Article de méthode

Modulation de la localisation sous-cellulaire de Tau comme outil pour étudier l'expression des gènes liés à la maladie

DOI :

10.3791/59988

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20 décembre 2019

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1Laboratory of Biology, BIO@SNS, Scuola Normale Superiore

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tau est une protéine neuronale présente à la fois dans le cytoplasme, où il lie les microtubules, et dans le noyau, où il exerce des fonctions non conventionnelles, y compris la modulation des gènes liés à la maladie d'Alzheimer. Ici, nous décrivons une méthode pour étudier la fonction du Tau nucléaire tout en excluant toutes les interférences provenant du Tau cytoplasmique.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tau est une protéine de liaison microtubule exprimée dans les neurones et sa fonction principale connue est liée au maintien de la stabilité cytosquelettique. Cependant, des preuves récentes ont indiqué que Tau est également présent dans d'autres compartiments subcellulaires, y compris le noyau où il est impliqué dans la protection de l'ADN, dans la transcription de l'ARNr, dans la mobilité des rétrotransposons et dans l'organisation structurelle de la Nucléole. Nous avons récemment démontré que le Tau nucléaire est impliqué dans l'expression du gène VGluT1, suggérant un mécanisme moléculaire qui pourrait expliquer l'augmentation pathologique de la libération de glutamate dans les premiers stades de la maladie d'Alzheimer. Jusqu'à récemment, l'implication du nucléaire Tau dans la modulation de l'expression des gènes cibles était relativement incertaine et équivoque en raison de limitations techniques qui empêchaient l'exclusion de la contribution du Tau cytoplasmique ou l'effet d'autres facteurs en aval non liés au Tau nucléaire. Pour surmonter cette incertitude, nous avons mis au point une méthode pour étudier l'expression des gènes cibles spécifiquement modulées par la protéine tau nucléaire. Nous avons utilisé un protocole qui couple l'utilisation de signaux de localisation et la fractionnement subcellulaire, permettant l'exclusion de l'interférence des molécules cytoplasmiques Tau. Plus particulièrement, le protocole est facile et est composé de méthodes classiques et fiables qui sont largement applicables pour étudier la fonction nucléaire de Tau dans d'autres types de cellules et les conditions cellulaires.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les fonctions de la protéine Tau dans le noyau ont suscité un intérêt significatif ces dernières années, car il a été montré pour être étroitement associé aux acides nucléiques1,2,3,4,5,6. En effet, une étude récente à l'échelle du génome a démontré que Tau lie des séquences d'ADN géniques et intergéniques in vivo7. Un rôle dans l'organisation nucléolar a été suggéré8,9,10,11. En outre, Tau a été proposé d'être impliqué dans la protection de l'ADN contre le stress oxydatif et hyperthermique5,10,12,13, tandis que Mutated Tau a été liée à l'instabilité chromosomique et l'aneuploidy14,15,16.

Jusqu'à présent, les défis dans l'étude des fonctions de Tau dans le compartiment nucléaire sont restés presque non résolus en raison des difficultés à disséquer la contribution spécifique de Tau nucléaire de la contribution de Tau cytoplasmique. En outre, les fonctions attribuées aux molécules de Tau dans le compartiment nucléaire, jusqu'à présent, ne sont que corrélatives parce qu'elles manquent d'une démonstration sans équivoque de l'implication directe des protéines tau nucléaires. En effet, l'implication de Tau dans la mobilité des rétrotransposons ou dans la transcription de l'ARNr ou dans la protection de l'ADN11,12,17,18,19 pourrait également s'expliquer par la contribution du cytoplasmique Tau ou par l'effet d'autres facteurs en aval non liés au Tau nucléaire.

