Article de méthode

Examiner la dynamique de l'adhérence cellulaire et la propagation des cellules épithéliales sur la fibronectine pendant le stress oxydatif

DOI :

10.3791/59989

⸱

13 octobre 2019

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1Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Chemistry, High Point University, 3Biotechnology Program and the Department of Molecular Biomedical Sciences, North Carolina State University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette méthode est utile pour quantifier la dynamique précoce de l'adhérence cellulaire et la propagation des cellules dépendantes de l'ancrage sur la fibronectine. En outre, cet analyse peut être employé pour étudier les effets de l'homéostasie altérée de redox sur la diffusion de cellules et/ou les voies intracellulaires liées à l'adhérence cellulaire.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'adhérence et la diffusion des cellules sur la matrice extracellulaire (ECM) sont des processus cellulaires essentiels pendant le développement de l'organisation et pour l'homéostasie des tissus adultes. Fait intéressant, le stress oxydatif peut modifier ces processus, contribuant ainsi à la physiopathologie de maladies telles que le cancer métastatique. Par conséquent, la compréhension du mécanisme (s) de la façon dont les cellules se fixent et se propagent sur l'ECM pendant les perturbations dans le statut redox peut fournir un aperçu des états normaux et de la maladie. Décrit ci-dessous est un protocole étape-sage qui utilise un jeu d'immunofluorescence-basé pour quantifier spécifiquement l'adhérence cellulaire et la diffusion des cellules immortalisées de fibroblaste sur la fibronectine (FN) in vitro. En bref, les cellules dépendantes à l'ancrage sont maintenues en suspension et exposées à l'inhibiteur de la kinase ATM Ku55933 pour induire un stress oxydatif. Les cellules sont ensuite plaquées sur la surface enduite de FN et autorisées à s'attacher pendant des périodes prédéterminées. Les cellules qui restent attachées sont fixes et étiquetées avec des marqueurs d'anticorps à base de fluorescence de l'adhérence (p. ex. la paxilline) et de la propagation (p. ex., F-actine). L'acquisition et l'analyse de données sont effectuées à l'aide d'équipements de laboratoire couramment disponibles, y compris un microscope à épifluorescence et un logiciel Fidji disponible gratuitement. Cette procédure est très polyvalente et peut être modifiée pour une variété de lignées cellulaires, protéines ECM, ou inhibiteurs afin d'examiner un large éventail de questions biologiques.

Introduction

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Les adhérences de matrice cellulaire (c.-à-d. les adhérences focales) sont de grands et dynamiques complexes de protéines multimoléculaires qui entravent l'adhérence cellulaire et la propagation. Ces processus sont essentiels pour le développement, l'entretien et la fonction physiologique des tissus. Les adhérences focales sont composées de récepteurs liés à la membrane, tels que les intégrines, ainsi que de protéines d'échafaudage qui relient l'actine cytosquelettique à la matrice extracellulaire (ECM)1. Ces complexes sont capables de répondre aux indices physiochimiques présents dans l'environnement extracellulaire grâce à l'activation de diverses voies de transduction de signalisation. En tant que tel, les adhérences focales servent de centres de signalisation pour propager des indices mécaniques extracellulaires dans un certain nombre de processus cellulaires, y compris la migration dirigée, la régulation du cycle cellulaire, la différenciation, et la survie1,2. Un groupe de molécules de signalisation qui régulent et interagissent avec les adhérences focales comprend des membres de la famille Rho de petits GTPases. Les Rho GTPases sont des protéines clés qui régulent la migration cellulaire et la dynamique d'adhérence grâce à leur activation spatiotemporale spécifique3. Sans surprise, la dysrégulation de la fonction de protéine de Rho a été impliquée dans un certain nombre de pathologies humaines telles que la métastes, l'angiogenèse, et d'autres. D'intérêt particulier, le statut de redox cellulaire joue un rôle prédominant dans la modulation de la migration cellulaire et de l'adhérence. Des altérations de l'homéostasie redox, telles que l'augmentation des espèces réactives d'oxygène (ROS), ont été démontrées pour réguler l'activité de protéine de Rho, aussi bien que l'adhérence, dans un certain nombre de types de cellules et de maladies humaines4,5,6 ,7,8. Par exemple, les personnes souffrant du trouble neurologique ataxie-telangiectasia (A-T), qui est causée par une mutation dans la réparation des dommages à l'ADN serine / thréonine kinase A-T-mutated (ATM), ont un risque accru de cancer métastatique9, 10. La perte de l'activité de kinase d'ATM dans ces patients et lignes cellulaires, par la mutation génétique ou l'inhibition chimique, a comme conséquence des niveaux élevés de stress oxydatif dû au dysfonctionnement de la voiedephosphate de pentose 7,11, 12. En outre, des études récentes du laboratoire ont mis en évidence un rôle pathophysiologique pour ROS dans A-T en modifiant la dynamique cytosquelettique (c.-à-d. l'adhérence et la propagation) comme résultat direct de l'activation de la famille Rho GTPases in vitro5. En fin decompte, ces altérations de la dynamique cytosquelettique causée par l'activation de la famille Rho peuvent conduire à un risque accru de cancer métastatique noté chez les patients A-T5,13. Par conséquent, la compréhension de l'interaction entre les interactions cellule-matrice pendant le stress oxydatif peut fournir un aperçu de la régulation de l'adhérence et de la propagation. Ces études peuvent également préparer le terrain pour d'autres investigations sur un rôle possible pour la famille Rho GTPases dans ces processus de signalisation.

