Un modèle de lésions pulmonaires aigues autolimitées par l'instillation unilatérale de l'acide intrabronchique

Le syndrome de détresse respiratoire aigu (SDR) est une cause importante d'insuffisance respiratoire aigue¹. Il s'agit d'une maladie commune et mortelle ou invalidante qui se produit dans 10% de tous les patients admis dans les unités de soins intensifs^dansle monde 2 . Selon la définition³de Berlin , le SDA est défini par l'inséctuorisation de l'insuffisance respiratoire hypoxémique et des infiltrations pulmonaires bilatérales sur des radiographies thoraciques qui ne s'expliquent pas par une insuffisance cardiaque⁴. La pathobiologie sous-jacente est caractérisée par une réponse inflammatoire excessive. Le poumon peut être blessé directement, comme dans la pneumonie ou avec l'aspiration gastrique d'acide, ou indirectement, comme dans le sepsis ou après des transfusions sanguines multiples^4. Suite à l'insulte initiale, la pathogénie ARDS progresse en trois phases : les phases exsudatives, prolimiques et fibrotiques¹. Ces phases sont caractérisées par des mécanismes immunitaires et de réparation moléculaires et cellulaires distincts qui déterminent le pronostic pour les patients atteints du SVERS. Les soins de soutien demeurent le pilier des patients atteints du SVERS; actuellement, il n'y a pas de traitements pharmacologiques efficaces pour ardeur, il y a donc un besoin urgent de nouvelles recherches sur cette condition dévastatrice⁴.

La dysrégulation de la réponse immunitaire innée pendant la phase exsudative contribue à l'début aigu de l'ARDS et à l'échec respiratoire associé¹. La signalisation pro-inflammatoire puissante de médiateur orchestre les réponses immunitaires initiales, menant à la perturbation de la barrière alvéolaire-capillaire, à l'oème alvéolaire diffus, et à l'infiltration de neutrophile au site des dommages de tissu de poumon^4. Dans ARDS, les signaux de freinage inefficaces pour l'inflammation aigue prédisposentà l'échec de poumon et peuvent retarder la catabasis opportune du tissu pulmonaire blessé 5. À cette fin, l'étude préclinique sur les mécanismes endogènes d'initiation et de pro-résolution de l'ARDS peut découvrir de nouvelles stratégies thérapeutiques. Une telle enquête exige des modèles expérimentaux in vivo auto-limités de lésions pulmonaires aigues qui ressemblent étroitement aux caractéristiques de l'ARDS humain, permettant l'interrogation des mécanismes sous-jacents aux phases d'initiation et de résolution des lésions tissulaires.

Le modèle murine présenté ici produit des lésions pulmonaires aigues directes qui démontrent les processus pathobiologiques cardinaux de l'ARDS exsudatif, à savoir la perturbation de barrière alvéolaire-capillaire et l'infiltration de neutrophiles. La méthode s'appuie sur l'instillation intra-bronchique sélective de HCl par cannulation de la bronche gauche de mainstem, localisant la blessure et la réponse inflammatoire au poumon gauche ; le poumon droit non blessé peut être utilisé comme un contrôle interne pour certaines déterminations des lésions tissulaires et de l'inflammation. En outre, les lésions pulmonaires unilatérales ne sont pas mortelles et dévoilent un programme de résolution. Ceci offre une fenêtre distincte sur la résolution de l'inflammation pulmonaire qui peut être exploitée pour identifier les médiateurs et les mécanismes cellulaires pro-résolvants endogènes et pour ouvrir de nouvelles avenues thérapeutiques pour ARDS qui met l'accent sur la physiologie de résolution et pharmacologie.

Toutes les procédures relatives aux animaux ci-dessous ont été examinées et approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux du Brigham and Women's Hospital (Protocole #2016N000356).

REMARQUE: La technique stérile a été suivie pour toutes les procédures de survie. Un champ stérile a été établi pour chaque chirurgie utilisant une serviette stérile de drapé, alors que les chirurgiens ont porté des gants chirurgicaux stériles, des chapeaux, des masques, et des manteaux propres de laboratoire. Tous les instruments chirurgicaux ont été stérilisés utilisant un autoclave, et la stérilité a été maintenue utilisant un stérilisateur de perle.

