Exécution des xénogreffes de muscle squelettique humain dans les souris immunodéficientes

Il a été signalé que seulement 13,8 % de tous les programmes de développement de médicaments faisant l'objet d'essais cliniques sont couronnés de succès et mènent à des thérapies approuvées¹. Bien que ce taux de réussite soit supérieur aux 10,4 % précédemment déclarés^2,il y a encore beaucoup de place à l'amélioration. Une approche pour augmenter le taux de réussite des essais cliniques consiste à améliorer les modèles de laboratoire utilisés dans la recherche préclinique. La Food and Drug Administration (FDA) exige que des études sur les animaux montrent l'efficacité du traitement et évaluent la toxicité avant les essais cliniques de phase 1. Cependant, il y a souvent une concordance limitée dans les résultats du traitement entre les études sur les animaux et les essais cliniques³. En outre, la nécessité d'études précliniques sur les animaux peut constituer un obstacle insurmontable au développement thérapeutique dans les maladies qui n'ont pas de modèle animal accepté, ce qui est souvent le cas pour les maladies rares ou sporadiques.

Une façon de modéliser la maladie humaine est de transplanter des tissus humains dans des souris immunodéficientes pour générer des xénogreffes. Il y a trois avantages principaux aux modèles de xénogreffe : premièrement, ils peuvent récapituler les anomalies génétiques et épigénétiques complexes qui existent dans la maladie humaine qui peuvent ne jamais être reproductibles dans d'autres modèles animaux. Deuxièmement, les xénogreffes peuvent être utilisées pour modéliser des maladies rares ou sporadiques si des échantillons de patients sont disponibles. Troisièmement, les xénogreffes modéliser la maladie dans un système in vivo complet. Pour ces raisons, nous émettons l'hypothèse que les résultats d'efficacité du traitement dans les modèles de xénogreffe sont plus susceptibles de se traduire par des essais chez les patients. Les xénogreffes de tumeur humaine ont déjà été utilisées avec succès pour développer des traitements pour les cancers communs, y compris le myélome multiple, aussi bien que des thérapies personnalisées pour les patients individuels^{4,5,6, 7}.

Récemment, les xénogreffes ont été utilisées pour développer un modèle de maladie musculaire humaine⁸. Dans ce modèle, des spécimens de biopsie de muscle humain sont transplantés dans les membres postérieurs des souris immunodéficientes de NRG pour former des xénogreffes. Les myofibres humaines transplantées meurent, mais les cellules souches de muscle humain présentes dans le xénogreffe se développent et se différencient par la suite en nouveaux myofibers humains qui repeuplent la lame basale humaine greffée. Par conséquent, les myofibres régénérées dans ces xérogreffes sont entièrement humaines et sont spontanément revascularisées et innervées par l'hôte de souris. Fait important, la dystrophie musculaire fascioscapulohumeral (FSHD) tissu musculaire patient transplanté chez des souris récapitule les caractéristiques clés de la maladie humaine, à savoir l'expression du facteur de transcription DUX4 ⁸. FSHD est causée par la surexpression de DUX4, qui est épigénétiquement réduit au silence dans le tissu musculaire normal^9,10. Dans le modèle de xénogreffe de FSHD, le traitement avec un morpholino DUX4-spécifique a été montré pour réprimer avec succès l'expression et la fonction de DUX4, et peut être une option thérapeutique potentielle pour des patients de FSHD^11. Ces résultats démontrent que les xénogreffes musculaires humaines sont une nouvelle approche pour modéliser la maladie musculaire humaine et tester des thérapies potentielles chez la souris. Ici, nous décrivons en détail la méthode chirurgicale pour créer des xénogreffes de muscle squelettique humain dans les souris immunodéficientes.

Toute utilisation de spécimens de recherche provenant de sujets humains a été approuvée par la Johns Hopkins Institutional Review Board (IRB) pour protéger les droits et le bien-être des participants. Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université Johns Hopkins (IACUC) conformément au Guide des National Institutes of Health (NIH) pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire. Les souris hôtes mâles NOD-Rag1^nullIL2rMD (NRG) (8-12 semaines) sont utilisées pour effectuer des expériences de xénogreffe. Ces souris sont logées dans des grilles ventilées et reçoivent de l'air hePA filtré, trempé et humidifié ainsi que de l'eau hyperchlorée filtrée par osmose inverse. Les souris reçoivent de l'eau et un régime antibiotique irradié (Table of Materials) ad libitum, et l'installation fournit 14 h de lumière à 10 h d'obscurité contrôlée par minuterie centrale.

