Des modèles de souris de xénogreffe de xénogreffe de mélanome uastatique de foie humain orthotopic ont été créés utilisant des techniques orthotopic chirurgicales d'implantation orthotopic avec le morceau patient-dérivé de tumeur et les techniques d'injection d'aiguille avec les lignes humaines cultivées de cellules de mélanome uveal.
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Article de méthode
Génération d'un foie orthotopic Human Uveal Melanoma Xenograft Platform in Immunodeficient Mice
Dans cet article
Résumé
Résumé
Au cours des dernières décennies, les tumeurs xénogreffes dérivées du patient ou les lignées cellulaires humaines cultivées ont été de plus en plus reconnues comme des modèles plus représentatifs pour étudier les cancers humains chez les souris immunodéficientes que les cellules humaines établies traditionnelles. lignes in vitro. Récemment, des modèles orthotopiquement implantés de xénogreffe de tumeur patient-dérivé (PDX) chez les souris ont été développés pour mieux reproduire des dispositifs des tumeurs patientes. On s'attend à ce qu'un modèle orthotopic de souris de xénogreffe de foie soit une plate-forme utile de recherche de cancer, fournissant des perspicacités dans la biologie de tumeur et la thérapie de drogue. Cependant, l'implantation orthotopic de tumeur de foie est généralement compliquée. Ici nous décrivons nos protocoles pour l'implantation orthotopic des tumeurs uvéal de mélanome uveal foie-métastatique patient-dérivées. Nous avons cultivé les lignées de cellules uvéales métastatiques de mélanome de foie humain dans les souris immunodéficientes. Les protocoles peuvent avoir comme conséquence des taux de succès technique uniformément élevés utilisant une technique orthotopic chirurgicale d'implantation avec des morceaux de tumeur uveal de mélanome patient-dérivée ou une technique d'injection d'aiguille avec la ligne humaine cultivée de cellules. Nous décrivons également des protocoles pour le balayage de CT pour détecter des tumeurs intérieures de foie et pour des techniques de ré-implantation utilisant des tumeurs cryoconservées pour réaliser le re-engraftment. Ensemble, ces protocoles fournissent une meilleure plate-forme pour les modèles orthotopiques de souris de tumeur de foie du mélanome uvéal métastatique de foie dans la recherche translationnelle.
Introduction
Le mélanome uvéal est la tumeur maligne intraoculaire la plus commune parmi des adultes dans le monde occidental. Au cours des 50 dernières années, l'incidence du mélanome uvéal (5,1 cas par million) est restée stable aux États-Unis1,2. Le mélanome uvéal provient des mlanocytes dans l'iris, le corps ciliaire, ou la choroïde, et c'est une maladie extrêmement mortelle quand il développe la métatasie. Le taux de mortalité des patients présentant la métastase uvéal de mélanome était 80% à 1 an et 92% à 2 ans après diagnostic initial des métastases. Le temps entre le diagnostic des métastases et la mort est généralement court, moins de 6 mois, sans égard à la thérapie3,4. Le cancer se propage dans le sang et tend à métastaser principalement le foie (89-93%)4,5. Un modèle efficace de souris est urgent nécessaire pour davantage d'investigation du mélanome uvéal foie-métastatique. Pour la recherche translationnelle, il y a une demande claire pour produire un modèle métastatique de souris de mélanome métastatique foie-localisé.
On s'attend à ce que les modèles de souris de xénogreffe de tumeur patient-dérivé (PDX) fournissent des stratégies individualisées de médecine. Ces modèles pourraient être prédictifs des résultats cliniques, être utiles pour l'évaluation préclinique de drogue, et être employés pour des études biologiques des tumeurs6. Les modèles représentatifs de PDX sont des souris xénogreffes ectopiques implantées par tumeur, qui ont la tumeur aux emplacements sous-cutanés. La plupart des chercheurs peuvent faire la chirurgie pour l'implantation sous-cutanée sans pratique spéciale7,8. Ils peuvent également surveiller les tumeurs sous-cutanées facilement. Bien que les modèles sous-cutanés PDX est devenu populaire dans la phase de recherche, ils ont quelques obstacles à passer à l'utilisation pratique. L'implantation sous-cutanée force les tumeurs patient-dérivées à engraft à un microenvironnement différent de l'origine de tumeur, de sorte qu'elle mène à l'échec d'engraftment et à la croissance lente de tumeur 9,10,11, 12,13,14. L'engraftment orthotopic peut être une approche plus idéale et rationnelle pour un modèle de PDX parce qu'il emploie le même organe que la tumeur originale15,16.