1. Préparation de 0.1 N HCl

1. Ajouter 11 ml de ddH₂O dans une bouteille en verre ambre. Ajouter lentement 1 ml de 37 % de HCl (12 N) pour créer un stock de travail de 1 N HCl.
   MISE EN GARDE: Assurez-vous que HCl est ajouté dans l'eau. Il s'agit d'un problème de sécurité parce que l'ajout d'eau directement à l'acide peut causer l'acide à bouillir et éclabousser hors de la bouteille. Lors de la manipulation hCl concentré, assurez-vous que l'acide est conservé dans une hotte chimique ventilée et l'équipement de protection individuelle approprié est porté, y compris la blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de sécurité.
2. Ajouter lentement 4 ml du stock de travail HCl précédemment dilué en 35 ml de ddH₂O dans un tube conique de 50 ml pour créer un stock expérimental HCl de 0,1 N.
3. Mesurer le pH du stock expérimental à l'aide d'une sonde de pH électronique après un étalonnage à deux points à l'aide de solutions de pH à faible. Titrate à pH 1.1 en utilisant des solutions de stock NaOH ou HCl au besoin afin que le volume final soit de 40 ml.
   REMARQUE: Il peut être difficile de mesurer les faibles valeurs de pH. Pour assurer une mesure précise, assurez-vous que la sonde de pH est correctement calibrée à l'aide de faibles normes de pH pour éviter la sur-extrapolation de la mesure.
4. Immédiatement avant l'expérience, filtrer 1 à 2 ml du stock expérimental de HCl à l'utilisation d'un filtre stérile de 0,22 m dans un tube microcentrifuge stérile.

2. Instillation intra-bronchique sélective de HCl

1. Préparation de la zone chirurgicale
   1. Induire l'anesthésie générale en délivrant un mélange de kétamine (100 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) par injection intrapéritone. Assurez-vous que la souris est complètement anesthésiée en serrant doucement le bout de la queue ou du pied arrière. Le manque de réponse de sevrage est exigé avant de faire une incision de peau.  Administrer des bolus d'anesthésie supplémentaires, si nécessaire.
   2. Fournir 0,1 mg/kg de buprénorphine sous-cutanée sous les éraflures du cou. L'analgésique préopératoire renforcera l'effet de l'anesthésie et améliorera la douleur pré- et postopératoire résultant de la procédure.
   3. Utilisez des tondeuses électriques pour raser doucement la zone chirurgicale sur la surface ventrale de la souris, sous le menton dans la région cervicale de la gorge, en utilisant des coups lents vers le bas. Enlever la fourrure lâche pour exposer complètement la peau sous-jacente.
   4. Préparer la zone chirurgicale en écouvillonnant le site rasé avec 10% povidone-iode solution. Après l'application de la solution aseptique, nettoyer le site à l'aide d'un écouvillon d'alcool isopropyl 70%. Répétez cette étape 3x.
2. Isoler la trachée
   1. Placez la souris en position de supine sur une carte chirurgicale propre et couvrez la souris dans un rideau chirurgical stérile tout en maintenant l'exposition de la zone chirurgicale. Sécurisez le rideau en place.
   2. Faire une incision longitudinale de 0,5 cm dans la peau au-dessus de la trachée et des glandes salivaires. Utilisez des forceps dentelés légèrement courbés pour retirer soigneusement la peau et séparer doucement les glandes salivaires pour exposer les muscles trachéaux.
   3. À l'aide de forceps dentelés pour la dissection émoussée, poussez doucement les muscles paratrachéals et taquinez le fascia qui entoure la trachée jusqu'à ce que les anneaux cartilagineux de la trachée soient complètement exposés.
   4. Utilisez des forceps dentelés entièrement courbés pour soulever la trachée et séparer le tissu conjonctif entre le rétro-trachée et le rétro-fascia. Une fois que le tissu conjonctif est détaché, la pointe des forceps doit glisser complètement derrière la trachée.
   5. Gardez les forceps incurvés derrière la trachée et saisissez un morceau de 10 à 15 cm de suture de soie tressée de 4 à 0 avec les pointes des forceps. Tirez la suture derrière la trachée de sorte qu'il y ait une longueur égale de chaque côté.
   6. Une fois la suture en place, tirez doucement sur les côtés de la suture vers le postérieur de la souris et maintenez les côtés en place.
3. Cannulating sélectivement la bronche gauche de mainstem et instillant HCl
   1. Prenez un angiocatheter de 24 G x 3/4 po et insérez l'aiguille, vel up, dans la région antérieure de la trachée entre les premiers et deuxièmes anneaux trachéaux. Une fois que l'insertion appropriée est confirmée par la visualisation directe de la pointe de l'aiguille dans le lumen trachéal, relâchez la suture et avancez la canule au-dessus de l'aiguille et dans la trachée jusqu'à ce que la résistance soit atteinte, puis retirez l'aiguille. Angle de la direction de l'insertion vers la bronche de tige principale gauche pour l'instillation sélective dans le poumongauche.
   2. Une fois la canule en place, saisissez fermement le port d'injection pour empêcher le cathéter de se déplacer.
   3. À l'aide d'une pipette P200 et d'une pipette stérile P200, inculquez 2,5 mL/kg (50 l pour une souris de 20 g) de HCl filtré stérile 0,1 N dans le cathéter, suivi d'un volume d'air identique.
   4. Retirez rapidement le cathéter et soulevez le conseil chirurgical à un angle de 60 degrés pendant 30 s.
4. Fermeture de la zone chirurgicale
   1. Poser le panneau chirurgical à plat et enlever la suture derrière la trachée.
   2. Utilisez 4-0 suture de soie tressée enduite de cire pour fermer l'incision de la peau à l'aide de 2 à 3 points de suture.

