Les chloroplastes sont les organites qui définissent les plantes1. Avec de nombreuses autres fonctions métaboliques, développementales et de signalisation, les chloroplastes sont responsables de la photosynthèse – le processus par lequel l’énergie solaire est exploitée pour alimenter les activités cellulaires de la vie. Par conséquent, les chloroplastes sont essentiels, non seulement pour les plantes mais aussi pour la myriade d’écosystèmes qui dépendent des plantes, et pour l’agriculture. Les chloroplastes sont composés de milliers de protéines différentes, dont la plupart sont codées dans le noyau et importées du cytosol avant d’être dirigées en interne vers l’un des nombreux compartiments intraorganellaires clairementdistincts 1. Pour parvenir à une compréhension plus complète du développement et des fonctions des chloroplastes, et pour permettre des stratégies biotechnologiques impliquant la manipulation des chloroplastes qui répondent aux défis mondiaux liés à la sécurité alimentaire ou à la bioénergie, il sera essentiel de déterminer le ciblage, la localisation et les interactions des protéines importantes des chloroplastes. Cette collection de méthodes décrit un ensemble de techniques cruciales et complémentaires qui peuvent être utilisées pour atteindre ces objectifs. La collection se concentre principalement sur la plante modèle largement utilisée Arabidopsis thaliana (cresson thalé), mais les méthodes peuvent aussi être adaptées et appliquées à d’autres organismes.
La collection comprend des descriptions de deux techniques différentes pour analyser l’importation de protéines codées dans le noyau dans les chloroplastes à travers l’enveloppe à double membrane. L’article de Ling et Jarvis2 décrit une méthode in vitro dans laquelle des chloroplastes isolés sont incubés avec une protéine précurseur marquée radioactivement. La mesure dans laquelle les chloroplastes absorbent la protéine précurseur est déterminée en surveillant le changement de taille de la protéine résultant du clivage peptidique (séquence leader ciblant) en transit, en utilisant SDS-PAGE et l’imagerie au phosphore. La méthode présentée est le développement d’une approche utilisée depuis plusieurs décennies pour étudier l’importation de protéines de chloroplastes invitro 3,4, et intègre des étapes supplémentaires permettant d’évaluer la réactivité des machines d’importation aux conditions de stress subies parl’usine 5. D’autre part, l’article de Lee et al.6 décrit une méthode in vivo basée sur l’expression transitoire d’une protéine précurseur chimérique, transportant un domaine protéique fluorescent, dans des cellules intactes (protoplastes). Dans cet essai, l’ampleur de l’importation de protéines chloroplastiques peut être suivie de deux manières différentes : en surveillant la localisation et l’intensité du signal de fluorescence à l’aide de la microscopie à fluorescence ; et, en analysant le changement de taille des protéines résultant du clivage peptidique en transit à l’aide d’immunoblotting. Ces deux méthodes sont très complémentaires et peuvent offrir des résultats convaincants lorsqu’elles sont utilisées ensemble enparallèle 5.
Une fois qu’une protéine a été importée à travers l’enveloppe dans le chloroplaste, et que son peptide de transit a été retiré, elle peut soit prendre sa conformation finale dans le stroma (le principal compartiment aqueux interne de l’organite), soit engager l’une des nombreuses voies de triinternes 1. En tant que site des complexes photosynthétiques très abondants, les membranes thylacoïdes constituent une destination majeure pour ce type de tri interne ; En fait, le ciblage des protéines thylacoïdes implique plusieurs voies mécanistiquement distinctes. L’article d’Asher et al.7 décrit une gamme de méthodes in vitro qui permettent d’étudier différentes voies de translocation des protéines thylacoïdes. Ces méthodes impliquent l’incubation de thylacoïdes isolés avec une protéine précurseur marquée radioactivement et, dans certains cas, un extrait stromal concentré. La mesure dans laquelle la protéine est absorbée par les thylacoïdes est surveillée en évaluant la clivage du signal de ciblage et en protégeant la protéase de la thermolysine appliquée de manière exogène, à l’aide de SDS-PAGE et d’imagerie au phosphore. Bien sûr, les thylacoïdes ne constituent pas le seul sous-compartiment du chloroplaste, et il est souvent souhaitable d’avoir la capacité d’évaluer d’autres compartiments également. À cet égard, l’article de Bouchnak et al.8 est particulièrement important, car il décrit les méthodes de subfractionnement des chloroplastes afin de produire des échantillons hautement purs correspondant aux membranes enveloppantes, au stroma et aux thylakoïdes. Une fois préparées, ces fractions peuvent être analysées par immunoblotting et/ou spectrométrie de masse, afin de fournir une mine d’informations sur la localisation sous-organellaire des protéineschloroplastiques 9.
En ce qui concerne l’analyse des interactions protéine-protéine et des assemblages complexes multiprotéiques, deux méthodologies différentes sont décrites dans la collection. L’article de Shanmugabalaji et al.10 présente une méthode de purification par affinité des complexes multiprotéiques chloroplastiques. Cette technique consiste à analyser des plantes transgéniques exprimant un composant du complexe d’intérêt conçu pour porter une étiquette d’affinité (la fameuse étiquette de purification d’affinité en tandem, ou étiquette TAP). La capacité de cette étiquette à se lier fortement à une matrice autrement inerte est exploitée dans le cadre de la stratégie de purification. La méthode présentée se concentre spécifiquement sur la purification de la machinerie d’importation de protéines de chloroplastes (qui comprend des complexes multiprotéiques appelés TOC et TIC intégrés dans les membranesde l’enveloppe 1), mais en principe elle peut être adaptée pour étudier n’importe quel autre assemblage multiprotéique existant dans leschloroplastes 11. L’article de Rantala et al.12 décrit une approche complémentaire de la caractérisation complexe basée sur l’électrophorèse dans des conditions natives. La technique, telle que présentée ici, consiste à libérer des complexes photosynthétiques à partir de thylacoïdes purifiés à l’aide d’un détergent doux et non ionique, suivi de leur séparation à l’aide de blue native (BN)-PAGE. La résolution primaire des complexes peut être suivie d’une seconde dimension d’électrophorèse en conditions de dénaturation, ce qui permet de visualiser les composants individuels de chaque complexe identifié dans la première dimension. Comme pour la méthode TAP, cette approche native PAGE peut être adaptée avec succès pour étudier d’autres complexes protéiques au sein del’organite 13,14. Avec l’une ou l’autre approche, les complexes purifiés peuvent être analysés de diverses manières, notamment par immunoblotting et spectrométrie de masse.
Ensemble, les articles inclus dans cette collection de méthodes présentent un ensemble puissant de techniques complémentaires qui, en conjonction avec les ressourcesexistantes 15,16, pourraient être utilisées pour améliorer considérablement notre compréhension des divers aspects de la biogenèse et de la fonction des chloroplastes, en particulier ceux étroitement liés au protéome organital. Parce que les chloroplastes sont responsables de la majeure partie de la production primaire photosynthétique terrestre, et jouent en outre un rôle vital dans les réponses des plantes à l’environnement (y compris les contraintes biotiques et abiotiques), ces organites remarquables resteront inévitablement un axe majeur de la recherche fondamentale et appliquée à travers le monde pendant des années.