Ici, nous fournissons une méthode qui peut résoudre ce problème en exploitant une procédure classique pour isoler le compartiment nucléaire combiné avec l'utilisation de Tau construit 0N4R marqué avec la localisation nucléaire (NLS) ou des signaux d'exportation nucléaire (NES). Cette approche élimine les problèmes complexes liés aux artefacts possibles en raison du débordement des molécules de Tau du compartiment cytoplasmique. En outre, les constructions Tau-NLS et Tau-NES induisent l'enrichissement ou l'exclusion des molécules De Tau du compartiment nucléaire, respectivement, fournissant des contrôles positifs et négatifs pour l'implication des molécules nucléaires de Tau dans une fonction spécifique. Le protocole est techniquement facile et il est composé de méthodes classiques et fiables qui sont largement applicables pour étudier la fonction nucléaire de Tau dans d'autres types de cellules, différenciées ou non, telles que les cellules cancéreuses qui réactivent l'expression Tau20,21. En outre, il pourrait être appliqué également à d'autres protéines qui sont présentes dans le cytoplasme et le noyau afin de disséquer les fonctions biologiques liées à différents compartiments.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Culture cellulaire

  1. Culture SH-SY5Y cells (human neuroblastoma cell line, CRL-2266) in complete medium (Dulbecco's modified Eagle medium:nutrient mixture F12 [DMEM/F-12] complété par 10% de sérum bovin fœtal [FBS], 2 mM L-glutamine, 100 U/mL pénicilline et 100 'g/mLstreptomy). Maintenir les cellules dans un incubateur à 37 oC et 5 % de CO2. Cultivez les cellules dans des plaques de 10 cm et divisez-les lorsque le confluent.

2. Différenciation cellulaire

  1. Pour différencier les cellules SH-SY5Y, le lendemain du placage, ajouter 10 millions d'acide rétinoïque (RA) pour compléter le milieu pendant 5 jours.
  2. Le sixième jour remplacer le milieu par le milieu de différenciation : DMEM/F-12 complété avec 50 ng/mL BDNF, 2 mM L-glutamine. N'ajoutez pas de FBS ou d'antibiotiques.
  3. Cultivez les cellules dans le milieu de différenciation pendant 3 jours.

3. Chimeric Constructs Clonage

  1. Générer Tau-NLS construire par le clonage par digestion enzymatique de restriction dans le cadre à la fin 3' de la séquence Tau 0N4R (383aa) le 3xNLS(SV40NLS):5'-CCAAAAAGAAGAGAAAAAAAAGAATCAAAAAAAAGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'.
    REMARQUE: Le 3xNLS à l'extrémité 3' de Tau est cloné dans le plasmide pCMV-Tau pour l'expression des mammifères exploitant les sites de restriction XhoI et BamHI dans le site multiconisme (MCS).
  2. Générer Tau-NES construire par clonage par digestion enzymatique restriction dans le cadre à la fin 3' de la séquence Tau 0N4R (383aa) la séquence NES: 5'-AGTGAGCCTGCAGAACAAGCTGGAAGAGTTGGATCTGGACTACTACACA-3'.
    REMARQUE: La NES à l'extrémité 3' de Tau est clonée dans le plasmide pCMV-Tau pour l'expression des mammifères exploitant les sites de restriction EcoRI et BamHI dans le MCS.
  3. Transformez la souche DH5alpha E. coli avec 100 ng d'ADN à partir de l'étape 3.1 ou 3.2 et les cellules de plaque sur les plaques LB-Agar avec 100 mg/mL d'ampicilline. Laisser pousser du jour au lendemain à 37 oC.
  4. Choisissez une seule colonie et piquez les cellules en 5 ml de LB avec de l'ampicilline. Laissez les cellules se développer à 37 oC dans l'agitation pendant la nuit.
  5. Extraire plasmide avec un miniprep d'ADN (Table des Matériaux) et séquence pour vérifier les constructions.
  6. Transformez la souche DH5alpha E. coli avec la séquence vérifiée des constructions et des cellules de plaque sur des plaques DE LB-Agar avec de l'ampicilline. Laisser pousser du jour au lendemain à 37 oC.
  7. Choisissez une seule colonie et piquez les cellules en 5 ml de LB avec de l'ampicilline. Laisser les cellules se développer à 37 oC en agitation pendant 2 h.
  8. Mettez les cellules de l'étape 3.7 dans 200 ml de LB avec l'ampicilline. Laisser pousser du jour au lendemain à 37 oC.
  9. Pelleter les cellules à 3 500 x g pendant 10 min à 4 oC.
  10. Extrait plasmide avec un maxiprep ADN (Table of Materials).