Récemment, nous avons développé des protocoles pour les techniques orthotopic d'implantation chirurgicale des tumeurs uveal de mélanome et uvéal de foie-dérivées patient-dérivées et des techniques d'injection d'aiguille avec une ligne de cellules uvéal uveal de mélanome de foie-métastatique de culture dans NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) souris17,18. Les protocoles se traduisent par des taux de réussite technique toujours élevés. Nous avons également établi des techniques de balayage de CT qui sont utiles pour détecter des tumeurs intérieures de foie, et nous avons développé la ré-implantation des tumeurs cryopréservées dans la plate-forme de PDX. Nous avons constaté que les modèles de xénogreffe de tumeur de mélanome uvéal maintiennent les caractéristiques de la tumeur originale de foie de patient, y compris leurs dispositifs histopathologiques et moléculaires. Ensemble, ces techniques fournissent une meilleure plate-forme pour les modèles de tumeur orthotopic de foie pour le mélanome uvéal dans la recherche translationnelle.
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Protocole
Les patients inscrits à l'étude devraient fournir un consentement écrit permettant l'utilisation d'échantillons chirurgicaux jetés à des fins de recherche et d'études génétiques, selon un protocole approuvé par la Commission d'examen institutionnel. Ce protocole a été réalisé dans le strict respect des recommandations du Guide pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire des Instituts nationaux de la santé et approuvé par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC).
1. Collection de tissu tumoral frais dérivé du patient
- Obtenir le tissu de tumeur patient-dérivé de la chirurgie ou d'une biopsie d'aiguille dans une salle d'opération d'hôpital.
- Mettre le tissu tumoral dans un récipient de 100 ml contenant la solution de sel équilibrée (HBSS) de Hanks sur la glace.
- Transférer le tissu dans une hotte stérile (niveau de biosécurité 2) en laboratoire.
- Passez à l'étape 2 dès que possible.
REMARQUE: Pour des raisons de sécurité, excluez les patients atteints d'infections connues du VIH ou de l'hépatite B ou C.
2. Traitement du tissu tumoral frais dérivé du patient
- Mettre le tissu dans un tube de 50 ml contenant de la saline tamponnée de phosphate (PBS) sur la glace. Pour laver le tissu, ajouter le PBS dans le tube et jeter le PBS du tube deux fois.
- Transférer le tissu dans un plat Petri contenant du PBS sur la glace.
- À l'aide de forceps stériles et de ciseaux, retirer les parties nécrotiques du tissu. Gardez le tissu humide et froid pendant les étapes 2.3 à 2.5. Pour les échantillons de biopsie à aiguilles, sautez les étapes 2.3 et 2.5 et ne coupez pas les échantillons.
REMARQUE: Le tissu nécrotique se brise souvent facilement lorsqu'il est touché. - Couper le tissu en cubes de 1 mm3 pour l'implantation chirurgicale du foie.
- Couper le reste du tissu en cubes de 2 mm dans le plat Petri.
- Transférez-les dans un microtube de 1,7 mm avec 4% de formaline pour l'analyse histologique et dans un autre tube pour l'analyse génomique et protéomique.
- Mettre les microtubes dans un bocal à azote liquide avec de l'azote liquide. Transférer les tubes dans un congélateur de -80 oC pour un stockage permanent.
REMARQUE: Le délai entre l'enlèvement de l'échantillon du patient et le traitement des tissus ne doit pas dépasser 30 min.
3. Implantation chirurgicale de foie avec le tissu de tumeur patient-dérivé
- Vaporiser tous les objets entrant dans le capot pour la chirurgie avec 70 % d'alcool éthylique.
