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Article de méthode

Synthèse hiérarchique et programmable d'oligosaccharide d'un pot

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DOI :

10.3791/59987

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6 septembre 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Genomics Research Center, Academia Sinica, 2Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, 3Department of Chemistry, Scripps Research Institute, 4Institute of Information Science, Academia Sinica

Dans cet article

Résumé

Ce protocole montre comment utiliser le logiciel Auto-CHO pour la synthèse hiérarchique et programmable d'oligosaccharides. Il décrit également la procédure générale pour les expériences de détermination RRV et la glycosylation d'un pot de SSEA-4.

Résumé

Cet article présente un protocole expérimental général pour la synthèse programmable d'oligosaccharide d'un pot et démontre comment utiliser le logiciel Auto-CHO pour générer des solutions synthétiques potentielles. L'approche programmable de synthèse d'oligosaccharide d'un pot est conçue pour permettre la synthèse rapide d'oligosaccharide de grandes quantités utilisant des blocs de construction de thioglycoside (BBLs) avec l'ordre séquential approprié des valeurs relatives de réactivité (RRV). Auto-CHO est un logiciel multiplateforme avec une interface utilisateur graphique qui fournit des solutions synthétiques possibles pour la synthèse programmable d'oligosaccharide d'un pot en recherchant une bibliothèque BBL (contenant environ 150 BBL validés et 50 000 BBL virtuels) avec régression des vIV par le soutien de la régression vectorielle. L'algorithme de synthèse hiérarchique d'un pot a été implémenté dans Auto-CHO et utilise des fragments générés par des réactions d'un pot comme nouveaux BBLs. En outre, Auto-CHO permet aux utilisateurs de donner des commentaires pour les BBL virtuels pour garder ceux de valeur pour une utilisation ultérieure. La synthèse d'un pot de l'antigène embryonnaire 4 (SSEA-4), qui est un marqueur embryonnaire pluripotent de cellules souches embryonnaires, est démontrée dans ce travail.

Introduction

Les glucides sont omniprésents dans la nature1,2, mais leur présence et leur mode d'action restent un territoire inexploré, principalement en raison de l'accès difficile à cette classe de molécules3. Contrairement à la synthèse automatisée des oligopeptides et des oligonucléotides, le développement de la synthèse automatisée des oligosaccharides reste une tâche formidable, et les progrès ont été relativement lents.

Pour s'attaquer à ce problème, Wong et coll. ont mis au point la première méthode automatisée de synthèse des oligosaccharides à l'aide d'un logiciel programmable appelé Optimer4, qui guide la sélection des BBL à partir d'une bibliothèque de 50 BBL pour un pot séquentiel Réactions. Chaque BBL a été conçu et synthétisé avec une réactivité bien définie accordée par divers groupes de protection. Grâce à cette approche, les complexités de la protection de la manipulation et de la purification intermédiaire peuvent être réduites au minimum lors de la synthèse, qui ont été considérées comme les questions les plus difficiles à surmonter dans le développement de la synthèse automatisée. Malgré cette avancée, la méthode est encore assez limitée, car le nombre de BBL est trop petit et le programme Optimer ne peut gérer que certains petits oligosaccharides. Pour les oligosaccharides plus complexes qui nécessitent plus de BBLs et plusieurs passes de réactions d'un pot et de condensation fragmentaire, une version améliorée du logiciel, Auto-CHO5, a été développé.

Dans Auto-CHO, plus de 50 000 BBL avec une réactivité définie à la bibliothèque BBL ont été ajoutées, dont 154 synthétiques et 50 000 virtuels. Ces BBLs ont été conçus par l'apprentissage automatique basé sur des propriétés de base, les décalages chimiques calculés de RMN6,7, et les descripteurs moléculaires8, qui affectent la structure et la réactivité des BBLs. Avec ce programme amélioré et un nouvel ensemble de BBL disponibles, la capacité de synthèse est augmentée, et comme démontré, plusieurs oligosaccharides d'intérêt peuvent être rapidement préparés. On croit que ce nouveau développement facilitera la synthèse des oligosaccharides pour l'étude de leurs rôles dans divers processus biologiques et de leurs impacts sur les structures et les fonctions des glycoprotéines et des glycolipides. On pense également que ce travail profitera considérablement à la communauté des glycosciences, étant donné que cette méthode est disponible gratuitement pour la communauté de la recherche. La synthèse du marqueur humain essentiel de cellules souches embryonnaires, SSEA-45, est démontrée dans ce travail.