4. Transfection cellulaire

  1. Seed 400 000 cellules à partir de l'étape 1.1 dans des plaques de 6 puits ou 20 000 cellules dans des glissières de chambre à 8 puits. Plaque quatre échantillons : cellules témoins à transpercer avec un vecteur vide, cellules à transpercer avec du Tau non étiqueté, cellules à transfecter avec Tau-NLS et cellules à transfecter avec Tau-NES.
  2. Le lendemain de l'ensemencement transfect 400 ng d'ADN pour chaque puits en utilisant les lipides cationiques (Tableau des matériaux) dans 6-puits plaques ou 200 ng d'ADN pour chaque puits pour les diapositives de chambre de 8 puits, selon les instructions du fabricant.
    1. Incuber l'ADN et les lipides cationiques séparément en 250 l (pour les plaques de 6 puits) ou 25 l (pour les diapositives de chambre à 8 puits) de milieu sérique réduit pendant 5 min à RT. Ensuite, combinez-les pour générer le complexe ADN-lipide et incuber pendant 20 min.
    2. Remplacer le milieu de culture par 2 ml (pour 6 plaques de puits) ou 250 l (pour des toboggans de chambre de 8 puits) de milieu de culture complet frais. Ajouter le complexe ADN-lipide aux cellules et incuber à 37 oC pendant la nuit.
  3. Alternativement, l'ADN transfect avec la polyéthylène de réactif cationic (PEI).
    1. Mélanger 2 g d'ADN et 6 l de l'Ile-du-Prince-Édouard avec 200 l de milieu de culture complet (pour chaque puits dans des plaques de 6 puits), ou 1 g d'ADN et 3 oL de l'Ile-du-Prince-Édouard avec 100 l de milieu de culture complet (pour chaque puits dans des diapositives de chambre de 8 puits) , vortex et incuber pendant 10 min à RT.
    2. Ajoutez le mélange aux cellules et ajoutez 1,8 ml de milieu de culture complet par puits dans des plaques de 6 puits ou 150 l de milieu de culture complet par puits dans des glissières de chambre à 8 puits pour atteindre le volume de placage.
  4. Changez le médium le lendemain de la transfection et ajoutez les supports de différenciation tels que décrits à l'étape 2.2.

5. Immunofluorescence

  1. Retirez le milieu de culture et rincez les cellules avec 1x PBS. Fixer les cellules avec 100% de méthanol glacé pendant 3 min sans trembler. Retirez la solution de fixation et lavez brièvement avec 1x PBS.
  2. Perméabilize avec 0,1% de surfactant non ionique en 1x PBS pendant 5 min à température ambiante (RT). En bref, laver avec 1x PBS, 3 fois.
  3. Incuber les cellules avec tampon de blocage (0,1% Tween 20 et 1% BSA en PBS) pendant 30 min à RT sur un shaker orbital.
  4. Incuber avec des anticorps primaires appropriés (p. ex., anticorps anti-Tau13 monoclonal de souris) dilué 1:500 en bloquant le tampon pendant la nuit à 4 oC sur un shaker orbital. Retirez la solution d'anticorps et lavez brièvement avec 1x PBS.
  5. Incubate avec des anticorps secondaires conjugués au fluorophore (p. ex., anticorps antisouris de chèvre conjugués à Alexa Fluor 633) dilué 1:500 dans le tampon de blocage pendant 1 h à RT. Retirez la solution d'anticorps et lavez brièvement avec 1x PBS 3 fois.
  6. Pour tacher les noyaux, incuber avec DAPI dilué 1:20,000 dans le tampon de blocage pendant 10 min à RT. Laver avec 1x PBS 3 fois. Mount coverslips sur une glissière à l'aide du milieu de montage antifade.