3. Soins postopératoires

1. Une fois l'incision fermée, placez la souris sur le côté gauche sur un coussin chauffant chaud jusqu'à ce que la souris se remette de l'anesthésie. Commencez à surveiller la souris pour la douleur et le niveau d'activité avant de le retourner à un logement normal.
   REMARQUE: La buprénorphine doit être administrée à 0,1 mg/kg sous-cutanée tous les 6-12 h pendant les 24 premières heures. Si la douleur persistante de percée est présente, prolongez le régime analgésique jusqu'à ce que la douleur s'apaise.

4. Lung Entier Bronchoalveolar Lavage (BAL) et Leukocyte Immunophénotytyping

1. Euthanasier la souris en administrant 3fois la dose de kétamine/xylazine utilisée à l'étape 2.1.1.
   1. Pour différencier les neutrophiles interstitiels et intravasculaires, injectez par voie intraveineuse un anticorps Ly6G étiqueté fluorophore sélectionné 5 min avant l'euthanasie. Cette étiquette devrait être adaptée à la détection par cytométrie de flux afin de distinguer les neutrophiles intravasculaires des neutrophiles interstitiels et alvéolaires, qui seront étiquetés pendant la préparation des tissus avec un fluorophore différent (voir ci-dessous).
2. Placez la souris sur une planche chirurgicale et accrochez les incisifs antérieurs autour d'une boucle de suture de soie tressée 2-0.
3. Suivez les étapes 2.2.2'2.2.6. pour préparer la trachée pour cannulation.
   REMARQUE: Assurez-vous que le diaphragme n'est pas perforé pour maximiser la pression de gonflement trans-alvéolaire pendant le lavage pulmonaire; la conformité gauche de poumon diminue après blessure, qui peut exiger une exigence plus élevée de pression trans-alvéolaire pour le lavage de poumon.
4. Cannuler la trachée après l'étape 2.3.1, mais ne pas avancer le cathéter en dessous de la carina; insérer le cathéter parallèle à la trachée.
5. Une fois le cathéter inséré, attachez la suture autour de la trachée pour maintenir le cathéter en place.
6. Instiller et retirer deux aliquots consécutifs de 1 ml de PBS glacé -/- (sans magnésium ni calcium) avec 0,6 mM EDTA à l'aide d'une seringue de 1 cc. Pour l'immunophénotypage par cytométrie d'écoulement, retirez chaque aliquot et retournez à un tube FACS en polystyrène de 5 ml sur la glace.
7. Pour assurer l'euthanasie, effectuer une thoracotomie à l'aide de ciseaux chirurgicaux suivis d'une ponction cardiaque. Les poumons peuvent être récoltés pour un traitement ultérieur.
8. Centrifuger le BAL pendant 10 min à 800 g à 4 oC pour granuler les cellules.
9. Décant le supernatant dans un tube microcentrifuge de 2 ml et aliquot dans des tubes microcentrifuges de 1,5 ml. Conserver à -80 oC pour une analyse ultérieure.
10. Resuspendre le granule de cellules dans PBS -/- avec 2% FBS pour l'analyse différentielle de leucocyte par cytométrie de flux.
11. Pour différencier les neutrophiles interstitiels et intravasculaires, retirez séparément le poumon gauche et le poumon droit et traitez les poumons pour la cytométrie du débit comme dans Abdulnour et al. 2014⁶.
12. Taisez la suspension cellulaire résultante à l'aide d'anticorps FACS sélectionnés, en veillant à tacher le Ly6G qui est conjugué à un fluorophore différent de l'anticorps Ly6G de l'étape 4.1.1.