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Protocole

1. Manipulation logicielle Auto-CHO

  1. Installation Java Runtime Environment : assurez-vous que l'environnement De course Java (JRE) a été installé dans l'appareil. Si JRE a été installé, passez à l'étape suivante, « initialisation logicielle »; sinon, téléchargez et installez JRE selon le système d'exploitation de l'utilisateur à l'adresse suivante : https://www.oracle.com/technetwork/java/javase/downloads/index.html.gt;.
  2. Initialisation du logiciel: aller sur le site Auto-CHO à l'un(https://sites.google.com/view/auto-cho/home-gt; et télécharger le logiciel selon le système d'exploitation. Actuellement, Auto-CHO prend en charge Windows, macOS et Ubuntu. Le dernier guide d'utilisation PDF est fourni sur le site Web d'Auto-CHO.
    1. Pour les utilisateurs de Windows, décompresser l'Auto-CHO-Windows.zip et double-cliquez sur Auto-CHO.jar dans le dossier Auto-CHO-Windows pour démarrer le programme.
      REMARQUE: L'utilisateur a besoin d'installer un logiciel de dézip, tels que 7-Zip, trouvé à llt;https://www.7-zip.org 'gt;, pour déballer le fichier zip. L'utilisateur peut également utiliser la commande Java-jar Auto-CHO.jar pour démarrer le programme par la commande DeWindows Prompt.
    2. Pour les utilisateurs de macOS, cliquez à droite sur Auto-CHO.jar et choisissez Open pour démarrer le programme.
    3. Pour les utilisateurs d'Ubuntu :
      1. Installez libcanberra-gtk en utilisant la commande suivante :
        $ sudo apt-get installer libcanberra-gtk
      2. Modifier l'autorisation d'accès d'Auto-CHO-Ubuntu.sh:
        $ chmod 755 Auto-CHO-Ubuntu.sh
      3. Exécuter le programme Auto-CHO :
        $ ./Auto-CHO-Ubuntu.sh
  3. Entrez la structure glycane désirée. Choisissez de dessiner une structure glycane ou de lire un fichier de structure existant.
    1. Entrée par dessin :
      1. Cliquez sur Modifier Glycan par GlycanBuilder9,10 (Figure 1, btn1; Figure 2A) ou la zone de Cliquez ici pour modifier la cible synthétique pour dessiner et modifier la structure de requête par GlycanBuilder. Les informations de liaison et de chiralité ne doivent pas être ignorées. Cliquez sur les boutons Globo-H, SSEA-4ou OligoLacNAc (figure 1, exemples) pour afficher les exemples.
      2. Sélectionner le fichier Exportation vers des formats de séquences Exportation vers GlycoCT condensé pour enregistrer la structure modifiée (facultatif).
      3. Fermez le dialogue GlycanBuilder pour terminer l'édition.
    2. Entrée en lisant un fichier :
      1. Cliquez sur Edit Glycan par GlycanBuilder (Figure 1, btn1; Figure 2A) ou la zone de Click Here pour modifier la cible synthétique pour modifier la structure de requête.
      2. Sélectionner le fichier Importer à partir de formats de séquence pour choisir le fichier de structure de requête avec le format correspondant.
  4. Paramètres de paramètre de recherche (facultatif).
    1. Définissez les paramètres de recherche dans l'onglet «Paramètresde paramètres » (Figure 1, tab2) pour obtenir des résultats de recherche raisonnables.
      note:
      Le seuil de RRV de grande classe doit être un nombre réel et 0.
      Le seuil de RRV de classe moyenne doit être un nombre réel et 0.
      Seuil de Haute Classe RRV devrait être 'gt;Seuil de classe moyenne RRV.
      Le nombre de fragments maximaux doit être un entier et le numéro 1.
      Min BBL Numéro dans un fragment doit être un entier et entre 1 et 3.
      Le nombre maximum de BBL dans un fragment doit être un entier et entre 1 et 3.
      Nombre maximum de BBL dans un fragment doit être le nombre deBBL Min dans un Fragment.
      Min Donor/Acceptor RRV Différence doit être un nombre réel positif.
      Min Donor/Acceptor RRV Ratio doit être un nombre réel positif.
      Max Donor/Acceptor RRV Ratio doit être un nombre réel positif.
      Max Donateur / Acceptor RRV Ratio doit être 'gt;Min Donor/ Acceptor RRV Ratio.
    2. Cliquez sur le bouton OK pour activer les nouveaux paramètres.