6. Blot occidental

  1. Pour recueillir la pastille cellulaire de l'étape 4.4, retirez le milieu et lavez les cellules avec du PBS. Incuber avec 500 oL de 0,1 % de trypsine pendant 4 min à 37 oC. Ajouter un volume égal de cellules moyennes complètes et resuspendre.
  2. Recueillir les cellules dans un tube et centrifugeuse à 500 x g pendant 5 min. À la fin de la centrifugation, retirez soigneusement le supernatant. Ajouter 1 mL de PBS, centrifugeuse à 500 x g pendant 5 min et retirer soigneusement le supernatant. Entreposez les granulés de cellules sur la glace pour une utilisation immédiate ou congelez-les à -80 oC pour le stockage à long terme.
  3. Pour les extraits totaux de protéines, incuber le granule cellulaire pendant 30 min sur la glace dans le tampon de lyse (20 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM NaCl, 10% glycérol, 1% octylphenoxy poly(éthylèneoxy)ethanol, ramifié (Tableau des matériaux), 10 mM EDTA) complété par de la protéase et des inhibiteurs de la phosphatase. Selon l'abondance de la pastille, utilisez de 50 à 100 l de tampon de lyse.
    1. Centrifuger l'extrait à 16 000 x g pendant 15 min. Recueillir le supernatant et quantifier la concentration de protéines par tout analyse de quantification standard. Préparer les échantillons de protéines pour le SDS-PAGE en mélangeant 20 g de protéines avec 5 l de tampon 4x Laemmli dans un volume total de 20 L et faire bouillir à 100 oC pendant 5 min.
      REMARQUE: L'échantillon peut être stocké à -20 oC.
  4. Pour les fractionnements subcellulaires, resuspendre les cellules de l'étape 6.2 dans le milieu complet, et recueillir 1 x 106 cellules par échantillon. Centrifugeuse à 500 x g pendant 10 min pour obtenir des granulés de cellules pour les étapes suivantes.
    1. Pour isoler les compartiments subcellulaires, fractionner selon les spécifications du kit. Pour isoler chaque fraction, incuber le granule cellulaire de l'étape 6.4 avec le tampon correspondant, centrifugeuse, recueillir le supernatant et ajouter le tampon suivant à la pastille comme décrit dans 6.4.1.1-6.4.1.5. Ajouter dans l'ordre tampon d'extraction cytoplasmique, tampon d'extraction de membrane, tampon d'extraction nucléaire, tampon d'extraction nucléaire complété par 5 mM CaCl2 et 3 U/ L nucléane micrococcal et tampon d'extraction cytosquelettique.
      REMARQUE: Tous les tampons doivent être complétés par des inhibiteurs de la protéase. Échelle des volumes tampons en fonction du volume de la pastille cellulaire.
      1. Pour isoler la fraction cytosolique, incuber les granulés de cellules dans 100 oL de tampon d'extraction cytoplasmique à froid complété par des inhibiteurs de la protéase à 4 oC avec un mélange doux pendant 10 min. Centrifugeuse à 500 x g à 4 oC pendant 5 min et transférer le supernatant aux tubes préréfrigérés.
      2. Ajouter 100 ll de tampon d'extraction de membrane glace-froid complété avec des inhibiteurs de la protéase à la pastille à partir de l'étape 6.4.1.1, et couver à 4 oC avec un mélange doux pendant 10 min. Centrifugeuse à 3 000 x g à 4 oC pendant 5 min et recueillir le supernatant.
      3. Pour la fraction nucléaire soluble, ajoutez 50 l de tampon d'extraction nucléaire complété par des inhibiteurs de la protéase à la pastille à partir de l'étape 6.4.1.2, et le vortex. Incuber à 4 oC pendant 30 min, centrifuger à 5 000 x g à 4 oC pendant 5 min, et recueillir le supernatant.
