Method Article

Étiquetage spécifique des nucléoïdes mitochondriaux pour la microscopie d’illumination structurée time-lapse

DOI:

10.3791/60003

⸱

June 4th, 2020

 ,  , 
1Imaging Facility, Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole décrit l’étiquetage spécifique des nucléoïdes mitochondriaux avec une tache de gel d’ADN disponible dans le commerce, l’acquisition d’une série de time lapse de cellules étiquetées en direct par microscopie d’illumination structurée super-résolution (SR-SIM), et le suivi automatique du mouvement nucléoïde.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les nucléoïdes mitochondriaux sont des particules compactes formées par des molécules d’ADN mitochondrial enduites de protéines. L’ADN mitochondrial code les ARN, les ARR et plusieurs polypeptides mitochondriaux essentiels. Les nucléoïdes mitochondriaux se divisent et distribuent dans le réseau mitochondrique dynamique qui subit la fission/fusion et d’autres changements morphologiques. La microscopie à fluorescence vivante haute résolution est une technique simple pour caractériser la position et le mouvement d’un nucléoïde. Pour cette technique, les nucléoïdes sont généralement étiquetés par des étiquettes fluorescentes de leurs composants protéiques, à savoir le facteur de transcription a (TFAM). Cependant, cette stratégie a besoin d’une surexpression d’une construction fluorescente marquée par des protéines, qui peut causer des artefacts (rapportés pour TFAM), et n’est pas faisable dans de nombreux cas. Les colorants organiques liant l’ADN n’ont pas ces inconvénients. Cependant, ils montrent toujours la coloration des ADN nucléaires et mitochondriaux, manquant ainsi de spécificité aux nucléoïdes mitochondriaux. En tenant compte des propriétés physico-chimiques de ces colorants, nous avons sélectionné une tache de gel d’acide nucléique (SYBR Gold) et avons obtenu l’étiquetage préférentiel des nucléoïdes mitochondriaux dans les cellules vivantes. Les propriétés du colorant, en particulier sa grande luminosité sur la liaison à l’ADN, permettent la quantification ultérieure du mouvement nucléoïde mitochondrial à l’aide d’images d’illumination structurées super-résolution.

Introduction

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Les molécules circulaires d’ADN de 16,5 kbp constituent le matériel génétique des mitochondries, codant 22 tARN, 2 rARN, et 13 polypeptides nécessaires pour les complexes mitochondriaux oxydants de phosphorylation. L’ADN mitochondrial lié au facteur de transcription mitochondrial a (TFAM) et plusieurs autres protéines forment les nucléoïdes mitochondriaux1,2,3,4. Les nucléoïdes mitochondriaux se déplacent et redistribuent entre les composants du réseau mitochondrial5,6 pendant son remodelage morphologique, fission ou fusion selon la phase du cycle cellulaire, le stress, et d’autres facteurs (révisé dans Pernas et al.7). En outre, le mouvement des noyaux mitochondriaux, est impliqué dans la maladie systémique d’érythématosus de lupus8 et peut jouer un rôle dans d’autres maladies. La microscopie de fluorescence est une technique simple pour les études de cellules vivantes des organites, mais la technique a une résolution de 'gt;200 nm, qui est plus grande que la taille des nucléoïdes mitochondriaux (100 nm9,10,11,12). Cette limite a été contournée par des techniques dites de « super-résolution », telles que l’épuisement des émissions stimulées (STED) et la microscopie de localisation à une seule molécule (SMLM)13,14. Jusqu’à présent, les nucléoïdes mitochondriaux et autres ADN ont été photographiés dans des cellules vivantes par microscopie de reconstruction optique stochastique directe (dSTORM)15. Des structures sous-mitochondriales fines avec des positions corrélantes avec l’ADNmn ont été observées par STED dans les cellules vivantes16. Cependant, ces techniques de super-résolution nécessitent une intensité d’éclairage élevée, ce qui provoque des effets phototoxiques sur les cellules vivantes17. Par conséquent, l’imagerie en laps de temps des nucléoïdes mitochondriaux avec la résolution au-delà de la limite de diffraction est difficile. Pour remédier à cette situation, nous avons utilisé une microscopie d’éclairage structurée à super résolution (SR-SIM)18. SIM nécessite une dose de puissance d’éclairage beaucoup plus faible que STED et SMLM19. En outre, contrairement aux techniques STED et SMLM, SIM permet l’imagerie tridimensionnelle (3D) multicolore simple, et il ne nécessite pas de propriétés photophysiques particulières des fluorophores ou de la composition tampon d’imagerie19.

