Analyse du microbiote à l'aide de PCR en deux étapes et de la prochaine génération 16S rRNA Gene Sequencing

Résumé

Décrit ici est une procédure d'exploitation standard simplifiée pour le profilage de microbiome utilisant le séquençage et l'analyse ménomiques rRNA 16S utilisant des outils librement disponibles. Ce protocole aidera les chercheurs qui sont nouveaux dans le domaine du microbiome ainsi que ceux qui ont besoin de mises à jour sur les méthodes pour atteindre le profilage bactérien à une résolution plus élevée.

Résumé

L'intestin humain est colonisé par des milliards de bactéries qui soutiennent les fonctions physiologiques telles que le métabolisme alimentaire, la récolte d'énergie et la régulation du système immunitaire. La perturbation du microbiome intestinal sain a été suggérée pour jouer un rôle dans le développement des maladies inflammatoires, y compris la sclérose en plaques (SEP). Les facteurs environnementaux et génétiques peuvent influencer la composition du microbiome; par conséquent, l'identification des communautés microbiennes liées à un phénotype de la maladie est devenue la première étape vers la définition du rôle du microbiome dans la santé et la maladie. L'utilisation du séquençage métagénomique 16S rRNA pour le profilage de la communauté bactérienne a contribué à faire progresser la recherche sur le microbiome. Malgré son utilisation large, il n'y a pas de protocole uniforme pour l'analyse de profilage taxonomique basée sur l'ARNr16. Une autre limitation est la faible résolution de l'affectation taxonomique en raison de difficultés techniques telles que des lectures de séquençage plus petits, ainsi que l'utilisation de l'avant seulement (R1) lit dans l'analyse finale en raison de la faible qualité de l'inverse (R2) lit. Il est nécessaire d'avoir une méthode simplifiée à haute résolution pour caractériser la diversité bactérienne dans un biospécimen donné. Les progrès de la technologie de séquençage avec la capacité de séquencer des lectures plus longues à haute résolution ont aidé à surmonter certains de ces défis. La technologie actuelle de séquençage combinée à un pipeline d'analyse métagénomique accessible au public, comme l'amplicon de Division Denoising Algorithm-2 (DADA2) basé sur la R, a contribué à faire progresser le profilage microbien à haute résolution, car DADA2 peut assigner une séquence au genre et les niveaux d'espèces. Décrit ici est un guide pour effectuer le profilage bactérien utilisant l'amplification en deux étapes de la région V3-V4 du gène 16S rRNA, suivie d'une analyse utilisant des outils d'analyse librement disponibles (c.-à-d. DADA2, Phyloseq, et METAGENassist). On croit que ce flux de travail simple et complet sera un excellent outil pour les chercheurs intéressés à effectuer des études de profilage du microbiome.

Introduction

Le microbiote désigne une collection de micro-organismes (bactéries, virus, archées, bactériophages et champignons) vivant dans un environnement particulier, et le microbiome fait référence au génome collectif des microorganismes résidents. Comme les bactéries sont l'un des microbes les plus abondants chez l'homme et la souris, cette étude se concentre uniquement sur le profilage bactérien. L'intestin humain est colonisé par des milliards de bactéries et des centaines de souches bactériennes¹. Le microbiote intestinal normal joue un rôle vital dans le maintien d'un état sain dans l'hôte en régulant les fonctions (c.-à-d. le maintien d'une barri....

Protocole

Le protocole a été approuvé par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université de l'Iowa.

1. Collection et manipulation d'échantillons fécaux

1. Stériliser les boîtes de diviseur (voir Tableau des matériaux, Figure supplémentaire 1) avec 70 % d'éthanol.
2. Tubes de microcentrifuge pré-étiquette (un par souris) avec l'iD de l'échantillon et le groupe de traitement (le cas échéant).
3. Placez les souris dans des boîtes de diviseurs stérilisées et laissez-les déféquer normalement jusqu'à 1 h.
4. Recueillir les granulés fécaux dans un tube microcentrif....