Décrit ci-dessus est un protocole pour étudier la dynamique cellulaire tôt de l'assemblage d'adhérence et de se propageant pendant l'effort oxydant provoqué par l'inhibition de l'activité de kinase d'ATM. Cet assay est basé sur le mécanisme bien caractérisé de l'adhérence des cellules dépendantes de l'ancrage à la fibronectine de protéine d'ECM (FN). Lorsque les cellules maintenues en suspension sont plaquées sur FN, plusieurs Rho GTPases coordonnent le contrôle de l'actine cytosquelettique3,14. Des changements morphologiques sont observés à mesure que les cellules passent de l'apparence ronde et circulaire à l'aplatiet et à l'expansion. En même temps que ces observations, il y a le développement de nombreuses adhérences matricielles avec l'ECM. Ces changements sont attribués à l'activation biphasique de RhoA avec Rac1 pendant la première heure que les cellules adhèrent et se propagent 15,16.

Une variété de méthodes ont été utilisées pour examiner la morphologie et la dynamique de l'adhérence ainsi que la propagation cellulaire. Cependant, ces méthodes s'appuient sur des systèmes sophistiqués de fluorescence interne totale à long terme (TIRF) ou de microscopie confocale. Ainsi, les utilisateurs doivent avoir accès à de l'équipement et à des logiciels spécialisés. En outre, le temps d'configuration requis par ces systèmes de bio-imagerie rend la capture des événements d'adhérence précoce difficile, en particulier lors de l'essai de plusieurs inhibiteurs ou des conditions de traitement en même temps.

Les méthodes détaillées, ici, fournissent un moyen simple, économique, mais quantitatif pour évaluer les paramètres qui régissent l'assemblage d'adhérence et la propagation in vitro. Le protocole est exécuté à l'aide d'équipement de laboratoire couramment disponible, comme un microscope épifluorescence et une caméra CCD. Cet analyse consiste à appliquer des cellules dépendantes de l'ancrage à une surface enduite de FN après une période de stress oxydatif causée par l'inhibition chimique de l'activité kinase ATM, qui a été démontrée précédemment5. Après le placage, les cellules sont autorisées à se fixer et à adhérer pendant des durées déterminées. Les cellules non attachées sont lavées, tandis que les cellules attachées sont fixées et étiquetées avec des anticorps à base de fluorescence aux marqueurs d'adhérence (p. ex. de paxillin) et de propagation (p. ex., F-actin)2,5. Ces protéines sont ensuite visualisées et enregistrées à l'aide d'un microscope à épifluorescence. L'analyse ultérieure des données est effectuée à l'aide du logiciel Fidji disponible gratuitement. En outre, cette méthode peut être adaptée pour examiner la dynamique d'adhérence dans un large éventail de conditions, y compris différentes protéines ECM, le traitement avec diverses conditions d'oxydants/culture cellulaire ou une variété de lignées cellulaires dépendantes de l'ancrage pour répondre à un large éventail de questions biologiques.