1. Préparation de l'équipement

1. Acquérir noD-Rag1^nullIL2r -^null (NRG) souris, 8-12 semaines d'âge.
2. Équipement chirurgical autoclave : ciseaux, forceps, porte-aiguille, agrafeuse chirurgicale(Table of Materials),pinces pour plaies, lingettes chirurgicales (Table of Materials) et bécher ( Figure1A).
3. Préparer 50 ml de milieux musculaires (20% de sérum bovin fœtal, 2% d'extrait d'embryon de poussin, 1% d'antibiotique/antimycotique dans Hams F10 Medium). Gardez tous les produits chimiques/médicaments/solutions utilisés pour la chirurgie à température ambiante à moins d'être indiqués différemment dans le protocole.
4. Préparer une seringue de 1 ml avec une aiguille de 26 G de 3/8 pouces de long contenant 2 mg/mL analgésiques (Tableau des matériaux),et placer sur la glace. L'analgésique peut être dilué à la concentration appropriée à l'aide de phosphate stérile tamponné saline (PBS).

2. Préparation chirurgicale

1. Obtenir une biopsie musculaire humaine en vertu d'un protocole approuvé par l'IRB de patients dont les muscles affichent la force 'gt; 4-/5 sur le MRC (Conseil de recherches médicales) échelle¹². Placez le spécimen de recherche dans un plat Petri de 100 mm x 15 mm contenant des milieux musculaires.
   REMARQUE: L'échelle de MRC est utilisée dans la pratique clinique comme une évaluation de la force musculaire avec 0 ne montrant aucune contraction, 5 montrant la puissance normale, et 4 (4 à 4) montrant le mouvement contre la résistance¹². Nous avons constaté que les muscles avec une faiblesse légère à modérée (MRC 'gt; 4-/5) montrent généralement la pathologie de la maladie, mais ne sont pas largement remplacés par des tissus adipeux ou la fibrose, qui entravent la régénération du xénogreffe. Dans le cas du tissu d'autopsie où un score récent de MRC n'est pas disponible, la qualité de muscle peut être accessible par l'observation brute. Les biopsies musculaires qui sont rose pâle en apparence ou qui ont de grandes zones de tissu adipeux ne sont pas susceptibles de se greffer avec succès.
2. Enlever tout fascia ou tissu adipeux restant du spécimen à l'aide de ciseaux chirurgicaux à l'aide d'un microscope stéréo et d'une source de lumière pour faciliter la visualisation.
3. Disséquez la biopsie musculaire en morceaux d'environ 7 mm x 3 mm x 3 mm à l'aide de ciseaux chirurgicaux à l'aide du microscope stéréo et d'une source lumineuse. Assurez-vous que les fibres sont disposées longitudinalement dans le spécimen.
4. Placer le plat Petri contenant du muscle disséqué sur la glace. En moyenne, les xénogreffes sont gardées dans les médias pendant 4 heures pendant que les chirurgies sont effectuées. Cependant, les biopsies ont été stockées dans les médias pendant 24 h avant le xénogreffe, et ce retard ne semble pas avoir d'impact négatif sur la transplantation ou la régénération.
5. Placer les sutures synthétiques non absorbables(tableau des matériaux)dans un plat Petri de 100 mm x 15 mm contenant 70 % d'éthanol.
6. Mettre en place un circuit d'anesthésie à double procédure : disposer le circuit respiratoire Mapleson E sur le microscope stéréo et placer la chambre d'induction dans un cabinet de biosécurité (Figure 1A,B).
7. Obtenir le poids de la souris NRG en plaçant dans un bécher autoclaved sur une balance, et le transférer à la chambre d'induction. Induire l'anesthésie sous 3% isoflurane. Une fois que la profondeur anesthésique appropriée est atteinte, telle qu'évaluée par l'observation de la fréquence respiratoire, de la relaxation musculaire et du manque de mouvement volontaire, réduisez le réglage du vaporisateur à 1,5 % pour le reste de la chirurgie.
8. Transférer la souris de la chambre d'induction au circuit respiratoire Mapleson E et appliquer la pommade ophtalmique sur les yeux.
9. Enlever les cheveux recensant la tibialis antérieure (TA) de la cheville au genou avec un tailleur, suivi d'un traitement de 1 min avec lotion d'épilation (Tableau des matériaux) (Figure 2A).
10. Désinfecter le site chirurgical en écouvillonnant la jambe avec une solution povidone-iode. Ensuite, lavez le reste de l'iode povidone avec 70% d'éthanol.
11. Injecter la souris sous-cutanée avec des analgésiques, tels que le carprofène, (Tableau des matériaux) à une dose de 5 mg/kg.