REMARQUE: Cela comprend les instruments chirurgicaux, les coussins chauffants et les appareils d'anesthésie. - Mesurer le poids d'un coton-tige et d'une feuille de tissu.
- Anesthésiez une souris avec un vaporisateur d'isoflurane de 3 à 5 % en la plaçant dans la chambre d'induction.
- Une fois que la souris est entièrement anesthésiée, placez-la en position de supine sur un coussin chauffant. Placez le cône d'isoflurane sur le museau de la souris pour inhaler 1,5 à 3 % d'isoflurane pour le maintien de l'anesthésie.
REMARQUE: La souris doit être sur le coussin chauffant pendant toute la procédure. Le manque de chauffage peut causer l'hypothermie. - Confirmer une bonne anesthésie par aucune réaction lorsque le pied de la souris est piqué avec des forceps ultrafines.
- Injecter de la buprénorphine (0,6 mg/kg) sous-cutanée sur le flanc à l'aide d'une aiguille de 27 G sur une micro seringue avant la chirurgie.
- Appliquer 70% d'alcool éthylique sur l'abdomen et étendre la fourrure vers le haut et vers le bas. Après l'épandage de la fourrure, confirmer une visualisation plus facile de la peau en dessous de la zone sous-costale gauche pour une coupe plus facile. Ne pas raser la fourrure de l'abdomen.
REMARQUE: La fourrure cachera le site d'incision après chirurgie et empêchera la souris de gratter l'opération de poteau d'incision. Cependant, vous pouvez raser la fourrure pour prévenir l'infection du site d'incision selon les normes institutionnelles. - Appliquer l'iode et laisser être absorbé dans la peau.
- Placez un drapé chirurgical stérile avec un trou de 2 cm sur la souris.
- Soulevez la peau abdominale avec des forceps ultrafines incurvées et faites une incision de la peau subcostale gauche de 1 cm avec des ciseaux incurvés.
- Insérez la pointe des ciseaux incurvés sous la peau de l'incision et ouvrez-les légèrement pour séparer le péritoine de la peau. Retirez les ciseaux de l'incision avec des lames fermées.
REMARQUE: L'ouverture et la fermeture des ciseaux à l'intérieur de la souris peuvent causer des dommages et des saignements. - Localiser le foie sous le péritoine. Confirmer une couleur rougeâtre foncée à travers le péritoine.
- Avec des ciseaux incurvés, faire une incision transversale de 1 cm dans le péritoine. Si une artère péritonéale saigne du tranchant, arrêtez immédiatement le saignement par cautérisation.
- Prenez le tissu adipeux à l'aide de forceps ultrafins incurvés d'une main, insérez le bord d'un coton-tige sous le lobe du foie gauche et roulez l'écouvillon vers le bas avec l'autre main pour faire ressortir le foie.
REMARQUE: Saisir les tissus adipeux est important pour empêcher le tissu adipeux de coller à l'écouvillon de coton. - Extérisez le foie sur l'écouvillon de coton et placez le foie sur une feuille de tissu absorbante non tissée.
REMARQUE: La feuille de tissu joue deux rôles essentiels dans la stabilisation du foie et l'absorption de l'hémorragie. - Faire une incision de 5 mm de largeur et de profondeur à l'aide d'une lame stérile de scalpel no 11 pour former une poche dans le parenchyme tout en appuyant doucement sur le site d'incision avec l'écouvillon de coton.
- Insérez la lame en parallèle avec la surface du foie et coupez horizontalement.
- Appuyez sur le site d'incision avec l'écouvillon de coton pour arrêter toute hémorragie.
REMARQUE: Ne gardez pas la lame verticale, sinon vous briserez le foie et blesserez de grands vaisseaux au milieu du foie.
- Rouler l'écouvillon de coton vers le haut pour ouvrir le site d'incision et implanter un cube de 1 mm3 de tissu tumoral dans la poche avec des forceps ultrafines courbés. Retirez les forceps en roulant l'écouvillon de coton en rotation inverse et en appuyant vers le bas.