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Protocole

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1. Préparations

REMARQUE : Le protocole décrit ci-dessous a été optimisé pour l'utilisation avec les cellules REF52 et les fibroblasteshumains. D'autres types de cellules peuvent nécessiter une optimisation plus poussée, comme décrit dans les notes et les sections de dépannage ci-dessous.

  1. Faire 500 ml de milieu de culture cellulaire complet pour les cellules REF52. À 500 ml de glucose élevé contenant le milieu modifié de l'aigle de Dulbecco (DMEM) ajouter 10% FBS, 2 mM L-glutamine, et 100 unités/mL pénicilline-streptomycine.
  2. Préparer une solution de fibronectine (FN) de 25 g/mL en ajoutant une solution FN de 300 oL de 1 mg/mL à 12 ml de saline tamponnée stérile de 1x phosphate (PBS), pH 7,4. Bien mélanger.
  3. Préparer une solution de 0,5 % (w/v) délipidée (c.-à-d. sans acide gras) d'albumine bovine (dlBSA) dans un milieu de culture cellulaire DMEM sans sérum. Ajouter 0,5 g de dlBSA à 100 ml de milieu DMEM sans sérum. Bien mélanger la solution, mais ne pas vortex. Filtre stérile la solution dans un nouveau récipient stérile, à l'aide d'un filtre à seringues de 0,22 M avant utilisation. Conserver à 4 oC.
  4. Faire 3,7% solution de paraformaldehyde en dissolvant 3,7 g de paraformaldéhyde dans 100 ml de 1x PBS. Utilisez une chaleur douce et en remuant pour obtenir le paraformaldehyde dans la solution.
    REMARQUE : La solution de paraformaldéhyde est sensible à la lumière et doit être protégée de la lumière. Il est bon pour jusqu'à une semaine lorsqu'il est stocké à 4 oC.
    CAUTION : Le paraformaldéhyde est toxique, inflammable, corrosif et dangereux pour la santé. Examiner la fiche de données sur l'innocuité des matériaux pour le paraformaldéhyde avant d'être utilisée. Utilisez l'équipement de protection individuelle approprié lors de la manipulation, y compris le bouclier oculaire, le protection facial, le respirateur de particules intégrale, les gants et la blouse de laboratoire.
  5. Préparer la solution de perméabilisation contenant 0,2 % de surfactant non ionique dans 1x PBS (v/v). Pour 100 ml, ajouter lentement 0,2 ml de Triton X-100 à 100 ml de 1x PBS, en remuant.
  6. Faire dissous le tampon de blocage de l'immunofluorescence contenant 2,5 % de BSA, 5 % de sérum de chèvre et 0,05 % de surfactant non ionique (w/v/v) dans la solution 1x PBS. Pour 100 ml, ajouter 5 ml de sérum de chèvre, 2,5 g de BSA et 0,05 ml de Triton X-100 en 95 ml 1x PBS, en remuant.
  7. Cultivez des cellules REF52 dans le milieu de culture complet de DMEM dans une plaque traitée par culture cellulaire de 10 cm2 (ou toute autre taille de navire) dans un incubateur de culture cellulaire à 37 oC et 5 % de CO2.

2. Plaque de culture cellulaire de revêtement avec la fibronectinde extracellulaire de protéine de matrice

REMARQUE : Effectuez cette section en utilisant la technique aseptique et les réactifs stériles dans un capot de flux laminaire certifié BSL-2. Consultez la figure 1A pour un aperçu des étapes clés avant le début.