3. Chirurgie de Xénogreffe

1. Tapez la jambe et faites une incision droite sur le muscle antérieur tibilalis (TA) avec des ciseaux et des forceps d'iris provenant des tendons distal et se terminant sous le genou (Figure 2B).
2. Séparer la peau du muscle à l'aide d'une dissection émoussée avec des ciseaux chirurgicaux.
3. Couper à travers l'épimysium du muscle TA avec des ciseaux commençant au tendon et se terminant au genou.
   REMARQUE: Il s'agit d'une coupe très superficielle (moins de 0,5 mm; Figure 2B, ligne pointillée noire), et le TA sous-jacent ne devrait pas être endommagé dans le processus car cela rendrait l'enlèvement plus difficile. Lorsqu'elles sont exécutées correctement, les fibres musculaires se détendreont visiblement.
4. Couper le tendon distal du TA avec des ciseaux, saisir le tendon avec des forceps d'iris, et tirer le TA vers le genou (Figure 2C).
5. Couper le tendon distal de l'extenseur digitorum longus (EDL) avec des ciseaux et tirer l'EDL vers le genou (Figure 2D). Une fois que le tendon proximal du muscle du peronus longus (PL) est visible, retirez l'EDL avec des ciseaux (Figure 2D, ligne pointillée verte).
6. Retirez le TA à l'aide de ciseaux(Figure 2D, ligne pointillée bleue) et utilisez une lingette chirurgicale mouillée avec du PBS et une légère pression pour atteindre l'hémostasie (Figure 2E).
7. Enfiler une suture à travers le tendon du peron éponomique proximal (PL) tendon et garniture, laissant environ 1,5 pouce de fil de chaque côté du tendon (Figure 2F).
8. Effectuer la première moitié d'un noeud carré chirurgical à deux mains, mais ne serrez pas: cela formera un cercle. Placez un xénogreffe dans ce cercle et serrez la boucle pour fixer le xénogreffe. Complétez l'autre moitié du noeud carré (Figure 2G,H). Ceci suturera le xénogreffe au tendon proximal du PL.
9. Fil suture à travers le tendon Distal PL et répéter la technique noeud carré de l'étape 3.8 pour attacher le xénogreffe au tendon distal (Figure 2H,I).
   REMARQUE: L'artère tarse médiale et la veine peuvent se trouver près ou au-dessus du tendon distal du PL. Ne placez pas de sutures à travers ou autour de ces vaisseaux. Il est facile de dire si une suture a été mal placée car les vaisseaux blanchiront ou saigneront. Si cela se produit, retirez la suture et placez-la à un endroit différent.
10. Tirez la peau sur le muscle xénogreffe, scellez avec de la colle chirurgicale, et placez 2-3 agrafes chirurgicales au-dessus de l'incision (figure 2J).
11. Placer la souris dans une cage propre sur un coussinet chauffé pour récupérer. Surveillez la souris jusqu'à ce qu'elle soit pleinement consciente et périodique au cours des prochains jours pour détecter les signes d'infection systémique locale et pour s'assurer que le site chirurgical n'est pas rouvert.
    REMARQUE: Une seule dose d'analgésique telle que décrite à l'étape 2.11 est généralement suffisante pour soulager la douleur. Cependant, les souris devraient également être surveillées pour la douleur persistante (par exemple la boiterie, le manteau ébouriffé, la posture voûtée), et, si nécessaire, re-dosed avec analgésique à 24 h postopératoirement.