La stratégie conventionnelle pour l’étiquetage des nucléoïdes mitochondriaux dans les cellules vivantes est le marquage fluorescent d’une protéine nucléoïde mitochondriale, comme TFAM20. Cependant, dans de nombreux cas, cette stratégie n’est pas appropriée. En outre, la surexpression de TFAM fluorescente étiquetée par protéines produit un artefact sérieux21. L’étiquetage de l’ADN avec des colorants organiques présente des avantages par rapport à une stratégie basée sur les protéines fluorescentes (FP). Les colorants organiques sont exempts de contraintes liées au marquage FP : elles peuvent être utilisées pour n’importe quel type de cellules ou de tissus et peuvent être utilisées à tout moment d’une expérience. L’imagerie cellulaire vivante des nucléoïdes mitochondriaux a été rapportée avec plusieurs colorants de liaison d’ADN : DAPI22, SYBR Green23, Vybrant DyeCycle24, et picoGreen15,25,26. Un inconvénient substantiel de la plupart des colorants de liaison d’ADN pour l’étiquetage nucléoïde est qu’ils tachent tout l’ADN dans la cellule. Cibler un colorant uniquement à l’ADN mitochondrial est hautement souhaitable. Pour ce faire, une sélection minutieuse d’un colorant possédant des propriétés physico-chimiques appropriées est nécessaire. Les colorants lipophiles possédant la charge positive délocalisée, telle que la rhodamine 123, sont connus pour s’accumuler dans les mitochondries vivantes, qui préservent leur potentiel négatif de membrane. En outre, un colorant idéal pour l’étiquetage spécifique des nucléoïdes mitochondriaux devrait lier l’ADN avec une affinité élevée et émettre une fluorescence lumineuse sur la liaison d’ADN. Compte tenu de ces exigences, certaines cyanines sont prometteuses (par exemple, picoGreen), mais l’ADN nucléaire est abondamment souillé par ces colorants simultanément avec l’ADN mitochondrial15,25,26. Le protocole actuel décrit l’étiquetage spécifique des nucléoïdes mitochondriaux dans les cellules vivantes avec un autre colorant de cyanine, SYBR Gold (SG), et le suivi des nucléoïdes dans les vidéos SIM super-résolution en laps de temps. En outre, les cellules vivantes tachées de SG peuvent être illustrées par n’importe quel type de microscope fluorescent inversé (confocal, disque tournant, épifluorescence, etc.) adapté aux cellules vivantes et équipé d’une source lumineuse de 488 nm.

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Protocol

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REMARQUE: Toutes les lignées cellulaires mentionnées ici ont été cultivées dans le milieu de l’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) de glucose élevé complété par le sérum bovin foetal (FBS), la glutamine, la pénicilline/streptomycine, et le pyruvate. Équilibrer tous les médias et suppléments à utiliser le jour de l’étiquetage et de l’imagerie en les réchauffant jusqu’à 37 oC dans un incubateur fixé à 5% de CO2. Tous les travaux de culture cellulaire, y compris l’étiquetage, se déroulent dans des conditions stériles sous un capot de flux lamineur.

