Perturbing Biomécanique endothéliale via Connexin 43 Structural Disruption

Résumé

Ici, nous présentons un protocole mécanique pour perturber la connexine de jonction d'écart 43 et mesurer l'impact ultérieur ceci a sur la biomécanique endothéliale par l'observation des tractions et des contraintes intercellulaires.

Résumé

Des cellules endothéliales ont été établies pour produire des contraintes et des tractions intercellulaires, mais les jonctions de fossé de rôle jouent dans le stress intercellulaire endothélial et la génération de traction sont actuellement inconnues. Par conséquent, nous présentons ici un protocole mécanique-basé pour sonder l'influence de connexin 43 de jonction d'écart (Cx43) a sur la biomécanique endothéliale en exposant des monocouches endotenoles à un inhibiteur connu de Cx43 2,5-dihydroxychalcone (chalcone) et mesure de l'impact de cet inhibiteur sur les tractions et les contraintes intercellulaires. Nous présentons des résultats représentatifs, qui montrent une diminution des tractions et des contraintes intercellulaires sous une dose élevée de chalcone (2 g/mL) par rapport au contrôle. Ce protocole peut être appliqué non seulement à Cx43, mais aussi à d'autres jonctions d'écart, en supposant que l'inhibiteur approprié est utilisé. Nous croyons que ce protocole sera utile dans les domaines de la recherche cardiovasculaire et mécanobiologie.

Introduction

Le champ qui se réfère à l'étude des effets des forces physiques et des propriétés mécaniques sur la physiologie et la pathologie cellulaires et tissulaires est connu sous le nom de mécanobiologie¹. Quelques techniques utiles qui ont été utilisées dans la mécanobiologie sont la microscopie de contrainte de monocouche et la microscopie de force de traction. La microscopie de force de traction permet le calcul des tractions générées à l'interface cellule-substrat, tandis que la microscopie de contrainte de monocouche permet le calcul des contraintes intercellulaires générées entre les cellules adjacentes dans une monocouche²

Protocole

1. Fabrication de gels polyacrylamide (PA)

1. Préparation du plat Petri
   1. Préparer la solution de silane de liaison en mélangeant 200 ml d'eau ultrapure avec de l'acide acétique de 80 l et 50 l de méthacrylate de 3-(trimethoxysilyl)propyl. Bind silane est une solution utilisée pour fonctionnaliser la surface du plat Petri à fond de verre pour l'attachement hydrogel.
   2. Remuer la solution de silane de liaison sur une plaque à remuer pendant au moins 1 h.
   3. Traiter le centre du plat Petri avec une solution de silane de liaison pendant 45 min.
   4. Retirer la solution de silane de liaison et rincer le plat Petri ave....

Résultats

Des images de contraste de phase du contrôle, 0,2 g/mL, et 2 monocouches traitées au chalcone de g/mL ont été prises 30 minutes avant le traitement à la chalcone (figure 1A-C) et 2 heures après le traitement à la chalcone (figure 1D-F). Des déplacements de perles induits par les cellules (m) ont été observés pour diminuer dans les conditions de chalcone à faible dose et de chalcone à forte dose

Discussion

Notre groupe, ainsi que d'autres, a été avec succès l'aide de TFM et MSM pour sonder l'influence des jonctions cellules-cellules dans divers processus cellulaires pathologiques et physiologiques in vitro^7,15,18,27 . Par exemple, Hardin et coll. ont présenté une étude très perspicace qui suggère que la transmission intercellulaire du stress guide la formation de lacunes paracellulaires dans les .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lamelle de recouvrement de 18 mm	ThermoFisher	18CIR-1	Indispensable pour aplatir les gels de polyacrylamide
2 % bis-acrylamide	BIO-RAD	1610143	Composant du gel de polyacrylamide
2&prime ;,5&prime ;-Dihydroxychalcone	SIGMA	IDF00046	Pour perturber la structure Cx43
Méthacrylate de 3-(Triméthoxysilyl)propyle	SIGMA	2530-85-0	Solution mère pour faire lier le mélange de silane avec de l’acide acétique et de l’eau ultra-pure
40 % Acrylamide	BIO-RAD	1610140	Composant du gel de polyacrylamide
Acide acétique	Fisher-Sceintific	64-19-7	Essentiel pour faire lier la solution saline
Alexa Fluro 488 chèvre anti-souris IgG ;		ThermoFisher Catalogue # A-11001	Anticorps secondaire
Persulfate d’ammonium	BIO-RAD	1610700	Agent polymérisant sur gel de polyacrylamide
Albumine sérique bovine (BSA)	SIGMA	9048-46-8	Pour faire une solution bloquante
bovin de type I, 3 mg/mL, 100 mL	Advance Biomatrix	5005-100ML	Utilisation comme matrice
extracellulaireCorning Cell Culture Phosphate Buffer Saline (1x)	Fisher-Sceintific	21040CV	Buffer Saline nécessaire pour la culture cellulaire
Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents	Fisher-Sceintific	67-68-5	Pour dissoudre le chalcone et faire une solution mère
Fluoromount-G avec DAPI	ThermoFisher	00-4959-52	Milieu de montage pour immunostaing utilisé pour la coloration pour DAPI
Microsphère fluroscente Perles modifiées aux carboxylates	ThermoFisher	F8812	0,5 micron billes modifiées aux carboxylates (rouge), 2 % de solides
Solution tampon HEPES 1 M	SIGMA	7365-45-9	Essential pour
LVES	ThermoFisher	A1460801	Essential HUEVC media 200 supplement
Medium 200	ThermoFisher	M200500	Essential media for HUVEC cell culture
Anticorps monoclonal Cx43 de souris (CX - 1B1)	ThermoFisher	Catalog #13-8300	Cx43
(35 mm de diamètre)	CellVis	D35-20-1.5H	Boîte de Pétri de 35 mm avec un puits central de 20 mm
Sulfo-SANPAH Réticulant 100 mg	Proteochem	102568-43-4	Indispensable pour fonctionnaliser la surface du gel de polyacrylamide
SYLGARD 184 Kit d’élastomère de silicone	DOW corning	2646340	Élastomère de silicium avec agent de durcissement pour la fabrication de PDMS
TEMED	BIO-RAD		Agent de polymérisation de gel de polyacrylamide
Triton-X 100	SIGMA	9002-93-1	Pour perméabiliser les cellules
Trypsine -EDTA	ThermoFisher	25300054	Utilisé pour détacher les cellules

Solution d’atélo-collagène Anticorps primaire pour boîte de Pétri 1610801