5. Évaluation de la perméabilité de la barrière alvéolaire à l'aide de la teinture bleue d'Evan (DME)

1. Injectez par voie intraveineuse le colorant bleu d'Evan (40 mg/kg) 30 min avant l'euthanasie.
2. Euthanasiez la souris à l'aide d'un surdosage de kétamine/xylazine (étape 4.1).
3. Pour mesurer l'intégrité de la barrière alvéolaire, suivez les étapes 4.2-4.9 pour la collection BAL.
4. Transférer 100 l de BALF sur une microplaque de 96 puits en bas, ainsi que 100 l de normes EBD en double. Utilisez PBS -/- comme un blanc.
5. Utilisez un lecteur de microplaques pour mesurer l'absorption du BALF à 620 nm et 740 nm. Utilisez l'absorption à 740 nm pour corriger la contamination par l'hème dans les échantillons⁷.
6. Pour mesurer l'intégrité de la barrière vasculaire, perfuser les poumons en injectant lentement 5 ml de PBS glacé -/- à travers le ventricule droit du cœur. Retirez le poumon gauche.
7. Séchez le poumon gauche pendant 72 h à 58 oC pour enlever l'excès d'eau.
8. Traiter le tissu pulmonaire séché comme dans Radu et Chernoff 2013⁸, et mesurer les absorbances à 620 nm et 740 nm.

6. Histologie pulmonaire

1. Cannulement de la trachée en suivant les étapes 4.1-4.5.
2. Pour fixer la pression des poumons à 20 cm H₂O, utilisez un support et une pince d'anneau pour élever une seringue de 60 ml équipée d'un tube à valve et remplie d'une solution fixative sélectionnée (p. ex. fixative au zinc) de sorte que le ménisque de la solution fixative soit de 20 cm au-dessus de la solution fixative. Poumons.
3. Fixez le tube au cathéter et ouvrez la valeur. Remplissez lentement les poumons de fixatif jusqu'à ce qu'ils cessent de gonfler.
4. Retirer le cathéter 3/4 de la sortie de la trachée. Attachez la trachée avec la suture avant d'enlever complètement le cathéter pour minimiser la perte de fixatif.
5. Enlever les poumons et le cœur en bloc.
   REMARQUE: Assurez-vous que les poumons ne sont pas perforés pendant l'enlèvement pour conserver la pression infusée fixative.
6. Fixer les poumons pendant 24 h dans 25 ml de fixatif à température ambiante.
7. Laver les poumons fixes pour des intervalles séquentiels de 20 min en PBS -/-, 30% d'éthanol et 50% d'éthanol.
8. Après le dernier lavage, entreposez les poumons dans 70% d'éthanol pour le traitement de l'histologie comme dans Eickmeier et al. 2013⁹.