1. Étiquetage des cellules en direct

  1. Un jour avant la procédure d’étiquetage, culture 4 x 105 cellules HeLa dans 2 ml de milieu dans un plat Petri de 35 mm avec #1,5 fond de verre. Des diapositives à chambre multi-puits peuvent être utilisées, mais les volumes doivent être ajustés proportionnellement au volume du puits. Diluer la suspension cellulaire pour avoir environ 50.000 cellules/mL et la graine 2 ml de la suspension cellulaire dans un plat de 35 mm Petri.
  2. Préparer les dilutions suivantes de la solution de stock commercial SYBR Gold (SG) : 1:5,000. Préparer Mitotracker Deep Red (ornée rouge) ou Mitotracker CMXRos Red (tache rouge)(Tableau des matériaux; stock commercial dilué 1:2,000) dans le milieu de culture sans rouge phénol. Préparer les mêmes dilutions ensemble de picoGreen que pour SG.
    REMARQUE: Les solutions décrites à l’étape 1.2 sont les solutions d’étiquetage 2x. Protégez autant que possible toutes les solutions contenant des colorants fluorescents contre la lumière.
  3. Laver les cellules adhérentes avec 2 ml PBS une fois. Ajouter 1 ml de phénol sans milieu de culture au plat Petri de 35 mm. Pour une diapositive à 8 puits, utilisez un volume égal à 1/2 de la capacité totale du puits (p. ex., ajoutez 125 ll si la capacité totale du puits est de 250 ll).
  4. Ajouter 1 mLof la solution d’étiquetage 2x préparée dans l’étape 1,2 à 35 mm De petri plat. Pour une diapositive à 8 puits, utilisez un volume égal à 1/2 de la capacité totale du puits. Incuber les cellules pendant 30 min à 37 oC sous 5% de CO2.
    REMARQUE: N’incuberez pas les cellules avec la solution d’étiquetage DE SG pendant plus de 1 h, parce que l’incubation plus longue causera l’étiquetage de l’ADN nucléaire.
  5. Aspirez soigneusement le milieu contenant les colorants fluorescents et lavez les cellules une fois avec PBS.
  6. Ajouter le milieu de la culture cellulaire sans rouge à phénol et maintenir les cellules dans l’obscurité dans un incubateur de CO2 à 37 oC jusqu’à l’imagerie.
  7. Imagez des cellules vivantes sur un microscope SR-SIM équipé d’une unité d’incubation (voir ci-dessous).

2. Acquisition d’images SR-SIM

  1. Installez un incubateur de scène sur la scène du microscope. Réglez la température désirée et la concentration de CO2 (p. ex., 37 oC et 5 % pour les cellules de mammifères) et restez au chaud pendant au moins 1 h avant de commencer l’acquisition d’images.
  2. Allumez tous les composants du microscope SR-SIM, y compris les lasers, et laissez-les se réchauffer pendant au moins 1 h.
  3. Choisissez un objectif d’immersion à ouverture numérique élevée (NA) (p. ex., huile 100x 1.46 NA) recommandé pour SR-SIM par le fabricant du microscope.
  4. Installez une lame chambrée ou un plat de 35 mm avec des cellules étiquetées (à partir de l’étape 1.6) au stade du microscope incubé.
  5. Localisez la zone d’intérêt sur l’échantillon, de préférence avec des oculaires. Pour obtenir la meilleure qualité d’imagerie SR-SIM, choisissez les cellules bien attachées au verre.
  6. Utilisez une caméra haute gamme haute gamme multipliante d’électron haute gamme (EM-CCD) pour acquérir des images SR-SIM.
  7. À l’aide du logiciel d’acquisition d’images, définissez un gain EM élevé recommandé pour la caméra utilisée (p. ex., 300).
  8. Avant d’acquérir la série time lapse pour le suivi nucléoïde, acquérir une image SR-SIM bicolore du même champ de vision : un canal pour la coloration mitochondriale et un autre pour SG. Réglez le premier canal de couleur approprié à la tache mitochondriale utilisée (p. ex., pour une tache mitochondriale rouge lointain, définissez l’excitation à 633 nm ou plus et un filtre d’émission de 650 nm longpass). Pour le signal SG, définissez l’excitation à 488 nm et un filtre d’émission de bandepass de 500 à 550 nm.
  9. À l’aide du logiciel, définissez la puissance laser la plus basse possible pour les lignes de tache rouge 488 nm et lointaines.
    REMARQUE: Un réglage typique est de 1% de puissance de sortie laser ajustée par un filtre à thon rouge acousto-optique (AOTF).
  10. Si le microscope SIM n’acquiert des canaux que de façon séquentielle (configuration d’une seule caméra), éteignez le canal de détection des taches rouge foncé.
  11. Définissez l’acquisition d’un seul plan focal en éteignant l’acquisition de la pile Z en cochant la boîte Z-stack dans le logiciel.
  12. Définissez le temps d’exposition de la caméra EM-CCD le plus court possible.
  13. Définissez trois rotations de la grille plutôt que cinq rotations.
  14. Pour augmenter le taux d’image, dans l’onglet Acquisition du logiciel, définissez la caméra pour lire les données uniquement à partir de la zone centrale du capteur de caméra au lieu de "Full Chip« .
    REMARQUE: Par exemple, passer de la lecture d’une zone de 1 000 x 1 000 pixels capteur complet à la lecture seulement 256 x 256 pixels permet une réduction du temps d’exposition de la caméra de 50 ms à 13,4 ms et le temps de laps total de 1,8 s à 1,2 s. Si seulement une partie centrale du capteur de la caméra est lue, alors le champ de vision sera très petit pour un objectif 63x ou 100x généralement utilisé pour SR-SIM. Un temps d’exposition plus court réduira le rapport signal-bruit des images.
  15. Optimiser la puissance laser et le temps d’exposition de la caméra : acquérir des images bidimensionnelles SR-SIM (2D) de cellules étiquetées à plusieurs valeurs de puissance laser (p. ex., 0,5 %, 1 %, 1,5 %, 2 %) et plusieurs temps d’exposition (p. ex., 13,4 ms, 25 ms, 50 ms).
  16. Traiter les jeux de données SIM bruts (voir étape 3.1).
  17. Choisissez des temps d’exposition à la puissance laser et à la caméra qui produisent des images SIM avec des taches lumineuses dans les mitochondries (c.-à-d. les nucléoïdes) avec peu ou pas d’artefacts générés par le traitement SIM. Inspecter les zones à l’extérieur des mitochondries (p. ex., 1 % de puissance du laser à état solide de 488 nm et 25 ms exposition de la caméra EM-CCD).
  18. Démarrer l’acquisition de la série time lapse en utilisant les paramètres optimisés dans les étapes 2.15-2.17.