      4. Pour la fraction nucléaire insoluble, ajoutez 50 l de tampon d'extraction nucléaire complété par des inhibiteurs de la protéase, CaCl2 et nucléane micrococcique à la pastille à partir de l'étape 6.4.1.3, et le vortex. Incuber à 37 oC pendant 5 min, puis refaire un vortex. Centrifugeuse à 16 000 x g à RT pendant 5 min et collecte zetle le supernatant.
      5. Pour la fraction cytosquelettique, ajouter 50 l de tampon d'extraction cytosquelettique complété par des inhibiteurs de la protéase à la pastille à partir de l'étape 6.4.1.4, et le vortex. Incuber 10 min à RT. Centrifuge le tube à 16 000 x g pendant 5 min, ramasser le supernatant et jeter le granule.
        REMARQUE: Échelle des volumes de mémoire tampon en fonction du volume de la cellule, tel qu'indiqué dans le protocole du kit. Se référer au protocole kit pour plus de détails sur l'incubation et le temps de centrifugation et la température22,23,24,25,26,27,28,29. Alternativement, utilisez toutes les méthodes standard30 qui, en utilisant des détergents et en augmentant la force ionique et la vitesse de centrifugation, sépare le cytosolique, la membrane liée, le cytosquelettique et les fractions nucléaires. Séparez la fraction nucléaire soluble et la fraction nucléaire insoluble en exploitant les tampons d'extraction nucléaire standard. L'échantillon peut être stocké à -20 oC.
    2. Pour le SDS-PAGE, ajouter 7 'L de tampon Laemmli 4x à 20 'L de fractions subcellulaires obtenues à partir des étapes 6.4.1.1-6.4.1.5, faire bouillir à 100 'C pendant 5 min.
  5. Chargez des échantillons sur un gel d'acrylamide et effectuez une électrophorèse à une tension constante de 120 V. Transférer les protéines à la membrane de nitrocellulose à 250 mA pendant 90 min.
  6. Vérifiez l'électrophorèse appropriée de gel de protéine et le ballonnement réussi en couvant la membrane pendant 5 min dans la solution de coloration de Ponceau. Rincer la membrane dans de l'eau distillée jusqu'à ce que le fond soit propre. Retirer la tache en continuant le lavage avec Tris tamponné saline avec Tween 20 (TBST) pendant 10 min sur un shaker.
  7. Incuber la membrane avec une solution de blocage (5% de lait en TBST) pendant 1 h à RT sur shaker. Laver 3 fois avec tBST pendant 5 min.
  8. Hybridez la membrane avec l'anticorps primaire dans la solution de blocage (1% de lait en TBST) pendant la nuit à 4 oC. Laver 3 fois avec tBST pendant 5 min.
  9. Hybridez la membrane avec l'anticorps secondaire HRP-conjugué dans la solution de blocage pendant 1 h à RT. Lavez-le 3 fois avec TBST pendant 5 min.
  10. Détecter la bande protéique à l'aide de la chemiluminescence. Quantifier l'intensité des groupes Western Blot par ImageJ. Normaliser l'expression des protéines sur le produit d'un gène d'entretien ménager : histone H2B pour la fraction soluble et insoluble nucléaire, GAPDH pour la fraction cytoplasmique et pour les extraits totaux.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La stratégie utilisée pour disséquer l'impact du Tau nucléaire dans l'expression des gènes en évitant la contribution des protéines tau cytoplasmiques a été décrite dans la figure 1. En bref, les protéines Tau étiquetées avec NLS ou NES sont accumulées ou exclues du compartiment nucléaire, respectivement. L'effet fonctionnel de ce déséquilibre est l'altération de l'expression génique mesurée comme le produit du gène VGluT1.

