A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene

Huilin Wang; Xiaofan Zhu; Baoheng Gui; Wan  Chee Cheung; Mengmeng Shi; Zhenjun Yang; Ka Yin Kwok; Ricky Lim; Sanna Pietilä; Yuanfang Zhu; Kwong Wai Choy

doi:10.3791/59963

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Article de méthode

A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene

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DOI :

10.3791/59963

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16 septembre 2019

Huilin Wang^*¹ , Xiaofan Zhu^*²^,³ , Baoheng Gui^*³^,⁴ , Wan Chee Cheung² , Mengmeng Shi²^,³ , Zhenjun Yang²^,³ , Ka Yin Kwok² , Ricky Lim⁵ , Sanna Pietilä⁵ , Yuanfang Zhu⁶^,⁷ , Kwong Wai Choy²^,³

¹Central Laboratory, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, ²Department of Obstetrics and Gynaecology, The Chinese University of Hong Kong, ³Shenzhen Research Institute, The Chinese University of Hong Kong, ⁴Department of Genetics and Metabolism, Maternal and Child Health Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, ⁵PerkinElmer Diagnostics, ⁶Department of Obstetrics and Gynecology, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, ⁷Maternal-Fetal Medicine Institute, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Un test précis et robuste basé sur la réaction en chaîne de polymérase pour quantifier les répétitions de trinucleotide cytosine-guanine-guanine dans le gène fragile x de retardmental-1 facilite le diagnostic moléculaire et le criblage du syndrome de LX fragile et du X fragile-connexe avec un délai d'attente plus court et des investissements dans l'équipement.

Résumé

Le syndrome de X fragile (FXS) et les désordres associés sont provoqués par l'expansion du cytosine-guanine-guanine (CGG) répétition de trinucleotide dans la région non traduite de 5' (UTR) du retardement mental fragile x-1 (FMR1) promoteur de gène. Traditionnellement, l'analyse de fragment d'électrophoresis capillaire sur un analyseur génétique est utilisée pour le dimensionnement des répétitions CGG de FMR1, mais une analyse supplémentaire de tache méridionale est nécessaire pour la mesure exacte lorsque le nombre de répétition est supérieur à 200. Ici, nous présentons une méthode précise et robuste de réaction en chaîne de polymérase (PCR) pour quantifier les répétitions de CGG de FMR1. La première étape de ce test est l'amplification PCR des séquences répétitifs dans le 5'UTR du promoteur FMR1 à l'aide d'un kit Fragile X PCR, suivie de la purification des produits PCR et du dimensionnement par fragment sur un instrument d'électrophorèse capillaire microfluidique, et l'interprétation ultérieure du nombre de répétitions cGG en faisant référence à des normes avec des répétitions connues à l'aide du logiciel d'analyse. Cet analyse à base de PCR est reproductible et capable d'identifier toute la gamme des répétitions CGG des promoteurs FMR1, y compris ceux avec un nombre répété de plus de 200 (classés comme mutation complète), 55 à 200 (prémutation), 46 à 54 (intermédiaire), et 10 à 45 (normal). Il s'agit d'une méthode rentable qui facilite la classification des troubles associés au FXS et à l'X fragile avec robustesse et temps de déclaration rapide.

Introduction

Le syndrome de L'X fragile (FXS) et les troubles associés à l'X fragile, par exemple, le syndrome des tremblements et de l'ataxie (FX-TAS) et l'insuffisance ovarienne primaire (FX-POI) sont principalement causés par l'expansion du trinuccléotide cytosine-guanine-guanine (CGG) dans le 5' non traduit région (UTR) du fragile X mental retardation-1 (FMR1) gène sur Xq27.3¹^,². La protéine codée FMR1 (FMRP) est une protéine liant l'ARN associée au polyribosome qui fonctionne dans le développement neuronal et la plasticité synaptique en régulant l'épissage alternatif, la stabilité, et le transport de....