3. Traitement et analyse des données

  1. Traiter les jeux de données SIM bruts avec le module d’éclairage structuré d’un logiciel approprié(Tableau des matériaux) : choisissez la case à cocher Automatique pour les paramètres de traitement SIM. Pour le traitement automatique de plusieurs fichiers, utilisez l’outil de traitement par lots, désélectionner le courant d’utilisation pour le lot,cliquez sur Run Batch et sélectionnez plusieurs fichiers pour le traitement SIM.
  2. Convertir les jeux de données de séries chronojudères traités par SIM en format ims avec le logiciel de convertisseur de fichiers Imaris (c’est-à-dire la version correspondant à la version du logiciel Imaris).
  3. Ouvrez un fichier converti dans le logiciel (version 8.4.1 ou plus tard) qui a une licence pour le module Lineage (ou Track).
  4. Démarrer le magicien de la création "Spots" en cliquant sur l’icône Add New Spots. Un magicien de la création sera lancé.
  5. Choisissez l’onglet Créer de l’assistant.
  6. Sur la première étape de l’assistant, cliquez sur Track Spots (au fil du temps) et passez à la deuxième étape de l’assistant.
  7. Définissez le diamètre XY estimé à 0,1-0,15 m, cliquez sur La soustraction de fond et passez à la troisième étape.
  8. Ajuster le seuil dans le filtre "Qualité" en faisant glisser la ligne verticale dans l’histogramme afin que la majorité des nucléoïdes soient détectés comme des « taches », tandis que les artefacts ne sont pas détectés (c’est-à-dire que les taches détectées sont marquées comme des boules superposées sur l’image). Vérifiez si c’est le cas sur chaque image et réajuster le seuil si nécessaire. Passez à la quatrième, puis à la cinquième étape de l’assistant.
  9. Choisissez l’algorithme Autoregressive Motion. Définir la distance maximale à 0,5 m. Définir la taille de l’écart max à 0.
  10. Regardez chaque image de la série de temps et vérifiez si de fausses pistes sont tracées et si des écarts entre les pistes sont introduits (les pistes construites par le magicien avec les paramètres actuels sont instantanément marquées comme des lignes superposées sur l’image). Ajuster "Max Distance" si nécessaire. Passez à la sixième étape de l’assistant. Choisissez le filtre Track Duration et fixez un seuil de 3 à 5 s.
  11. Si les taches ou les pistes actuellement détectées ne sont pas optimales, revenez aux étapes précédentes de l’assistant à l’aide de boutons de navigation (au bas de la fenêtre des sorciers) nécessaires pour affiner tout paramètre pour les taches ou les pistes de création.
  12. Lorsque les paramètres affinés permettent au logiciel de détecter tous les spots et de construire correctement les pistes, cliquez sur le bouton de navigation de flèche verte dans l’assistant pour confirmer la création des pistes.
  13. Extraire les statistiques des pistes en cliquant sur la fenêtre de l’icône Statistics. Choisissez les paramètres de statistiques nécessaires (ongletsvaleurs détaillées et moyennes sous statistiques) et exportez les valeurs sous forme de fichiers csv en cliquant sur l’icône Floppy Drive pour la quantification et la visualisation.
    REMARQUE: La vitesse maximale de la trajectoire, la vitesse moyenne de la trajectoire, la longueur de la piste et le déplacement de la voie sont des exemples de paramètres importants.
  14. Si le jeu de données d’image doit être présenté ou publié, créez des instantanés et/ou des fichiers vidéo représentant la série time lapse avec des pistes superposées en option à l’aide des outils Snapshot ou Animation.