L'instillation sélective de HCl intra-bronchique a comme conséquence des dommages aigus unilatéraux de poumon

La méthode d'instillation intra-bronchique sélective de HCl dans la bronche gauche de mainstem est illustrée dans la figure 1A. La lésion pulmonaire aigue qui en résulte implique l'ensemble du poumon gauche, et après l'administration intraveineuse de la DME et de la perfusion pulmonaire, l'EBD est resté seulement dans le poumon gauche (Figure 1B). L'extravasation de la DEB dans le poumon gauche a été quantifiée et s'est avérée significativement accrue par rapport à l'instillation sélective fictive (figure1C; adaptée d'Abdulnour et coll. 20146). En réponse aux dommages de poumon, les leucocytes circulantdiant dans le tissu enflammé. Dans ce modèle, les neutrophiles vasculaires subissent la migration trans-endothéliale dans l'interstitium de poumon blessé. Les neutrophiles interstitiels se sont accumulés dans le poumon gauche 24 h après l'instillation du HCl, contrairement au poumon droit où l'on observe peu de neutrophiles interstitiels (Figure 1D). Ces résultats indiquent que la méthode d'instillation intra-bronchique de mainstem gauche sélective a eu comme conséquence des dommages aigus de poumon murine qui ont été en grande partie localisés au poumon gauche et ont produit des changements pathologiques qui sont également vus avec l'ARDS humain, y compris l'augmentation la brèche de barrière alvéolaire-capillaire et l'infiltration de neutrophile.

Les lésions pulmonaires aigues unilatérales permettent d'enquêter sur les mécanismes de résolution

Pour étudier la phase de résolution des souris de lésions pulmonaires aigues induites par l'acide doivent être en mesure de survivre à l'insulte initiale. Distinct du HCl intratrachéal, l'instillation dans seulement la bronche gauche de mainstem mène à une blessure auto-limitée avec la survie uniforme dans les souris autrement saines. Les poumons peuvent être obtenus à partir de souris à des moments précoces ou postérieurs comme dans la figure 2A. L'histologie pulmonaire montre des dommages et une inflammation de tissu au niveau d'organe et de cellulaire avec l'inflammation exsudative 24 h après blessure caractérisée par l'odema alvéolaire marqué et l'infiltration de neutrophile dans le poumon gauche. Notez qu'il n'y a pas de blessure importante ou d'afflux de leucocytes dans le poumon droit témoin non blessé (figure 2A). 72 h après des dommages, l'odème et les infiltrations cellulaires sont sensiblement diminués, représentant une phase exsudative de résolution. Les neutrophiles alvéolaux peuvent être surveillés par cytométrie d'écoulement (CD45/CD68-/F4/80-/Ly6GetCD11b) obtenues par lavage pulmonaire entier. Les neutrophiles augmentent dans le poumon gauche 24 h après la blessure initiale et diminuent sensiblement à 48 et 72 h (figure 2B). Si des moments ultérieurs sont étudiés, les nombres de neutrophiles retourneront à la ligne de base et les mécanismes dans les phases ultérieures de catabasis, telles que les réponses fibroprolifées, peuvent être étudiés.

Figure 1 : L'instillation sélective du HCl intrabronchique produit des lésions pulmonaires unilatérales définies par la rupture de la barrière alvéolaire et l'infiltration de neutrophiles. (A) Représentation de la cannulation de la bronche gauche de mainstem de murine pour l'instillation sélective de HCl dans le poumon gauche. (B) Réséqué à droite (RL) et à gauche (LL) poumons exposés à l'instillation sélective de l'acide et perfused suivant le colorant bleu d'Evan intraveineux. (C) Quantification du colorant bleu interstitiel d'Evan à partir d'un poumon homogénéisé et perfusé 24 h après des blessures à l'acide ou un faux contrôle; figure adaptée d'Abdulnour et coll. 20146. Les valeurs représentent la moyenne de SEM, où n 5. -p lt; 0.05, Mann-Whitney U Test. (D) Cytométrie de flux représentatif de l'intravasculaire (I.V.; fluorophore 1) et interstitiel (I.S. ; fluorophore 2) neutrophiles comme pour cent du Total CD45- cellules dans les poumons traités 24 h après des dommages acides. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Les lésions pulmonaires graves unilatérales sont autorésolantes. (A) Histologie représentative de H et E (10x) des poumons gauches obtenus à partir de souris naïves (0 h) ou de souris 24, 48, 72 h après une blessure, ainsi que du poumon droit associé de la même souris (barre d'échelle de 250 m). (B) Cytométrie représentative du flux des neutrophiles alvéolaires (Ly6Get CD11b) obtenue à partir de l'ensemble du lavage pulmonaire en pourcentage du total CD45- cellules chez les souris ou souris naïfs (0 h) 24, 48 et 72 h après des lésions acides. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Les auteurs n'ont rien à révéler.