Résultats

Comme les molécules de classe II du MHC (HLA chez l'homme) sont des acteurs centraux de la réponse immunitaire adaptative et montrent de fortes associations avec une prédisposition à la SP^24,25,26, on a émis l'hypothèse que la molécule de classe II HLA influencerait la composition microbienne intestinale. Par conséquent, des souris dépourvues du gène de classe II de MHC (AE.KO) ou exprimant le gène humain HLA-DQ8 (HLA-DQ8) ont é.......

Discussion

Le protocole décrit est simple, avec des étapes faciles à suivre pour effectuer le profilage de microbiome utilisant le séquençage métagénomique de rRNA 16S à partir d'un grand nombre de biospécimens d'intérêt. Le séquençage de nouvelle génération a transformé les études sur l'écologie microbienne, en particulier dans les modèles de maladies humaines et précliniques^31,32. Le principal avantage de cette technique est sa capacité à analyser avec succès des composit.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1,5 mL Tube de microcentrisation naturelle	États-Unis, scientifique	1615-5500	Collection fécale
3M raclette applicatrice manuelle PA1-G	3M, MN, US		Squeeger pour une bonne étanchéité de la plaque PCR
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter, IN, USA	A63880	Purification PCR, nettoyage NGS, nettoyage PCR
Agilent DNA 1000 RÉACTIF	Agilent Technologies, CA, États-Unis	5067-1504	Quantification de l’ADN et contrôle de la qualité
Bioanalyseur ADN 1000 puce	Agilent Technologies, CA, USA	5067-1504	Quantification de l’ADN et contrôle de la qualité
Adopter Caps de remplacement	Illumina, Inc., CA, USA	15026762	Nouveau capuchon pour l’amorce d’index 1 et 2 adoptants
DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit	MoBio fait désormais partie de QIAGEN, Valence, CA, États-Unis	12855-100	DNA isolation
KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2x)	Kapa Biosystem, MA, USA	KK2602	PCR ready mix pour Amplicon PCR1 et Indexed PCR2
Lewis Divider Boxes	Lewis Bins, WI, US	ND03080	Collection fécale
Support magnétique	New England BioLabs, MA, USA	S1509S	Pour le nettoyage par PCR MicroAmp
Fast Optical 96-Well Reaction Plate	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, États-Unis	4346906	Plaque PCR
MicroAmp Film adhésif optique	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, États-Unis	4311971	Centrifugeuse de plaque PCR
Microfuge 20	Beckman Coulter, IN, États-Unis	B30154	Centrifugeuse utilisée pour l’isolement de l’ADN
Kit de réactifs MiSeq (600 cycles)v.3	Illumina, Inc., CA, États-Unis	MS-102-3003	Pour le séquençage MiSeq
Kit de préparation de banque d’ADN Nextera XT	Illumina, Inc., CA, USA	FC-131-1001	16S Réservoir de réactifs de préparation de bibliothèque d’ADN rRNA
Plateaux multicanaux	ASI, FL, USA	RS71-1	Pour la mise en commun de PCR2 Plaque de produit
Cetrifuge	Thermo Fisher Scientific, CA, États-Unis	75004393	Pour le mélange de réactifs PCR et l’élimination des bulles d’air de la plaque
PhiX Control	Illumina, Inc., CA, États-Unis	FC-110-3001	Pour le contrôle du séquençage MiSeq Kit de purification de
l’ADN du microbiome	Thermo Fisher Scientific, CA, USA	A29789	Pour la purification du produit PCR1
PowerLyzer 24 Homogénéisateur	Omni International, GA, USA	19-001	Batteur de billes pour l’isolement de l’ADN
Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) kit de dosage	Thermo Fisher Scientific, CA, USA	Q32854	Illumina
	, Inc., CA, USA	FC-130-1005	Pour l’agencement des amorces d’index
Séparateurs verticaux (grands)	Lewis Bins, WI, US	DV-2280	Collection de matières fécales
Séparateurs verticaux (petits)	Lewis Bins, WI, US	DV-1780	Collection de matières fécales

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