REMARQUE: Appuyer sur le site d'incision avec l'écouvillon de coton tout en rétractant les forceps aide à empêcher le déplacement de la tumeur à l'intérieur de la poche. - Retirez délicatement l'écouvillon de coton du site d'incision après l'implantation. Passez à l'étape 3.19 dès que possible.
- Mettez un hemostat absorbable sur le site d'incision.
- Confirmer l'hémostase. Si le saignement continue, ajouter plus d'hémostat sur le site d'incision.
- Épluchez le foie de la feuille de tissu avec des forceps (de préférence émoussés) et remettez le foie dans la cavité abdominale.
- Sutoétone de suture avec la ligature double utilisant la suture absorbable 5-0.
- Suturer la peau avec la triple ligature utilisant la suture absorbable 5-0.
REMARQUE: La triple ligature aide à prévenir la déhiscence chirurgicale d'incision. - Observez la souris jusqu'à ce qu'elle soit complètement éveillée et remettez-la dans la cage.
- Mesurer le poids de l'écouvillon de coton et de la feuille de tissu avec du sang pour le volume de saignement pendant la chirurgie. Comparez-les avec leur poids d'origine avant la chirurgie. Réduire les saignements pendant la chirurgie à moins de 10% du volume sanguin circulant chez la souris.
4. Collecte et traitement de la ligne de cellules de mélanome uvéal métastatique de foie humain cultivé
- Préparer les cellules cultivées.
- Recueillir les cellules et calculer le nombre de cellules à l'aide d'un compteur cellulaire.
- Préparer une quantité appropriée de suspension cellulaire pour 10,0 x 106 cellules dans un tube de 15 ml.
- Faire tourner le tube à 300 x g pendant 5 min dans une centrifugeuse à température ambiante.
- Retirez le supernatant dans le tube de 15 ml. Laissez la pastille cellulaire au fond du tube.
- Ajouter 50 oL de rpMI 1640 milieu dans un tube de 1,7 ml.
- Couper la pointe d'une pointe de 200 l à l'aide de ciseaux pour agrandir l'ouverture de la pointe.
- Ajouter 60 l de matrice membranaire du sous-sol à l'aide d'une pipette avec la pointe coupée dans le tube de 1,7 ml qui a RPMI.
- Mélanger le RPMI et la matrice dans le tube de 1,7 ml. Vortex.c'est.
- Ajouter 110 l de mélange dans la pastille cellulaire dans le tube de 15 ml. Transférer la suspension cellulaire dans un nouveau tube de 1,7 ml.
- Gardez le tube sur la glace avant l'injection d'aiguille.
5. Implantation chirurgicale d'aiguille de culture humaine de foie Métastatique de mélanome uvéal ligne dans le foie
- Suivez le protocole ci-dessus des étapes 3.1 à 3.15.
- Recueillir la suspension cellulaire avec une microseringue avec une aiguille de 27 G.
- Insérez l'aiguille le long de la surface du foie et avancez la pointe de l'aiguille 5 mm plus profond.
- Injecter 20 ll de suspension cellulaire dans le foie.
- Cauteriser le point d'insertion du foie pour empêcher les cellules injectées de s'échapper. Confirmer l'hémostase.
- Suivez le protocole ci-dessus des étapes 3.21 à 3.24.
6. Tomodensitome
- Placez la souris dans un restrainer dans l'état éveillé.
- Essuyez la queue avec un tampon d'alcool stérile pour la désinfection et la vasodilatation.
- Injecter 100 l d'agent de contraste CT à travers la veine de la queue avec une aiguille de 27 G sur une seringue de 1 ml.
- Attendez 4 h après l'injection avant de passer la tomodensitome.
REMARQUE: Il faut 4 h jusqu'à ce que l'agent soit pris par les cellules Kupffer du foie. - Quatre heures après l'injection, anesthésier la souris porteuse de tumeur avec 3-5% d'isoflurane vaporisé en le plaçant dans la chambre d'induction.
- Une fois que la souris est entièrement anesthésiée, placez-la en position couchée sur un CT. Placez le cône d'isoflurane sur le museau de la souris pour inhaler 1,5 à 3 % d'isoflurane pour l'entretien de l'anesthésie.