  5. Sélectionnez la bibliothèque de blocs de construction (Figure 1, tab5). Le paramètre par défaut est de rechercher la bibliothèque expérimentale uniquement. S'il est souhaité de rechercher les bibliothèques expérimentales et virtuelles, vérifiez les étapes suivantes.
    1. Sélectionnez l'onglet Bibliothèque de blocs de bâtiments virtuels (figure 2C, onglet5). Les blocs de construction expérimentaux et virtuels peuvent travailler ensemble pour améliorer la capacité de recherche d'Auto-CHO. À l'heure actuelle, Auto-CHO fournit plus de 50 000 blocs de construction virtuels avec des VRR prévus dans la bibliothèque.
    2. Sélectionnez Utilisez les bibliothèques expérimentales et virtuelles et appliquez le filtrage pour afficher les blocs de construction virtuels avec certains critères. Cliquez sur le bouton Afficher les BBL virtuels sélectionnés (Figure 2C, btn5) pour afficher uniquement le bloc de construction virtuel sélectionné.s).
    3. Cliquez sur le bouton Afficher les BBL virtuels (Figure 2C, btn6) pour afficher uniquement les blocs de construction virtuels avec certains critères définis par l'utilisateur.
    4. Cliquez sur le bouton Afficher tous les BBL virtuels (Figure 2C, btn7) pour afficher tous les blocs de construction virtuels disponibles et réinitialiser le filtre.
    5. Vérifiez un ou plusieurs blocs de construction virtuels souhaités que l'utilisateur aimerait utiliser pour la recherche.
  6. Sélectionnez l'onglet Structure de requête (figure 1, onglet1) et cliquez sur le bouton Search Building Block Library (Figure 1, btn2) pour trouver les solutions synthétiques d'un pot pour la structure de requête. Ensuite, confirmez les paramètres du paramètre.
  7. Recherchez le visualiseur de résultat.
    REMARQUE : Le résultat de recherche est affiché dans l'onglet Visualisation des résultats (Figure 1, tab6). Les accepteurs finaux réducteurs de différents nombres de résidus sont affichés dans la colonne Reducing End Acceptor (Figure 1, viewer1).
    1. Sélectionnez un accepteur réducteur, et les solutions sont affichées sur la liste de solutions synthétiques (Figure 1, viewer2). Les fragments sont affichés dans la Liste des fragments (Figure 1, viewer3) pour suggérer combien de fragments doivent être utilisés dans la synthèse.
      REMARQUE : Le système fournit des informations détaillées de chaque fragment, y compris le RvR du fragment, le rendement de calcul ainsi que le groupe de protection qui devrait être protégé pour l'utilisation ultérieure du fragment dans la réaction d'un pot. Les blocs de construction utilisés pour assembler le fragment sélectionné sont affichés dans le visualiseur4 de la figure 1. Le visualiseur5 de la figure 1 affiche également les informations de connexion fragment.
    2. Afficher et vérifier les structures chimiques et les informations détaillées sur les blocs de construction sélectionnés dans les régions de la structure chimique de la structure chimique de la construction et du navigateur de blocsde construction , respectivement, pour les blocs de construction expérimentaux (Figure 1, tab4).
  8. Sortie du résultat de recherche sur le texte (facultatif).
    1. Sélectionnez l'onglet Texte de résultat (Figure 1, tab7).
    2. Cliquez sur Enregistrer le texte de résultat ( Figure2B, btn4) et choisissez la destination du fichier texte.
  9. Commentaires pour les blocs de construction virtuels (facultatif).
    REMARQUE : Les commentaires peuvent être donnés sur les blocs de construction virtuels par le biais du questionnaire en ligne. Les commentaires peuvent aider la communauté à conserver des blocs de construction virtuels utiles et à éliminer les blocs de construction inefficaces.
    1. Sélectionnez l'onglet Bloc de bâtiment virtuel ( Figure1, tab5).
    2. Cliquez sur le lien De taux du bloc de construction virtuel dont il est souhaité d'évaluer ou de commenter dans la colonne Commentaires.
    3. Remplissez le formulaire de rétroaction après que le système ouvre une page Web et soumettez-le.
      REMARQUE : Ne modifiez pas l'ID BBL virtuel.