  1. À l'aide d'une plaque certifiée 24 puits, placez une plaque de verre (12-Cir-1) dans chaque puits. Étiqueter la plaque selon la figure 1B.
  2. Pipette 500 l de la solution FN de 25 g/mL pour chaque puits d'une plaque de 24 puits.
  3. Pipette la solution sur chaque coverslip à quelques reprises pour assurer un revêtement uniforme et une submersion complète. Remettre le couvercle sur l'assiette.
  4. Incuber la plaque dans un incubateur de culture cellulaire à 37 oC et 5 % de CO2 pour 1 h.
    REMARQUE : Alternativement, incuber toute la nuit à 4 oC.
  5. Après 1 h, retirer la plaque de l'incubateur et aspirer la solution FN des puits.
  6. Laver les puits trois fois avec 500 l de 1x PBS. Aspirez le lavage final de 1x PBS.
  7. Bloquer les puits avec une solution dlBSA de 500 oL de 0,5 % pour un minimum de 15 min à 37 oC et 5 % de CO2.
  8. Aspirez la solution dlBSA avant de placage les cellules à l'étape 3 ci-dessous.
    REMARQUE : Si vous stockez des plaques, ajoutez 500 'L de 1x PBS à chaque coverslip après aspiration de la solution dlBSA. Les plaques peuvent ensuite être conservées à 4 oC jusqu'à une semaine.

3. Préparation des cellules dépendantes de l'ancrage pour l'adhérence

REMARQUE : Effectuez cette section en utilisant la technique aseptique et les réactifs stériles dans un capot de flux laminaire certifié BSL-2.

  1. Au moins 30 min avant le placage cellulaire, préchauffez les solutions suivantes : milieu complet DMEM, solution dlBSA, 1x PBS, 0,5 % de trypsine-EDTA solution, et sérum neutralisant la trypsine (TNS) dans un bain d'eau à 37 oC.
  2. En commençant par une monocouche confluente de cellules REF52 dans un plat de 10 cm2, lavez les cellules deux fois avec 6 ml de 1x PBS chaud. Sérum affaisser les cellules pendant au moins 1 h (selon le type de cellule) dans 6 ml de solution dlBSA chaude à 37 oC et 5% CO2.
  3. Laver les cellules avec 6 ml de 1x PBS réchauffé, aspirer PBS et ajouter 1,5 ml de solution chaude de 0,5% Trypsin-EDTA.
  4. Placer les cellules dans un incubateur de culture cellulaire à 37 oC et 5 % de CO2 pendant 2 min.
  5. Observez les cellules sous un microscope léger pour s'assurer que le détachement est complet. Si les cellules sont encore adhérentes après avoir tapé la plaque sur le dessus du banc, retournez à l'incubateur de 37 oC pendant 2 min supplémentaires. Trypsiniser les cellules pendant aussi peu de temps que nécessaire.
  6. Pipette 1,5 ml de solution de neutralisation de la trypsine chaude (TNS) au plat pour arrêter la trypsinisation et recueillir les cellules détachées. Pipette la solution de haut en bas sur le fond de la plaque de nombreuses fois pour enlever toutes les cellules adhérentes restantes. Si les cellules semblent agglomupées, triturate davantage la suspension de la cellule en faisant doucement monter et descendre sur le dos du plat.
  7. Compter les cellules à l'aide de l'exclusion bleu trypan et un hémocytomètre sous un microscope léger. Vous pouvez également utiliser un compteur cellulaire automatisé.
  8. Enlever une quantité appropriée de cellules pour créer une suspension cellulaire de 1,0 à 3,0 x 104 cellules/mL dans 5 ml de dlBSA dans un tube conique de 15 ml.
  9. Cellules centrifugeuses à 300 x g pendant 5 min à l'aide d'un rotor à angle fixe dans une centrifugeuse de table.
  10. Aspirez le supernatant de la pastille cellulaire, et resuspendles les cellules dans un total de 7 ml de solution dlBSA chaude. Ne laissez pas les cellules être trop confluentes sur le placage de couverture, mais également distribuées avec peu de cellules se touchant les unes les autres.
  11. Divisez uniformément la suspension cellulaire en deux tubes coniques de 15 ml, l'un pour le seul contrôle du véhicule (DMSO) et l'autre pour Ku55933 (inhibiteur de la kinase ATM, oxydant)5. Assurez-vous que chaque tube contient 3,5 ml de suspension cellulaire.
  12. À l'aide d'un rotateur de tube, tournez les tubes à 37 oC pendant 90-120 min dans un incubateur de culture cellulaire.
  13. 30 min avant le placage, ajouter une concentration finale de 10 M Ku55933 et DMSO (1:1,000) à chaque tube respectif. Remettre la suspension de la cellule sur le rotateur pour le reste du temps.
  14. Immédiatement avant de placage les cellules, récupérer la plaque de 24 puits de l'incubateur et aspirer la solution dlBSA.
  15. Après avoir revolving la suspension cellulaire pendant 90-120 min, retirer 500 l de suspension cellulaire de chaque groupe de traitement et ajouter à un bordereau enduit FN dans la plaque de 24 puits de l'étape 2 comme illustré (Figure 1B). Remettre la plaque à l'incubateur de culture cellulaire CO2 de 37 oC et 5 % et la suspension cellulaire à la rotation.
  16. Après le placage de la suspension cellulaire sur les couvertures couvertes FN, permettre aux cellules d'adhérer pendant la durée désirée (p. ex. 10 min, 15 min, 20 min, 30 min) et passer immédiatement à l'étape 4.

