Exemple de Durotaxis à cellule unique pour évaluer le contrôle mécanique du mouvement cellulaire et les événements de signalisation connexes

Résumé

Les forces mécaniques sont importantes pour contrôler la migration cellulaire. Ce protocole démontre l'utilisation d'hydrogels élastiques qui peuvent être déformés à l'aide d'une micropipette en verre et d'un micromanipulateur pour stimuler les cellules avec un gradient de rigidité local pour provoquer des changements dans la structure cellulaire et la migration.

Résumé

Durotaxis est le processus par lequel les cellules détectent et réagissent aux gradients de tension. Afin d'étudier ce processus in vitro, la rigidité du substrat sous-jacent à une cellule doit être manipulée. Tandis que les hydrogels avec la rigidité graduée et les essais à long terme de migration se sont avérés utiles dans des études de durotaxis, les réponses immédiates et aigues aux changements locaux dans la tension de substrat permettent l'étude focalisée des mouvements individuels de cellules et des événements subcellulaires de signalisation. Pour tester à répétition la capacité des cellules à détecter et à répondre à la rigidité sous-jacente du substrat, une méthode modifiée pour l'application de gradients aigus de tension accrue aux cellules individuelles cultivées sur des hydrogels déformables est utilisée qui permet de temps réel manipulation de la force et de la direction des gradients de rigidité transmis aux cellules en question. En outre, en affinant les détails et les paramètres de l'analyse, tels que la forme et les dimensions de la micropipette ou la position relative, le placement et la direction du gradient appliqué, l'analyse peut être optimisée pour l'étude de tout mécaniquement type et système de cellules sensibles. Ces paramètres peuvent être modifiés pour modifier de manière fiable le stimulus appliqué et élargir la fonctionnalité et la polyvalence de l'analyse. Cette méthode permet l'examen du mouvement durotactic à long terme aussi bien que des changements plus immédiats dans la signalisation cellulaire et la dynamique morphologique en réponse à la rigidité changeante.

Introduction

Au cours des dernières décennies, l'importance des propriétés mécaniques de l'environnement d'une cellule a acquis une reconnaissance croissante en biologie cellulaire. Différents tissus et matrices extracellulaires ont des rigidités relatives différentes et, comme les cellules migrent dans tout le corps, ils naviguent dans ces changements, en utilisant ces propriétés mécaniques pour les guider^{1,2,3 , 4 ( en} plus) ^{, 5 Annonces , 6} Annonces ^{, 7<....}

Protocole

1. Fabrication d'hydrogels de polyacrylamide déformables avec microsphères fluorescentes intégrées

REMARQUE: Les instructions décrivent la polymérisation d'un hydrogel de 25 kPa d'un diamètre de 22 m et d'une épaisseur d'environ 66 m. Chacun ou tous ces paramètres peuvent être modifiés et les directions à cet égard peuvent être trouvées dans le tableau 1 et dans les notes¹⁷.

1. Activation de plats à fond de verre ou de couvertures
   1. Préparer la solution de travail de silane de liaison pour l'activation d'un plat d'imagerie à fond de verre ou d'un borde....

Résultats

En préparant des micropipettes (figure 1) et en normalisant la génération de force des tractions (figure 2 et figure 3) comme décrit ci-dessus, des conditions durotactiques optimales ont été identifiées pour plusieurs lignées cellulaires. À l'aide de cette technique, telle qu'elle est décrite à la figure 4, les cellules cancéreuses ovariennes SKOV-3¹⁷ et les fibroblastes embryonn.......

Discussion

Démontré ici est un reproductible, un seul-cellule durotaxis analyse qui permet d'évaluer la capacité d'une cellule à modifier son comportement de migration en réponse à des indices mécaniques aigus. Cette technique peut également être utilisée en combinaison avec la microscopie à fluorescence et des protéines de fusion ou biocapteurs appropriés pour examiner la signalisation sous-cellulaire et les événements cytosquelettiques dans les secondes suivant la stimulation mécanique ou sur une plus longue période de temps pend.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acrylamide 40 %  ;	Diagnostic national	EC-810
Persulfate d’ammonium  ;	Fisher	BP179-25
BD20A Générateur haute fréquence	Electro Technic Products	12011A	115 V -  ; Baguette corona portable
Bind Silane (y-méthacryloxypropyltriméthoxysilane) (	Sigma Aldrich	M6514
Bis-acrylamide 2 %  ;	National Diagnostic	EC-820
Capillaires en verre borosilicaté	World Precision Instruments	1B100-4
Branson 2510 Nettoyeur à ultrasons	Bransonic		40 kHz fréquence
Manipulateur grossier	Narshige	MC35A
DMEM	Corning	10-013-CV
DMEM sans rouge phénol	Sigma Aldrich	D5030
Extracteur de micropipette en verre à deux étages	Narshige	PC-10
Facteur de croissance épidermique	Peprotech	AF-100-15
Éthanol	Pharmco-aaper	111000200
Sérum de veau fœtal (qualifié One Shot)	Gibco	A31606-02
Fibronectine  ;	EMD Millipore	FC010
Fluosphères Carboxylate 0,2 um  ;	Invitrogen	F8810, F8807, F8811
Fugene 6	Roche	1815091	1.5 &mu ; g ADN / 6 &mu ; L fugene 6 par boîte de 35 mm
Glacial Acide acétique	Fisher Chemical	A38SI-212
Plat à fond en verre	CellVis	D60-60-1.5-N
Lambeau en verre	Microscopie électronique Sciences	72224-01	22 mm, #1.5
HCl JT	Baker	9535-03
Hellmanex III  ; Concentré de nettoyage spécial	Sigma Aldrich	Z805939	Utilisé à 2 % dans ddH2O pour le nettoyage des lamelles HEPES
poudre	Sigma Aldrich	H3375	Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5
Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light	Uviton International	UV0338
Isopropanol	Fisher Chemical	A417-4
Microforge	Narshige	MF900
Micromanipulateur	Narshige	MHW3
Huile minérale	Sigma Aldrich	M5904
Nanopure Life Science Système UV/UF	Barnstead	D11931	ddH2O
Nikon Eclipse Ti	Nikon
OptiMEM	Invitrogen	31985062
Parafilm M	Bemis Company, Inc	PM-992
PBS			139 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 28,6 mM Na2HPO4, 1,6 mM KH2PO4, pH 7,4
Facteur de croissance dérivé des plaquettes-BB (PDGF-BB)	Sigma Aldrich	P4056
Ref52			Lignée cellulaire de fibroblastes embryonnaires de rat ; Culture en DMEM + 10 % FBS
Ringer’s Buffer			134 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2,4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7,4
SKOV-3	American Type Culture Collection		Culture en DMEM + 10 % FBS
Sulfo-SANPAH  ;	Covachem	; 12414-1
Nettoyeur plasma de table	Harrick Plasma	PDC-32G
TEMED  ;	Sigma Aldrich	T9281-50