4. Acquisition d’image confocale

  1. Installez un incubateur en phase sur le microscope, définissez la température désirée et la concentration de CO2 (c.-à-d. 37 oC et 5 % pour les cellules de mammifères) et restez au chaud pendant au moins 1 h avant de commencer l’acquisition d’images.
  2. Allumez tous les composants d’un microscope à balayage laser confocal, y compris les lasers, et laissez-les se réchauffer pendant au moins 1 h.
  3. Choisissez un objectif de grossissement moyen à élevé souhaité et un échantillonnage spatial selon les critères nyquist.
  4. Pour le canal SG, définissez l’excitation à 488 nm et une portée de détection de 500 à 550 nm. Pour le canal de tache mitochondrial, réglé à 561 nm et 570-630 nm émission pour un colorant rouge, ou 633 nm excitation et 'gt;650 nm émission pour un colorant rouge lointain.
  5. Réglez la puissance laser la plus basse possible (généralement 1 % ou moins) qui permet l’acquisition des signaux avec des gains de détecteurs de PGP de 700 mV.
  6. Acquérir des images confocales bicolores des cellules, où les nucléoïdes mitochondriaux sont détectés dans le « canal SG » et les mitochondries sont détectées dans le canal « rouge » ou « rouge lointain ».

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Results

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Caractérisation de l’étiquetage des cellules vivantes avec SG
Tout d’abord, la distribution de SG dans les cellules lors de l’incubation avec le colorant à diverses dilutions a été caractérisée par microscopie confocienne. Après l’incubation avec des concentrations élevées de SG ou picoGreen, les deux colorants ont principalement étiqueté les noyaux et ont montré une coloration piquante dans le cytoplasme(figure 1), de même que les données...

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Discussion

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Il y a plusieurs composantes critiques au protocole : pour obtenir l’étiquetage préférentiel de l’ADN mitochondrial, la concentration du colorant de liaison d’ADN pendant l’incubation devrait être maintenue très basse (p. ex., une dilution de 1:10 000 d’un stock commercial typique), et le temps d’incubation devrait être de 30 min. Le temps d’incubation ne doit jamais dépasser 1 h. Le colorant SYBR Gold doit être utilisé; d’autres colorants liant l’ADN ne sont pas assez brillants pour générer un signal fort lors de l’étiq...

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Disclosures

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

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Les auteurs reconnaissent Asifa Akhtar et Angelika Rambold (à la fois Max Planck Institute for Immunobiology and Epigenetics) pour la fourniture de cellules HeLa.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Elyra PS1Carl Zeissmultimodal à super-résolution contenant un module pour la microscopie à illumination structurée à super-résolution (SR-SIM)
Imaris 8.4.1Bitplane/Oxford InstrumentsProgiciel de perception et de visualisation d’images
iXon 885Andor TechnologiesCaméra EMCCD avec capteur rétroéclairé
LSM880 AiryscanCarl ZeissMicroscope confocal à balayage laser avec détecteur à réseau
Mitotracker CMXRos RedThermoFischerM7512mitochondriale à cellules vivantes rouges coloration
Mitotracker Deep Red FMThermoFischerM22426rouge lointain cellule vivante mitochondriale coloration mitochondriale
picoGreenThermoFischerP7581cellule perméable
ADN colorant Plan Apochromat 100x/1.46 Objectif d’huileCarl Zeiss
SYBR GoldThermoFischerS11494cellule permean DNA stain
Zen Black 2012 logicielCarl ZeissLogiciel d’acquisition et de traitement d’images
microscope High glucose DMEM GIBCO/ThermoFisher 31966021 ibidi 35 mm, fond en verre Ibidi Gmbh 81158 ibidi 8-well microSlide, fond en verre Ibidi Gmbh 80827

References

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