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons une méthode pour mesurer l'impact de la protéine Tau nucléaire sur l'expression de gène. Avec ce protocole, la contribution du tau cytoplasmique est fortement limitée. Les étapes critiques de ce protocole sont les suivantes : la différenciation des cellules sH-SY5Y du neuroblastome humain, la fractionnement subcellulaire et la localisation de la protéine Tau dans le compartiment nucléaire.

Tout d'abord, comme le montre la section des résultats représentatifs, la différenciation ...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par des subventions de Scuola Normale Superiore (SNS14_B_DIPRIMIO; SNS16_B_DIPRIMIO).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Alexa Fluor 633 chèvre anti-souris IgGLife TechnologiesA21050IF 1:500
anti ActineAnticorps BETHYL LABORATORIEA300-485Aanti-lapin WB 1:10 000
anti GAPDH AnticorpsFitzgerald Industries International10R-G109aanti-souris WB 1:10 000
anti H2B AnticorpsAbcamab1790anti-lapin WB 1:15 000
anticorps anti-Tau-13Santa Cruz Biotechnologysc-21796anti-souris WB 1:1 000 ; IF 1:500
anti tubuline alphaAnticorps Thermo Fisher ScientificPA5-16891anti-souris WB 1:5 000
anti VGluT1 AnticorpsSigma-AldrichAMAb91041anti-souris WB 1:500
BCA Protein Assay KitEurocloneEMPO14500
BDNFAlomone LabsB-250
Blotting-Grade BlockerBiorad1706404Lait écrémé en poudre
BOVIN SÉRUM ALBUMINESigma-AldrichA4503-50g
cOmplete MiniRoche11836170001inhibiteur de protéase
Critère TGX 4-20 % Sans tache, 10 puitsBiorad5678093
DAPIThermo Fisher Scientific62247
DMEM/F-12GIBCO21331-020
Dulbecco’s Modified Eagle's Medium Low GlucoseEurocloneECM0060L
EDTASigma-Aldrich0390-100mlpH = 8, 0,5 M
Sérum fœtal bovinEurocloneEC50182L
GlycérolSigma-AldrichG5516-500ml
Chèvre anti-souris IgG-HPRSanta Cruz Biotechnologysc-2005WB 1:1 000
Chèvre anti-lapin IgG-HPRSanta Cruz Biotechnologysc-2004WB 1:1 000
IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI8896-50mlOctylphénoxy poly(éthylèneoxy)éthanol
Immobilon WesternMERCKWBKLS0500
Lab-Tech Lame de chambre 8 puits lame en verrenunc177402
L-glutamineEurocloneECB3000D100X
Lipofectamine 2000 réactif de transfectionThermo Fisher Scientific12566014lipide cationique
MéthanolSigma-Aldrich322415-6X1L
MgCl2Sigma-AldrichM8266-100G
NaClSigma-AldrichS3014-1kg
Opti-MEM sérum réduit moyenGibco31985070
PEISigma-Aldrich40,872-7
Pénicilline/StreptomycineThermo Fisher Scientific1514012210,000 U/mL, 100 mL
Saline tamponnée au phosphate (Dulbecco A)OXOIDBR0014G
PhosStopRoche4906837001inhibiteur de la phosphatase
QIAGEN Plasmid Maxi KitQiagen12163Étape 3.10
Acide rétinoïqueSigma-AldrichR2625-100mg
Kit de fractionnement des protéines subcellulaires pour cellules cultivéesThermo Fisher Scientific78840
Membrane nitrocellulosique supportéeBiorad1620097
TC-Plate 6wellSARSTEDT833,920
TCS SP2 microscope confocal à balayage laserLeicaN/A
Triton x-100Sigma-AldrichX100-500mlTensioactif non ionique
Trypsine-EDTAThermo Fisher Scientific154000540.50 %
Tween-20Sigma-AldrichP9416-100ml
VECTASHIELD antifade support de montageVector LaboratoriesH-1000
Wizard Plus SV Minipreps Systèmes de purificationd’ADNPromegaA1330Étape 3.5

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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