2. Expériences de détermination RRV

  1. Dans un flacon à fond rond de 10 ml, combiner les deux donneurs de thioglycoside (0,02 mmol de chacun : Dr4 est le donneur de référence avec le RRV connu ; Dx1 est la molécule donneuse du RRV inconnu), du méthanol absolu (0,10 mmol) et de la drierite dans le dichlorométhane (DCM, 1,0 mL), puis remuer à température ambiante (RT) pendant 1 h.
  2. Prenez un aliquot de ce mélange (30 l) et injectez le mélange dans la chromatographie liquide de haute performance (HPLC) en trois injections distinctes (10 l pour chaque injection). Mesurer le coefficient (a) entre l'absorption (A) et la concentration de la molécule donneuse [D] dans les conditions de séparation de base (acétate d'éther/n -Hexane 20/80).
  3. Ajouter une solution de 0,5 M N-Iodosuccinimide (NIS) en acétonitrile (40 l, 0,02 mmol) dans le mélange de réaction, suivie de l'ajout d'une solution d'acide trifluoromethanesulfonic (TfOH) de 0,1 M (20 l, 0,002 mmol), et remuer le mélange à RT pendant 2 h.
  4. Diluer le mélange de réaction avec du DCM (4,0 ml), filtrer et laver avec du thiosulfate de sodium saturé contenant 10 % de carbonate d'hydrogène sodium (2x avec 5 ml de volume chacun). Extraire la couche aqueuse avec DCM (3x avec 5 ml). Mélanger toute la couche organique, la laver avec 5 ml de saumure et la sécher avec environ 200 mg de sulfate de magnésium anhydre.
  5. Secouez le mélange légèrement pendant 30 s, filtrez-le à travers un entonnoir avec un papier filtre cannelé afin d'enlever le sulfate de magnésium, puis collectez le filtrate dans un flacon rond de 25 ml. Retirez le solvant à l'aide d'un évaporateur rotatif.
  6. Dissoudre les résidus dans DCM (1,0 ml). Prenez un aliquot de ce mélange (30 l) et injectez-le dans HPLC en trois injections distinctes (10 l pour chaque injection). Mesurer les concentrations des donneurs restants ([Dx] et [Dref]) par HPLC dans les mêmes conditions de séparation (acétate d'éther/n-Hexane 20/80) (Aref)t 24417.0, (Ax)t 23546,3.
  7. Mesurer la réactivité relative entre Dx1 vs Dr4, kx1/kr4 0,0932. Sur la base de la valeur relative de réactivité de Dr4, la valeur relative de réactivité de Dx1 est de 3.
    REMARQUE : a A/[D], (Aref)0 - 74530.1, (Ax)0 - 26143.0. k (en) x/kref (ln[Dx]t - ln[Dx]0)/(ln[Dref]t - ln[Dref]0) - (ln[A x]t - ln[Ax]0)/(ln[Aref]t - ln[Aref]0) - 0,0932.

3. Glycosylation d'un pot de SSEA-4

  1. Placez un flacon à fond rond de 10 ml sous le vide, séchez-le à la flamme et laissez le flacon refroidir à RT tout en continuant à passer sous vide. Retirer le septum en caoutchouc pour ajouter un mélange de disaccharide 1 donneur (38 mg, 1,1 eq., 0,057 mmol), le premier accepteur 2 (40 mg, 1,0 eq., 0,053 mmol) et une barre magnétique enduite de téflon dans le flacon.
  2. Transférer 100 mg de tamis moléculaires en poudre 4 euros dans un flacon à fond rond de 5 ml. Gardez ce flacon sous vide, séchez-le à la flamme et laissez le flacon refroidir à RT tout en sousvide. Transférer les tamis moléculaires fraîchement séchés de 4 euros dans le premier flacon qui contient le matériau de départ.
  3. Transférer 1 ml de DCM fraîchement séché dans le flacon. Remuer le mélange de réaction pendant 1 h à RT, puis le placer à une température de -40 oC. Transférer le NIS (13 mg, 1,1 eq., 0,057 mmol) dans le flacon.
  4. Injecter tfOH (34 l, 0,3 eq., 0,017 mmol, 0,5 M dans l'éther) dans le flacon à l'aide du septum à l'aide d'une seringue micro-volume à -40 oC. Continuer à remuer à -40 oC pendant 3 h.
  5. Après le premier accepteur 2 est presque consommé, injecter la solution de l'accepteur 3 en DCM dans le flacon à travers le septum.
  6. Réchauffer le mélange de réaction jusqu'à -20 oC et transférer le NIS (19 mg, 1,6 eq., 0,083 mmol) dans le flacon. Injecter tfOH (34 l, 0,3 eq., 0,017 mmol, 0,5 M dans l'éther) dans le flacon à travers le septum à -20 oC. Continuer à remuer à -20 oC pendant 3 h.
  7. Après que le produit de la première réaction d'étape soit consommé, étanchez la réaction en injectant deux équivalents d'amine de triéthyle. Retirez les tamis moléculaires à l'eau à l'eau d'un entonnoir de filtre rempli de Celite, collectez le filtrate dans un flacon à fond rond de 25 ml et lavez le filtre avec 10 ml de DCM.
  8. Transférer le filtrate dans un entonnoir séparatiste et le laver avec du thiosulfate de sodium saturé contenant 10 % de NaHCO3 (2x avec 10 ml chacun). Extraire la couche aqueuse avec DCM (3x avec 10 ml). Mélanger les couches organiques et laver le mélange avec de la saumure (10 ml) et le sécher en ajoutant l'anhydre MgSO4. Filtrer et recueillir le filtrate dans un flacon rond de 100 ml.
  9. Retirez le solvant à l'aide d'un évaporateur rotatif. Dissoudre le mélange brut avec environ 1 ml de DCM et le charger sur le dessus du lit de silice. Éluter le produit avec un mélange d'acétate d'éthyle et de toluène (EtOAc/toluène, 1/4 à 1/2) et recueillir les fractions.
  10. Retirez le solvant à l'aide d'un évaporateur rotatif. Sécher les résidus sous pression réduite pour donner entièrement protégé SSEA-4 dérivé 4 (74 mg, 50% basé sur accepteur 2) comme mousse blanche.