4. Fixation cellulaire et coloration d'anticorps pour immunofluorescence

REMARQUE : Les étapes suivantes sont effectuées dans des conditions non stériles et à température ambiante, sauf indication contraire.

  1. Après le temps désiré pour l'adhérence a passé, aspirer la solution cellulaire de chaque coverslip dans la plaque.
  2. En utilisant les côtés du puits, distribuez délicatement 500 l de solution de paraformaldéhyde de 3,7 % sur chaque bordereau et attendez de 10 à 15 min.
  3. Retirez la solution de paraformaldéhyde et lavez chaque bordereau avec 500 L de 1x PBS pour un total de deux fois.
    REMARQUE : Éliminer les déchets de paraformaldéhyde de façon responsable, selon le plan de santé et de sécurité environnementales de l'institution.
  4. Aspirez le PBS, et perméabilize cellules sur chaque coverslip avec 500 L de 0,2% Triton X-100 en 1x PBS (v/v) pendant 10-15 min à température ambiante.
  5. Laver chaque bordereau avec 500 oL de 1x PBS trois fois.
  6. Bloquer les cellules sur chaque bordereau de couverture avec 500 l de tampon de blocage d'immunofluorescence contenant 5% de sérum de chèvre, 2,5% BSA et 0,05% Triton X-100 dissous dans une solution 1 x PBS pendant 30-60 minutes.
  7. Diluer l'anticorps anti-paxillin primaire (1:250) dans le tampon de blocage. Bien mélanger et ajouter 200 l de la solution d'anticorps à chaque bordereau. Incuber à température ambiante pendant au moins 1 h.
    REMARQUE : Alternativement, la solution primaire d'anticorps peut être incubée pendant la nuit à 4 oC. Il y a beaucoup de marqueurs focaux communs d'adhérence qui pourraient être employés pour des complexes d'adhérence de coloration et l'analyse suivante de FA. Il s'agit notamment d'anticorps contre les protéines suivantes : sous-unités intégrines (1, 5 ou V), taline ou vinculine2.
  8. Aspirez la solution d'anticorps et lavez chaque bordereau avec 500 L de 1x PBS trois fois pendant 10 min chacun. Protégez les échantillons de la lumière à partir de ce point vers l'avant.
  9. Diluer la sonde phalloidin F-actinconjuge conjuguée au colorant rouge fluorescent Alexa 594 (1:1000) et à la souris chèvre-anti 488 anticorps secondaires fluorescents (1:400) dans la même solution tampon de blocage. Bien mélanger et ajouter 200 l de la solution d'anticorps à chaque bordereau pendant 30 min.
    REMARQUE : Des anticorps secondaires conjugués par fluorescent d'autres espèces peuvent également être utilisés. Cependant, l'utilisation d'anticorps d'autres espèces nécessitera une modification du sérum tampon de blocage.
  10. Aspirez la solution d'anticorps et lavez chaque bordereau avec 500 L de 1x PBS trois fois pendant 10 min chacun.
  11. Aspirer le 1x PBS et rincer une fois avec 500 oL de dIH2O.
  12. Les couvertures de montage sur les lames de microscope à l'aide du support de montage anti-fade contenant du DAPI.
  13. Laissez les lames de microscope pour les mettre toute la nuit dans l'obscurité à température ambiante.
  14. Entreposer les lames de microscope dans l'obscurité à 4 oC pour le stockage à long terme et jusqu'à l'imagerie.
    REMARQUE : Image utilisant des techniques standard d'immunofluorescence. Il est recommandé d'utiliser une lentille objective 60x d'immersion d'huile de haute puissance pour assurer une résolution suffisante pour noter les adhérences focales et les volants périphériques aux bords cellulaires. Acquérir des images de 20-30 cellules dans plusieurs champs de vision pour chaque coverslip sous chaque condition de traitement et le temps. À partir de répliques combinées, cela devrait donner au moins 60 cellules afin d'effectuer une analyse statistique. Enregistrer et exporter des images de fluorescence en tant que . Fichier TIFF avec une résolution minimale de 300 dpi.

