Method Article

Discrimintion et cartographie des transcriptions primaires et traitées dans la mitochondndrion de maïs à l'aide d'une stratégie circulaire basée sur rt-PCR

DOI:

10.3791/60019

⸱

July 29th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources, South China Agricultural University, 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Molecular Breeding, College of Agriculture, South China Agricultural University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons une stratégie circulaire basée sur RT-PCR en combinant la RT-PCR circulaire, la RT-PCR quantitative, le traitement polyphosphatase d'ARN 5' et la tache nordique. Ce protocole comprend une étape de normalisation pour minimiser l'influence du triphosphate instable de 5' et il convient de discriminer et de cartographier les transcriptions primaires et traitées accumulées de façon stable dans la mitochondrie du maïs.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans les mitochondries végétales, certaines transcriptions à état stable contiennent un triphosphate de 5' dérivé de l'initiation à la transcription (transcriptions primaires), tandis que les autres contiennent 5' monophosphate généré sapostolassme post-transcriptionnelle (transcriptions traitées). Pour faire la distinction entre les deux types de transcriptions, plusieurs stratégies ont été élaborées, et la plupart d'entre elles dépendent de la présence ou de l'absence de triphosphate de 5'. Cependant, le triphosphate au termini primaire de 5' est instable, et il entrave une discrimination claire des deux types de transcriptions. Pour différencier et cartographier systématiquement les transcriptions primaires et traitées accumulées de façon stable dans la mitochondrie du maïs, nous avons développé une stratégie circulaire basée sur la RT-PCR (cRT-PCR) en combinant cRT-PCR, RNA 5' traitement polyphoshpatase, quantitatif RT-PCR (RT-qPCR), et Northern blot. À titre d'amélioration, cette stratégie comprend une étape de normalisation de l'ARN pour minimiser l'influence du triphosphate instable de 5'.

Dans ce protocole, l'ARN mitochondrial enrichi est pré-traité par l'ARN 5' polyphosphatase, qui convertit 5' triphsophate en monophosphate. Après la circularisation et la transcription inverse, les deux CDNA dérivés de 5' polyphosphatase-traités et non-traités RNAs sont normalisés par le maïs 26S rRNA mature, qui a une extrémité traitée de 5' et est insensible à 5' polyphosphatase. Après normalisation, les transcriptions primaires et traitées sont discriminées en comparant les produits cRT-PCR et RT-qPCR obtenus à partir des ARN traités et non traités. Les termini de transcription sont déterminés par le clonage et le séquençage des produits cRT-PCR, puis vérifiés par la tache nordique.

En utilisant cette stratégie, la plupart des transcriptions à l'état stable dans la mitochondrie du maïs ont été déterminées. En raison du modèle compliqué de transcription de quelques gènes mitochondriques, quelques transcriptions stables-état n'ont pas été différenciées et/ou cartographiées, bien qu'elles aient été détectées dans une tache nordique. Nous ne sommes pas sûrs si cette stratégie est appropriée pour discriminer et cartographier les transcriptions à état stable dans d'autres mitochondries végétales ou dans les plastides.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans les mitochondries végétales, de nombreux ARN matures et précurseurs sont accumulés sous forme d'isoformes multiples, et les transcriptions à état stable peuvent être divisées en deux groupes en fonction de la différence à leurs 5' extrémités1,2,3, 4. Les transcriptions primaires ont des extrémités triphosphate de 5' qui sont dérivées de l'initiation de transcription. En revanche, les transcriptions traitées ont 5' monophosphate généré par le traitement post-transcriptionnel. La discrimination et la cartographie des deux types de transc....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Conception d'apprêt

  1. Concevoir des amorces spécifiques aux gènes pour la transcription inversée (RT) à l'aide d'un logiciel de conception d'amorce PCR (Table of Materials) basé sur les règles générales de conception d'amorce17.
    REMARQUE: Les amorces DE sont très spécifiques aux transcriptions cibles, et elles sont généralement ancrées sur la partie 5' des séquences de codage (ARNm matures et ARN précurseurs), ou 500 à 600 nt en aval de l'extrémité prévue de 5' (18S et 26S rARN).
  2. Concevoir des paires d'amorces divergentes pour amplifier les transcriptions circulaires par cRT-PCR.
    REMA....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Estimation de l'efficacité de la circularisation de l'ARN mitochondrial