- Confirmer une bonne anesthésie par aucune réaction lorsque le pied de la souris est piqué avec des forceps ultrafines.
- Faites une tomodensitome pendant 15 min.
- Assurez-vous que la souris jusqu'à ce qu'elle soit complètement réveillée après la tomodensitome et la remettre dans la cage.
- Évaluer l'existence de la tumeur et mesurer la taille de la tumeur sur les images CT.
REMARQUE: L'agent de contraste améliore le parenchyme normal de foie de sorte qu'il soit facile de reconnaître la tumeur non améliorée. Ne pas mal interpréter la vésicule biliaire et l'estomac comme tumeur.
7. Récolte et traitement des tissus
- Euthanasier les souris à l'aide du CO2 suivie d'une luxation cervicale en plaçant l'index et le pouce derrière le crâne et en tirant le corps par la base de la queue. Passez à l'étape 7.2 dès que possible.
- Placez la souris en position de supine et vaporisez l'abdomen avec 70% d'alcool éthylique.
- Utilisez des forceps stériles et des ciseaux stériles pour faire une incision transversale de 3 cm au-dessous du processus xiphoïde pour exposer les organes abdominaux.
- Accise le tissu tumoral et effectuez des étapes 2.1 à 2.2.
- Couper le reste de la tumeur en cubes de 2 mm dans le plat Petri.
- Transférez-les dans un tube cryogénique avec cryomédium pour la réimplantation après la cryoconservation.
- Mettre les tubes dans un récipient de congélation cryogénique rempli d'isopropanol.
- Transférer le contenant dans un congélateur de -80 oC pour un stockage temporaire. Ne mettez pas les cryotubes avec cryomedium directement dans un réservoir d'azote liquide. Congelez-les lentement à un taux de refroidissement de -1 oC/min pour préserver le tissu tumoral.
- Le lendemain, transférer les tubes dans un réservoir d'azote liquide pour un stockage permanent.
8. Réimplantation
- Gardez les tubes congelés dans un pot d'azote liquide avec de l'azote liquide jusqu'à ce qu'ils soient prêts à implanter le tissu. Réduire au minimum l'exposition du tissu à la température ambiante afin de maintenir la viabilité et d'augmenter les chances d'engraftment.
- Décongeler le tube cryoconservé dans un bain d'eau de 37 oC.
- Effectuer des étapes 2.2-2.4.
- Implanter la tumeur décongelée chez les souris comme décrit dans les étapes 3.1-3.24.
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Résultats
L'implantation orthotopique chirurgicale utilisant la méthode de poche de foie peut transplanter la tumeur uveal de mélanome uastatique de foie humain dans le foie de souris avec un taux de succès élevé de 80% dans un délai de six mois. La tumeur de xénogreffe s'engrafte dans le foie comme tumeur solitaire sans nodules de fille (figure 1 et figure 3A). La technique d'injection orthotopique chirurgicale dans le foie à l'aide de mi...