5. Quantifier les fibres de stress, la circularité cellulaire et la formation d'adhérence focale

REMARQUE : Les analyses d'images suivantes sont effectuées à l'aide de la dernière version du package de traitement d'imagerie open source Fiji Is Just Image J (Fidji), qui peut être téléchargé gratuitement à (http://fiji.sc/).

  1. Traitement général de l'image
    REMARQUE : Toutes les images devront être préparées pour des analyses de calcul en effectuant des étapes 5.1.1-5.1.5 ci-dessous (figure 2). Par la suite, toutes les procédures de quantification ultérieures peuvent être sélectionnées.
    1. Ouvrez le . Image de fluorescence de TIFF utilisant fidjiens. Assurez-vous que les images sont 8 bits et à l'échelle grise.
    2. Sélectionnez Image-Ajuster-Fenêtre/niveau et sélectionnez Auto (Figure 2A).
    3. Sélectionnez L'arrière-plan Process-Subtract pour soustraire la fluorescence de fond. Vérifiez le paraboloid coulissant et sélectionnez l'option d'un rayon de boule de roulement de 50 pixels (figure 2B).
      REMARQUE : Pour vérifier la taille appropriée du rayon de la boule roulante, sélectionnez l'outil de ligne et dessinez un rayon sur la plus grande adhérence de l'image. Sélectionnez Mesure pour vérifier la longueur de la ligne tracée. Si la valeur du rayon est trop grande, les entités, y compris les adhérences, seront perdues dans l'image. Si le rayon est trop petit, il donnera lieu à des artefacts dans l'image traitée en raison du bruit de fond.
    4. Sélectionnez Image-Ajuster- Luminosité/Contraste pour vérifier l'intensité de l'adhérence sur l'arrière-plan. Ajuster si nécessaire.
      REMARQUE: Pour optimiser la luminosité/contraste et éviter de saturer le signal, utilisez l'outil de recherche de l'image pour examiner son histogramme afin d'ajuster la luminosité/contraste.
    5. Sélectionnez les paramètres suivants dans les mesures Analyze-Set: Zone, Valeur moyenne du gris, Descripteurs de forme et Densité intégrée.
  2. Analyse de formation de fibre de contrainte
    REMARQUE : Les fibres de stress peuvent être quantifiées de multiples façons selon le phénotype.
    1. Comptez le nombre de cellules avec des fibres de stress en pourcentage sur le nombre total de cellules. Cette analyse est préférable s'il existe des différences visuelles dans le nombre de fibres de stress formées dans différentes conditions expérimentales.
    2. Comptez le nombre de fibres de stress qui transversent la cellule. Cette analyse permet de comparer le nombre de fibres de stress formées par cellule.
    3. Mesurer l'intensité totale de fluorescence donnée par la phalloidine (p. ex., F-actin) par cellule17,18. Cette méthode mettra en évidence des augmentations/diminutions drastiques de l'intensité de fluorescence dues à la coloration f-actine.
      1. Définiz les paramètres de mesure à l'étape 5.1.5 ci-dessus.
      2. Sélectionnez l'outil à main levée dans la barre d'outils Fidji et tracez manuellement la cellule d'intérêt. Sélectionnez Analyze-Measure. Une nouvelle fenêtre apparaîtra indiquant les paramètres de mesure sélectionnés.