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Résultats

Le résultat de recherche Auto-CHO basé sur les paramètres par défaut indique que SSEA-4 peut être synthétisé par une réaction d'un pot [2 à 1 3]. La figure 3 montre la capture d'écran logicielle du résultat de recherche SSEA-4. Lorsqu'un accepteur final de réduction du trisaccharide est sélectionné(figure 3, étiquette 1), le programme présente quatre solutions potentielles pour la requête. La première solution a un fragment (

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Discussion

Le logiciel Auto-CHO a été développé pour aider les chimistes à procéder à la synthèse hiérarchique et programmable d'oligosaccharides5. Auto-CHO a été construit par le langage de programmation Java. Il s'agit d'un logiciel GUI et multi-plateforme, qui prend actuellement en charge Windows, macOS, et Ubuntu. Le logiciel peut être téléchargé gratuitement pour le site Web auto-CHO à l'adresse suivante : https://sites.google.com/view/auto-cho/home-gt;, et son code source avec licence MIT peut être con...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Ce travail a été appuyé par l'Academia Sinica, y compris le Programme du Sommet, le ministère des Sciences et de la Technologie [MOST 104-0210-01-09-02, MOST 105-0210-01-13-01, MOST 106-0210-01-15-02] et NSF (1664283).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AcétonitrileSigma-Aldrich75-05-8
Sulfate de magnésium anhydreSigma-Aldrich7487-88-9
Cérium et molybdate d’ammoniumTCIC1794
DichlorométhaneSigma-Aldrich75-09-2
DryériteSigma-Aldrich7778-18-9
Acétate d’éthyleSigma-Aldrich141-78-6
MéthanolSigma-Aldrich67-56-1
Tamis moléculaires 4 & Aring ;Sigma-Aldrich
n-HexaneSigma-Aldrich110-54-3
N-IodosuccinimideSigma-Aldrich516-12-1
Bicarbonate de sodiumSigma-Aldrich144-55-8
Thiosulfate de sodiumSigma-Aldrich10102-17-7
ToluèneSigma-Aldrich108-88-3
Acide trifluorométhanesulfoniqueSigma-Aldrich1493-13-6

Références

  1. Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochimica Et Biophysica Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
  2. Sears, P., Wong, C. -H. Toward Automated Synthesis of Oligosaccharides and Glycoproteins. Science. 291 (5512), 2344-2350 (2001).
  3. Kulkarni, S. S., et al. “One-Pot” Protection, Glycosylation, and Protection-Glycosylation Strategies of Carbohydrates. Chemical Reviews. 118 (17), 8025-8104 (2018).
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  9. Ceroni, A., Dell, A., Haslam, S. M. The GlycanBuilder: a fast, intuitive and flexible software tool for building and displaying glycan structures. Source Code for Biology and Medicine. 2, 3(2007).
  10. Damerell, D., et al. The GlycanBuilder and GlycoWorkbench glycoinformatics tools: updates and new developments. Biological Chemistry. 393 (11), 1357-1362 (2012).

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