4. Collection Xenograft

REMARQUE: Les xénogreffes sont généralement recueillies entre 4 et 6 mois après la chirurgie. Cependant, les collections ont été effectuées jusqu'à 12 mois après la chirurgie.

1. Placer un bécher couvert contenant 200 ml de 2 méthylbutane dans une boîte contenant de la glace sèche pendant au moins 30 minutes avant la collecte du xénogreffe.
2. Induire l'anesthésie sous 3% isoflurane dans la chambre d'induction. Une fois que la profondeur anesthésique appropriée est atteinte, réduire le réglage vaporisateur à 1,5% pour le reste de la chirurgie.
3. Transférer la souris de la chambre d'induction au circuit respiratoire Mapleson E disposé sur un microscope stéréo.
4. Enlever les cheveux qui recèlent la tibialis antérieure de la cheville au genou avec un taille-cheveux et une lotion d'épilation. Les sutures qui maintiennent le xénogreffe en place peuvent être vues à travers la peau (Figure 3A).
5. Tapez la jambe et utilisez des ciseaux et des forceps d'iris pour ouvrir la peau sur le xénogreffe jusqu'à ce que les deux sutures soient visibles (Figure 3B). La peau qui recèle le xénogreffe peut être enlevée comme indiqué pour faciliter l'ablation du xénogreffe.
6. Utilisez un scalpel pour couper entre le xénogreffe et le tibia(Figure 3B, flèche désigne le site initial et la direction de l'incision). Cela libérera un côté de la xénogreffe.
7. Utilisez un scalpel pour couper entre le muscle PL et le muscle gastrocnemius (Figure 3C, incision le long de l'épimysium étiqueté avec flèche). Le PL sera enlevé avec le xénogreffe.
8. Couper en dessous de la suture distale et à travers le tendon distal du PL(Figure 3D, coupé le long de la ligne pointillée).
9. Retirez le xénogreffe et le PL en saisissant la suture avec des forceps d'iris et en la déviant vers le genou tout en utilisant des ciseaux pour la couper du muscle sous-jacent (Figure 3E).
10. Couper au-dessus de la suture proximale avec des ciseaux pour enlever le xénogreffe et Le PL(Figure 3F, coupé le long de la ligne pointillée en 3E).
11. Placez le spécimen sur un petit morceau de carton ou de plastique, et épinglez le plus près possible des sutures. Tout en épinglant le spécimen, étirer doucement le muscle pour s'assurer que l'orientation de la fibre est maintenue pendant le processus de congélation. Une fois que les broches sont solidement en place, faites glisser le muscle vers le haut des broches de sorte qu'il repose juste au-dessus du carton.
    REMARQUE: Alternativement, une extrémité du xénogreffe peut être montée dans le tragacanth sur un liège, ou elle peut être immergée entièrement dans le composé optimal de température de coupe (O.C.T.) dans un cryomold. Avec soin, la conformation musculaire peut être maintenue avec les deux méthodes.
12. Snap geler le xénogreffe en 2-méthylbutane pré-réfrigéré.
13. Conserver le xénogreffe à -80 oC.
14. Immédiatement après la collecte de xénogreffes, euthanasiez les souris conformément aux directives de l'American Veterinary Medical Association :
    1. Placer les souris dans une chambre scellée avec un système approprié de récupération de gaz résidueux. Utiliser l'isoflurane à une concentration de 3-4% pour induire l'anesthésie.
    2. Une fois que la profondeur anesthésique appropriée est atteinte, telle qu'évaluée par l'observation de la fréquence respiratoire, de la relaxation musculaire et du manque de mouvement volontaire, augmente zetatif à 5 % pour induire la mort. Laissez les souris dans la chambre pendant 2 min supplémentaires après l'arrêt de la respiration. La mort est vérifiée en observant que les souris ne parviennent pas à récupérer dans les 10 minutes après une surdose d'isoflurane.
    3. Enfin, effectuer la dislocation cervicale sur les souris.
       REMARQUE: Dans le cas des souris bilatéralement xénogreffes, le xénogreffe contralatéral peut être sauvé pour une collection postérieure. Pour effectuer une collection de survie, ouvrez la peau au-dessus du xénogreffe avec une seule coupe droite avec des ciseaux chirurgicaux, et retirez le xénogreffe tel que décrit dans les étapes 4.6 à 4.10. Fermez ensuite la peau sur le compartiment tibial vide à l'aide de colle chirurgicale et d'agrafes. Traiter la souris avec un analgésique tel que décrit à l'étape 2.11 et placer la souris dans une cage propre sur un coussin chauffant pour récupérer. Surveillez la souris jusqu'à ce qu'elle soit pleinement consciente et périodique au cours des prochains jours pour détecter les signes d'infection systémique locale et pour s'assurer que le site chirurgical n'est pas rouvert.