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Discussion
Les modèles actuels de xénogreffe orthotopique sont laborieux, longs et coûteux à créer. Les modèles orthotopiques de souris de xénogreffe de tumeur pour le cancer du foie ont été établis il y a plus de deux décennies19,20,21. Cependant, cette technique est compliquée et nécessite l'utilisation d'équipements spéciaux, tels qu'un porte-aiguilles et 6-0 à 8-0 sutures fines au microscope. La tumeur et le tissu hépatique normal doiv...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Nous sommes reconnaissants à M. Ohara, K. Saito et M. Terai d'avoir examiné le manuscrit. Les auteurs reconnaissent l'examen critique pour l'aide éditoriale et anglaise de ce manuscrit par le Dr R. Sato au Fox Chase Cancer Center. Les travaux décrits ci-contre ont été soutenus par le Bonnie Kroll Research Fund, le Mark Weinzierl Research Fund, le Eye Melanoma Research Fund de l'Université Thomas Jefferson, la Osaka Community Foundation et le JSPS KAKENHI Grant Number JP 18K15596 à Osaka City Université. Les études menées dans le laboratoire du Dr A. Aplin ont été appuyées par la subvention des NIH R01 GM067893. Ce projet a également été financé par un Dean's Transformative Science Award, un Thomas Jefferson University Programmatic Initiative Award.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Matériaux, tissus et animaux | |||
| Buprénorphine | |||
| CO2 réservoir | |||
| Cryomedium | |||
| Exitron nano 12000 (Agent de contraste à base de nanoparticules alcalino-terreuses) | Miltenyl Biotec | 130-095-700 | |
| HBSS 1x, avec calcium & magnésium | Corning | 21-020-CM | |
| Foie humain Mélanome uvéal métastatique Lignée | |||
| uvéal humain Tissu du foie | Toute manipulation des tissus doit être effectuée dans une cagoule de niveau de biosécurité 2. Soyez prudent lorsque vous travaillez avec des tissus humains ; Utilisez toujours des gants et évitez tout contact direct avec la peau. Supposer que les patients ont pu être infectés par le VIH ou d’autres organismes hautement transmissibles. Ne traitez pas d’échantillons connus pour être porteurs d’infections. | ||
| Iode | |||
| Isoflurane | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| Isopropanol | Fisher scientific | A416-1 | Éviter le contact direct avec la peau et les yeux et l’inhalation d’un agent anesthésique. |
| Azote | |||
| Matrigel HC | BD | 354248 | |
| NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) souris | Jackson Lab | 5557 | 4 à 8 semaines |
| PBS 1x, sans calcium ni magnésium | Corning | 21-031-CM | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-013-CV | |
| Tampon de préparation à l’alcool stérile (alcool isopropylique à 70 %) | Produits Nice-Pak | B603 | |
| Solution tampon de phosphate de paraformaldéhyde à 4 % | Wako | 163-20145 | |
| Solution d’alcool éthylique à 70 % | Fisher Scientific | 04-355-122 | |
| Nom | Numéro de catalogue | Comments | |
| >Equipments | |||
| Hémostat résorbable | Johnson and Johnson | 63713-0019-61 | |
| Autoclave | |||
| Mesure | |||
| Cautery | Bovie Medical | MC-23009 | |
| Compteur | |||
| Centrifugeur | |||
| Coton-tige | |||
| Conteneur de congélation | cryogénique NALGENE | 5100-0001 | |
| Cryotube | SARSTEDT | 72.379 | |
| Ciseaux courbes | World Precision Instruments | 503247 | |
| Pince ultrafine incurvée | World Precision Instruments | 501302 | |
| Feuille | |||
| Congélateur | |||
| F/AIR Filtre Cartouche | Harvard Apparatus | 600979 | |
| Coussin | |||
| Vaporisateur d’isoflurane | Artisan Scientific | 66317-1 | |
| Azote | |||
| Pot d’azote liquide | Thermo Fisher Scientific | 2123 | |
| Micro-CT scan | Siemens | ||
| Porte-aiguille | World Precision Instruments | 501246 | |
| Boîtes de Pétri | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Pipette | |||
| Flacon | |||
| Capot stérile Armoire | de niveau de biosécurité 2 | ||
| Scalpel stérile n°11 | AD Chirurgical | A300-11-0 | |
| Pince droite | World Precision Instruments | 14226 | |
| Champ | |||
| Frein de veine caudale | Braintree Scientific | TV-150-STD | |
| Bain-marie | |||
| 1 mL Seringue TB avec aiguille 27 G | BD | 309623 | |
| tube de 1,7 mL | Bioexpress | C-3260-1 | |
| 5-0 PDO Suture | AD Chirurgicale | S-D518R13 | |
| 15 mL tubes coniques | AZER SCIENTIFIC | ES-9152N | |
| Aiguille 27 G | BD | 780301 | |
| 27 G Aiguille | Hamilton | 7803-01 | |
| 50 mL Tubes coniques | AZER SCIENTIFIC | ES-9502N | |
| 50 µ ; L micro seringue | BD | 80630 | |
| 50 µ ; L micro seringue | Hamilton | 7655-01 | |
| Récipient de 100 mL | Fisher Scientific | 12594997 | |
| 200&mu ; Embout |
Références
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