      3. Sélectionnez l'outil à main levée dans la barre d'outils Fidji et tracez manuellement un espace vide sans cellules présentes. Sélectionnez Analyze-Measure. Cette mesure servira de fluorescence de fond.
      4. Utilisez l'équation ci-dessous pour déterminer la fluorescence totale de l'actine F par cellule :
        figure-protocol-1
        REMARQUE : La mesure résultante peut être normalisée et comparée à d'autres cellules pour donner la fluorescence de F-actin par cellule.
  3. Analyse de circularité cellulaire
    REMARQUE : Des informations sur la zone cellulaire (un indicateur de propagation cellulaire au fil du temps), ainsi que la circularité peuvent également être enregistrées. Cette mesure est donnée comme un rapport entre 0 à 1 comme un moyen de quantifier les cellules qui sont allongées à ronde, respectivement.
    1. Sélectionnez l'outil à main levée dans la barre d'outils fidjienne et tracez une cellule individuelle. Sélectionnez Image-Mesure et enregistrez la zone cellulaire et les mesures du périmètre pour chaque cellule. Répétez cette procédure pour chaque cellule.
      REMARQUE : Sous la fonction Mesures de l'ensemble, la circularité est fournie comme mesure des descripteurs de forme (étape 5.1.5).
    2. Compter manuellement les ébouriffements ou les saillies enrichis par cellule, tels qu'ils sont représentés dans la figure 3 et la figure 4.
  4. Analyse de l'adhérence focale
    REMARQUE : Avant d'effectuer l'analyse d'adhérence focale, installez le plugin mexicain de filtre de chapeau sur la dernière version de Fidji. Le protocole suivant a été modifié à partir d'études précédentes19,20,21.
    1. Sélectionnez Process-Enhance Local Contrast (Clahe) en utilisant un bloc de taille de 19, des bacs histogrammes 256, et une pente maximale de 6, sans masque et pas rapide. (Figure 2C)
    2. Sélectionnez Process-Filters- Gaussian Blur avec un Sigma (Radius) de 2.0 pour filtrer l'image (Figure 2D).
    3. Sélectionnez Plugins-Mexican Hat Filter (Mhf) avec un rayon de 2.0 (Figure 2E).
    4. Exécuter Threshold et sélectionnez Dark Background et Over/Under en utilisant Huang ou Isodata comme méthode de seuil. Sélectionnez Auto-Threshold.
      REMARQUE : Cette étape garantit que les adhérences sont mises en évidence, mais aussi distinctes les unes des autres.
    5. Sélectionnez Particules d'analyse-analyse avec les paramètres suivants sélectionnés : taille 20, pixels-infini et circularité 0,00-0,99. Vérifiez les contours pour assurer la détection et la séparation appropriées des adhérences focales.
      REMARQUE : Ces résultats donnent le nombre, la zone, et la description de forme des adhérences focales individuelles.

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Résultats

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Un schéma général de la mise en place expérimentale