5. Immunohistochimie De Xénogreffe

1. Utilisez un cryostat pour couper des sections de 10 à 12 m du xénogreffe collecté sur des diapositives chargées positivement(tableau des matériaux).
2. Remplir le pot de coloration de méthanol et pré-refroidir à -20 oC pendant 30 min.
3. Placer les glissières dans du méthanol glacé pendant 10 min pour fixer et perméabiliser les sections de xénogreffe.
4. Placer les glissières dans un bocal à coloration et laver 3x avec du phosphate tamponné salin (PBS) pendant 5 min.
5. Bloc avec l'anti-souris IgG (Table of Materials) pour 2 h à 4 oC.
6. Blot avec des anticorps primaires, tels que la spectrine, lamin A /C, et la myosine embryonnaire (Tableau des matériaux) en PBS complété avec 2% sérum de chèvre pendant la nuit à 4 oC.
7. Placer les glissières dans un bocal à coloration et laver 3x avec du phosphate tamponné salin (PBS) pendant 5 min.
8. Blot avec des anticorps secondaires conjugués fluorescents-teintures (tableau des matériaux) dans PBS complété avec le sérum de chèvre de 2% pendant 1 h à la température ambiante.
9. Placer les glissières dans un bocal à coloration et laver 3x avec du phosphate tamponné salin (PBS) pendant 5 min.
10. Placez le milieu de montage(Table of Materials)sur les sections de xénogreffes, placez le bordereau sur le dessus, et utilisez le vernis à ongles pour sceller le bordereau.

Figure 2 : Chirurgie de xénogreffe. (A) Les cheveux sont retirés du site chirurgical. (B) Une incision est faite sur le tibialis antérieur (TA). Les tendons distal du TA et de l'extenseur digitorum longus (EDL) sont marqués de flèches. La ligne pointillée noire indique où l'épimysium sera coupé à l'étape 3.3. (C) Le tendon distal du TA est coupé et le muscle est tiré vers le haut au genou. (D) Le tendon de l'EDL est coupé et l'EDL est tiré jusqu'au genou. Ceci expose le tendon proximal du peron longus (PL) marqué d'une flèche. Les lignes en pointillés indiquent où couper avec des ciseaux pour enlever l'EDL (vert) et le PL (bleu). (E) L'EDL et le TA sont supprimés. (F) Une suture est placée par le tendon proximal du PL. (G) Le xénogreffe est placé dans le compartiment tibial vide et suture au tendon proximal de PL utilisant un noeud carré chirurgical à deux mains. (H) Une suture est placée par le tendon distal du PL, marqué d'une flèche, et un autre noeud carré chirurgical à deux mains est employé pour suturer le xénogreffe au tendon distal. (I) Le xénogreffe est entièrement transplanté et sutureà la PL. (J) La peau est fermée avec de la colle chirurgicale. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Collection Xenograft de 4 mois. (A) Les cheveux sont retirés du site chirurgical. Les sutures sont visibles sous la peau. (B) La peau qui recèle le xénogreffe est enlevée. Ensuite, le xénogreffe est saisi avec les forceps de l'iris à la suture distale et doucement tiré vers le haut. À partir de la cheville, un scalpel est utilisé pour couper le long du tibia et libérer le xénogreffe. La flèche montre le début de l'incision le long du tibia. (C) En tirant le muscle gastrocnemius sur le côté, une faible ligne blanche d'épimysium séparant le muscle du peronus longus (PL) et le gastrocnemius (montré par la flèche) devient visible. Utilisez le scalpel pour couper le long de cette ligne pour séparer le PL des autres muscles des jambes. (D) Le côté droit de la xénogreffe, et le PL sont maintenant libres des autres muscles de la jambe et sont prêts pour l'enlèvement. La ligne pointillée indique où couper avec des ciseaux chirurgicaux pour commencer à enlever le xénogreffe et PL. (E) Après avoir coupé au-dessous de la suture distale, dévier le xénogreffe vers le genou. La ligne pointillée indique où couper avec des ciseaux chirurgicaux pour enlever le xénogreffe et le PL du compartiment tibial. (F) Le compartiment tibial vide avec le xénogreffe et le PL ont réussi à enlever. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Comme l'a démontré Yuanfan Zhang et coll., ce protocole chirurgical est une méthode simple pour produire des xénogreffes musculaires squelettiques humaines8. Les xénogreffes régénérés deviennent spontanément innervés et affichent la contractilité fonctionnelle. En outre, le muscle xénografted des patients de FSHD récapitule des changements dans l'expression de gène observédans les patients de FSHD8.