Dans une étude précédente, les ARN totaux et mitochondriaux ont été utilisés pour la cartographie cRT-PCR de termini de transcription mitochondriale dans Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), et les deux types d'ARN ont donné des résultats de cartographie similaires12. Au départ, nous avons également u.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans une étude précédente, les ARN totaux et mitochondriaux de la culture de suspension cellulaire d'Arabidopsis ont été employés pour cartographier le termini mitochondrial de transcription par cRT-PCR, et des résultats semblables ont été obtenus12. Cependant, seulement l'ARN mitochondrial enrichi a été employé pour cartographier le termini de transcription mitochondrial dans beaucoup d'autres études1,2,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (subvention no 31600250, Y.Z.), les projets scientifiques et technologiques de la ville de Guangzhou (subvention no 201804020015, H.N.), et le China Agricultural Research System (subvention no. CARS-04-PS09, H.N.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Acide acétiqueAladdin, ChineA112880Pour préparer 1x tampon TAE
Applied Biosystems 2720 ThermocycleurThermo Fisher Scientific, États-Unis4359659Thermocycleur pour l’amplification de la PCR
Acide ascorbiqueSigma-aldrich, États-UnisV900134Pour la préparation du tampon d’extraction
Biowest AgaroseBiowest, Espagne9012-36-6Pour résoudre la PCR produits et ARN
Albumine sérique bovineSigma-aldrich, États-UnisA1933Pour la préparation du tampon d’extraction Bleu de
bromophénolSigma-aldrich, États-UnisB8026Pour la préparation du tampon de chargement pour l’électrophorèse sur gel d’agarose et le transfert de Northern
DEPC Sigma-aldrich, États-UnisV900882Désactivation de la RNase
DIG Northern starter kitRoche, États-Unis12039672910Pour le marquage DIG-RNA et le transfert de Northern. Ce kit contient les réactifs pour la transcription-marquage de l’ARN avec l’ARN polymérase DIG et T7, l’hybridation et la détection chimiluminescente.
EDTASigma-aldrich, États-UnisV900106Pour la préparation du tampon d’extraction et 1x tampon TAE
EGTASigma-aldrich, États-UnisE3889Pour la préparation du tampon de lavage
Système de documentation du gelBio-Rad, États-UnisGel Doc XR+Pour imager le gel d’agarose
GlycérolSigma-aldrich, États-UnisG5516Pour la préparation du tampon de chargement pour l’électrophorèse du gel d’agarose
GoldView II (5 000x)Solarbio,. ChineG8142Coloration de l’ADN
Hybond-N+, Membrane en nylonAmersham Biosciences, États-UnisRPN119Pour le Northern blot
Image LabBio-Rad, USAImage Lab 3.0Image gel, et comparez l’abondance des produits PCR.
KH2PO4Sigma-aldrich, États-UnisV900041Pour la préparation du tampon d’extraction
KOHAladdin, ChineP112284Pour la préparation du tampon d’extraction
L-cystéineSigma-aldrich, États-UnisV900399Pour la préparation du tampon d’extraction
MillexMillipore, États-UnisSLHP033RBPour l’extraction stérile et tampons de lavage par filtration
MiraclothCalbiochem, États-Unis475855-1RPour filtrer les tissus du grain broyé
MOPSSigma-aldrich, États-UnisV900306Pour la préparation du tampon de fonctionnement pour Northern blot
NanoDrop ThermoFisher Scientific, États-Unis2000CPour le dosage de la concentration et de la pureté de l’ARN
NaOHSigma-aldrich, États-UnisV900797Pour préparation du tampon de lavage
vecteur de clonage simple pEASY-BluntTransGen Biotech, ChineCB111Clonage de la bande récupérée sur gel. Il contient un promoteur T7 plusieurs pb en amont du site d’insertion.
Phanta max super-fidélité ADN polyméraseVazyme, ChineP505ADN polymérase pour l’amplification par PCR
Polyvinylpyrrolidone 40Sigma-aldrich, États-UnisV900008Pour la préparation du tampon d’extraction
Primer Premier 6.24PREMIER Biosoft, États-UnisPrimer Premier 6.24Pour concevoir des amorces pour la transcription inverse et l’amplification par PCR
PrimeScript IITakara, Japon2690Pour synthétiser le premier brin d’ADNc
PureLink RNA Mini kitThermo Fisher Scientific, États-Unis12183025Pour la purification
l’ARN ARN 5' polyphosphataseEpicentre, États-UnisRP8092HPour convertir le triphosphate 5' en
inhibiteur de RNaseNew England Biolabs, Royaume-UniM0314Un composant des réactions d’auto-ligature de l’ARN et de traitement de la polyphosphatase 5', et il est utilisé pour inhiber l’activité de la RNase.
Acétatede sodium Sigma-aldrich, États-UnisV900212Pour la préparation d’un tampon de fonctionnement pour le chlorure de sodium Northern blot
Sigma-aldrich, États-UnisV900058Pour la préparation de 20x supermixes SSC
SsoFas evaGreenBio-Rad, États-Unis1725202Pour RT-qPCR
T4 ARN Ligase 1New England Biolabs, Royaume-UniM0437Pour la circularisation de l’ARN
Tétrasodique pyrophosphateSigma-aldrich, États-Unis221368Pour la préparation du tampon d’extraction
Kit de purification midi TIANgelTiangen Biotech, ChineDP209Pour purifier les fragments d’ADN du gel d’agarose
TrisAladdin, ChineT110601Pour préparer 1x tampon TAE
réactif TRIzolInvitrogen, États-Unis15596026Pour extraire l’ARN mitochondrial.
Kit universel de purification de l’ADNTiangen Biotech, ChineDP214Pour récupérer les plastmides linéarisés de la réaction de digestion enzymatique de restriction
Xylène cyanol FFSigma-aldrich, USAX4126Pour la préparation du tampon de chargement pour l’électrophorèse sur gel d’agarose
de monophosphate

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, Y., et al. Major contribution of transcription initiation to 5'-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize. RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).
  2. Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Circular RT PCRRNA 5 PolyphosphataseMitochondrial RNA ExtractionQuantitative RT PCRNorthern BlotMaize MitochondrionTermini MappingPrimary Processed TranscriptsRNA NormalizationDivergent Primers

Related Articles