La figure 1 représente le schéma général pour l'adhérence cellulaire et le protocole de propagation commençant par la famine de sérum des cellules REF52 et se terminant par l'analyse computationnelle des images acquises de fluorescence. Les étapes clés du protocole sont illustrées dans la chronologie. Il convient de noter que l'étape 2 du protocole décrit la préparation des fiches de couverture enduites de FN, qui ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole décrit ici est un moyen polyvalent et économique de filtrer rapidement un certain nombre de types de cellules dépendantes de l'ancrage pour le cytosquelette dynamique remodelant pendant la propagation cellulaire. En particulier, cette méthode examine quantitativement la fibre de stress et la formation d'adhérence focale pendant le stress oxydatif lorsque les cellules adhèrent à la FN (figure 1A). En outre, ces phénotypes cellulaires peuvent suggérer un rôle réglementaire pour le...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs remercient les Drs Scott R. Hutton et Meghan S. Blackledge pour l'examen critique du manuscrit. Ces travaux ont été financés par les programmes de recherche et de parrainage (MCS) de l'Université High Point et le Programme de biotechnologie de la North Carolina State University (MCS).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,05 % Trypsine-EDTA (1x)Gibco by Life Technologies25300-054dissociation cellulaire
10 cm2 boîtesCell Treat229620stérile, traité pour culture tissulaire
15 mL tubes coniquesFisher Scientific05-539-5stérile
1X Phosphate Tamponné SalineCorning Cellgro21-031-CVPBS, stérile, sans Mg2+ et Ca2+
Plaques traitées pour culture cellulaire 24 puitsFisher Scientific07-200-740stériles, culture tissulaire traitée
4° ; C réfrigérateurFisher Scientific
IgG de souris anticorps anti-paxilline primaire (clone 165)BD Transduction Laboratories610620marqueur des adhérences focales
AspirateurArgosEV310
Armoire de biosécuritéNuairNU-477-400Classe II, Type A, série 5
Albumine sérique bovine délipidée (sans acide gras) PoudreFisher ScientificBP9704-100dlBSA
Dimethyl SulfoxideFisherScientific BP231-100solvant organique pour dissoudre Ku55933
Dulbecco’s Modified Eagle Media, High GlucoseFisher Scientific11965092REF52 milieu de culture cellulaire
Sérum de veau fœtalcertifié Fisher Scientific16000044, supplément de milieu de culture cellulaire
FidjiNational Institutes of Healthhttp://fiji.sc/ programme d’analyse d’images
Seringue filtranteFisher Scientific6900-25020.2 µ ; M,
lamelles en verre stériles (12-Cir-1.5)Fisher Scientific12-545-81autoclave en feuille pour stériliser la
chèvre anti-souris IgG anticorps secondaire Alexa Fluor 488InvitrogenA11001anticorps secondaire fluorescent, sensible à la lumière
Sérum de chèvreGibco de Life Technologies16210-064composant de la solution bloquante pour immunofluorescence
HémocytomètreFisher Scientific22-600-107pour le comptage cellulaire
Fibronectine plasmatique humaineGibco par Life Technologies33016-015FN
IX73 Microscope inversé à fluorescenceMicroscope Olympuspour visualiser la fluorescence, la morphologie cellulaire, le comptage et la dissociation
Ku55933Sigma-AldrichSML1109-25MGATM kinase inhibiteur, inducteur de l’oxygène réactif espèces
L-glutamineFisher Scientific25-030-081supplément de milieu de culture cellulaire
Caméra monochrome CMOS 16 bitsOptimos
ParaformaldéhydeSigma-AldrichP6148-500GPFA, fixateur pour l’immunofluorescence
Pénicilline-streptomycineFisher Scientific15-140-122P/S, solution antibiotique pour milieu de culture
Alexa Fluor 594 phalloïdine (sonde d’actine F)InvitrogenA12381marqueur de l’actine F, sensible à la lumière
ProLong Gold Réactif anti-décoloration avec DAPI Support deInvitrogenP36941comprenant un colorant nucléaire DAPI, cellules
REF52Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018 Plaque d’agitation
avec contrôle de la chaleurCorning IncorporatedPC-420D
SeringueBD Biosciences309653seringue de 60 mL
Incubateur de culture tissulaireNuair
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500détergent utilisé pour perméabiliser les membranes cellulaires
Trypan Blue SolutionFisher Scientific15-250-061pour le comptage cellulaire
Solution neutralisante de trypsine (1x)Gibco de Life TechnologiesR-002-100TNS, neutralise la trypsine au lieu du rotateur du tube sérique bovin fœtal
Fisher Scientific11-676-341
Fisher ScientificFSGPD02
montage de lamelle sensibles à la lumière bain-marie

Références

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