Dans notre expérience, approximativement 7 sur 8 xénogreffes exécutées des spécimens de patient de contrôle montreront l'engraftment réussi de muscle. Un xénogreffe réussi montre la régénération robuste des myofibres humaines identifiées avec des anticorps spécifiques humains (figure 4). La coloration embryonnaire positive de la myosine dans une proportion de myofibres indique que le processus de régénération est toujours en cours. En revanche, une mauvaise technique chirurgicale ou un spécimen inadéquat peut conduire à une mauvaise régénération des fibres musculaires (figure 4).

Les xénogreffes exécutées d'un patient diagnostiqué avec une myopathie inflammatoire idiopathique (IIM) montrent des nombres modérés de myofibers humains régénérés aux collections de 4 et 6 mois, et la coloration embryonnaire de myosine persiste à 6 mois(figure 5A). Les cellules inflammatoires sont présentes dans le xénogreffe comme le montre la coloration de h et E (figure 5A), et ont été confirmées avec CD3, CD68, et d'autres marqueurs immunologiques (données non montrées). Les xénogreffes sont stables au sein de la souris, et des collections allant jusqu'à 12 mois ont été effectuées. La taille individuelle de myofiber est comparable entre les xénogreffes iIM de 4 et 6 mois et la biopsie patiente d'IIM originale (figure 5B). Des fibres rares montrant une zone transversale (ASC) supérieure à 3500 m2 sont observées dans les xénogreffes, mais pas dans la biopsie iIM, ce qui indique que certaines myofibres dans les xénogreffes peuvent se régénérer à un CSA comparable en taille aux myofibres saines (Figure 5B ).

Figure 1 : Mise en place chirurgicale.
A) Orientation standard du microscope stéréo, du circuit respiratoire Mapleson E et des outils chirurgicaux pendant la chirurgie du xénogreffe. B) Placement de la chambre d'induction dans l'armoire de biosécurité.

Figure 4 : Résultats positifs et négatifs attendus.
Les xénogreffes recueillies 4 mois après la chirurgie montrant une bonne ou une mauvaise régénération sont tachées de lamin A/C spécifique à l'homme (1:50) et de spectrine spécifique à l'homme (1:20) et de myosine embryonnaire (1:10)(tableau des matériaux). Les régions indiquées par les boîtes pointillées blanches sont indiquées sous forme d'inserts de grossissement plus élevés. Barre d'échelle : 200 m. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5 : Régénération du Xenogreffe représentatif.
A) Xénogreffes (décrites avec des lignes pointillées) exécutées à partir d'un patient diagnostiqué avec une myopathie inflammatoire idiopathique (IIM) souillée avec l'hématoxylin et l'éosine (H et E), la lamin a/C spécifique humaine, et la spectrine spécifique humaine, montrent la formation de myofiber chez les souris NRG à des moments de 4 et 6 mois. La coloration de la myosine embryonnaire démontre que la régénération est toujours en cours aux deux moments. Barre d'échelle : 200 m. B) Histogrammes représentant la zone transversale sectionnelle (CSA) des myofibers des xénogreffes de 4 et 6 mois et des biopsies humaines d'un patient diagnostiqué avec une myopathie inflammatoire idiopathique (IIM) et d'un patient témoin sain. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.