la proliférati....

Protocole

1. Détection de l'EdU à l'aide d'une étiquette fluorescente

1. Solutions boursières
   1. Préparer une solution de 5 mM EdU en ajoutant 12,5 mg d'EdU à 10 ml de H₂O double distillé.
   2. Préparer les composants de la solution d'étiquetage : 200 mM tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) (100 mg en 1,15 mL H₂O), 100 mM CuSO₄ (15,95 mg en 1 mL H₂O; faire frais), 10 mM Cy3 picolyl-azide (1 mg en 95,3 m L₂L , stocké dans 5 aliquots ll à -20 oC) et 1 M d'ascorbate de sodium (200 mg dans 1 ml H₂O; faire frais).
   3. Préparer la solution de stock de résine à une concentration de ....

Résultats

Dans la figure 2, nous démontrons les résultats de trois expériences différentes mesurant la prolifération de VSMC en réponse au PDGF. Après avoir augmenté les cellules dans les médias formulés pour les SMC, nous avons effectué l'expérience dans le Srum dMEM libre, pour éliminer tous les effets potentiels du sérum ou des facteurs de croissance sur la prolifération. Dans la figure 2A, nous comparons les résultats, de la même expérience, à l'aide d'une lecture flu.......

Discussion

L'incorporation d'EdU est un moyen simple et simple de mesurer la prolifération cellulaire; il est particulièrement utile pour les cellules adhérentes¹³. Notre protocole utilise des cellules musculaires lisses, mais il s'applique à toute cellule adhérente (épithéliale, endothéliale, etc.). Bien que le protocole ne soit pas compliqué, la seule étape critique consiste à faire la solution d'étiquetage — les ingrédients doivent être ajoutés dans l'ordre indiqué. En outre, comme les taches occidentales.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
5-Ethynyl-2'-deoxyuridine	Carbosynth	NE08701
biotine azoture de picolyle	Click Chemistry Tools	1167-5
CuSO4	Fisher Scientific	C1297-100G
Cy3 picolyl azide	Click Chemistry Tools	1178-1
Cytation Plate Reader	Biotek
EVOS Microscope	Thermo Fisher Scientific
Solution de peroxyde d’hydrogène	Sigma-Aldrich	216763
Na ascorbate	Sigma-Aldrich	11140-250G
NucBlue Sondes à cellules fixes prêtes à tacher	Invitrogen	R37606	DAPI coloration nucléaire
Odyssey Tampon
de blocage Li-Cor 927-40000 tampon de blocageServices de	microscopie électronique	15710
PBS	Fisher Scientific	SH3002802
sodium	Sigma Life Science	S3014-5kg
Streptavidine Raifort Peroxydase Conjugate	Life Technologies	S911
Super Signal ELISA Femto	Thermo Scientific	PI137075	substrat ELISA
Synergy Plate Reader	Biotek
THPTA	Click Chemistry Tools	1010-100
Chlorhydrate de tris hydroxyméthyl aminométhane (Tris-HCl)	Fisher Scientific	BP153-500
Triton X 100	Bio-Rad	1610407
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100

au paraformaldéhyde Chlorure de