Les lymphocytes T T spécifiques à la cellule souche s'amedisent à supprimer la réplication du VHB chez les souris

Résumé

Présenté ici est un protocole pour la suppression efficace de la réplication du virus de l'hépatite B (HBV) chez les souris en utilisant le transfert de cellules adoptives (ACT) de cellules souches dérivées des lymphocytes T spécifiques à l'antigène viral (Ag). Cette procédure peut être adaptée pour l'immunothérapie act-basée potentielle de l'infection de HBV.

Résumé

L'infection par le virus de l'hépatite B (VHB) est un problème de santé mondial. Avec plus de 350 millions de personnes touchées dans le monde, l'infection par le VHB demeure la principale cause de cancer du foie. Il s'agit d'une préoccupation majeure, en particulier dans les pays en développement. L'échec du système immunitaire à monter une réponse efficace contre le VHB conduit à une infection chronique. Bien que le vaccin contre le VHB soit présent et que de nouveaux médicaments antiviraux soient créés, l'éradication des cellules de réservoir de virus demeure un sujet de santé majeur. Décrit ici est une méthode pour la génération de l'antigène viral (Ag) -spécifiques CD8^- lymphocytes T cytotoxiques (CTLs) dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) (c.-à-d., iPSC-CTLs), qui ont la capacité de supprimer la réplication du VHB. La réplication du VHB est efficacement induite chez la souris par injection hydrodynamique d'un plasmide d'expression HBV, pAAV/HBV1.2, dans le foie. Ensuite, hBV surface Ag-spécifique souris iPSC-CTLs sont transférés d'adoption, ce qui supprime considérablement la réplication du VHB dans le foie et le sang ainsi que empêche l'expression HBV surface Ag dans les hépatocytes. Cette méthode démontre la réplication du VHB chez les souris après injection hydrodynamique et que les CTL viraux dérivés de cellules souches peuvent supprimer la réplication du VHB. Ce protocole fournit une méthode utile pour l'immunothérapie de HBV.

Introduction

À la suite d'une infection aigue, le système immunitaire adaptatif (c.-à-d. l'immunité humoristique et cellulaire) contrôle la majeure partie de l'hépatite aigue liée au VHB. Pourtant, un certain nombre de personnes dans les régions où le VHB est endémique ne peuvent pas éliminer les virus et se convertir par la suite en tant qu'individus chroniques. Plus de 25 % des patients chroniques (250 millions de personnes dans le monde) développent une maladie hépatique progressive, entraînant une cirrhose du foie et/ou un carcinome hépatocellulaire (HCC)¹. En conséquence, l'éradication des cellules infectées avec insistance reste un problème de santé g....

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux sont approuvées par le Texas A -amp;M University Animal Care Committee (IACUC; #2018-0006) et sont menées conformément aux lignes directrices de l'Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care. Les souris sont utilisées pendant l'âge de 6 à 9 semaines.

1. Génération de cellules virales Spécifiques à l'Ag CD8^et T à partir d'iPSC (iPSC-CD8^et lymphocytes T)

1. Création des constructions rétrovirales
   REMARQUE : Les gènes TCR et MD sont liés à la séquence d'auto-cleaving 2A. Le vecteur rétroviral MSCV-IRES-DsRed (MiDR) est DsRed²³

Résultats

Comme indiqué ici, les cellules virales du VHB Ag-spécifiques iPSC-CD8^t sont générées par un système de culture in vitro. Après l'ACT de ces cellules virales Ag-spécifiques iPSC-CD8^- T supprimer considérablement la réplication du VHB dans un modèle de murine (Fichier supplémentaire 1). Souris iPSC sont transducés avec la construction rétrovirale MIDR codant un gène hybride homme-souris HBV TCR (HBs_183-191-spécifique, s183), puis les iPSC transducés par gène sont co-cultiv.......

Discussion

Ce protocole présente une méthode pour générer les iPSC-CTL virales spécifiques à ag pour une utilisation comme ACT pour supprimer la réplication du VHB dans un modèle de murine. Dans l'infection chronique de HBV, le génome viral forme un mini chromosome stable, l'ADN circulaire covalently fermé (cccDNA) qui peut persister tout au long de la durée de vie de l'hépatocyte. Cibler le dégagement du mini chromosome viral peut entraîner un traitement de l'infection chronique par le VHB. Le traitement antiviral actuel cible la .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Souris HHD	Institut Pasteur, Paris, France		H-2 classe I knockout, souris transgéniques HLA-A2.1 (HHD)
iPS-MEF-Ng-20D-17	de cellules RIKEN	APS0001
SNL76/7	ATCC	SCRC-1049
OP9	ATCC	CRL-2749
Plasmide pAAV/HBV1.2	Dr. Dr. Pei-Jer Chen (Hôpital universitaire national de Taïwan, Taïwan)		L’ADN du VHB construit
gènes TCR spécifiques de HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)	Dr Adam J Gehring (Institut de recherche de l’Hôpital général de Toronto, Toronto, Canada)		Gènes TCR hybrides humains-murins restreints à l’A2 spécifiques de FLLTRILTI (V&alpha ; 34 et V&beta ; 28)
OVA257&ndash ; Gènes TCR spécifiques à 264	Dr. Dario A. Vignali (Université de Pittsburgh, PA)		Gènes TCR restreints H-2Kb spécifiques à SIINFEKL Anticorps
anti-CD3 (17A2) Anticorps Biolegend		100236
Anti-CD44 (IM7) Anticorps	BD Pharmingen	103012
Anticorps anti-CD4 (GK1.5)	Biolegend	100408
Anticorps anti-CD8 (53-6.7)	Biolegend
Anti-IFN-&gamma ; (XMG1.2) anticorps	Biolegend	505810
Anticorps anti-TNF-a (MP6-XT22)	Biolegend	506306
&alpha ;-MEM	Invitrogen	A10490-01
Anticorps anti-HBs	Thermo Fisher	MA5-13059
ACK Tampon de lyse	Lonza	10-548E
Brefeldin A	Sigma	B7651
DMEM	Invitrogen	ABCD1234
FBS	Hyclone	SH3007.01
FACSAria Trieur de cellules Fusion	BD	656700
Gelatin	MilliporeSigma	G9391
GeneJammer	Agilent	204130
HLA-A201-HBs183-91-PE pentamer	Proimmune	F027-4A - 27
HRP Anti-souris Anticorps secondaire	Invitrogen	A27025
mFlt-3L	Peprotech	250-31L
mIL-7	Peprotech	217-17
Nucléase S7	Roche	10107921001
Paraformaldéhyde	MilliporeSigma	P6148-500G	Attention : Allergène, Carcénogène, Tampon
perméabilisation	Biolegend	421002
Polybrene	MilliporeSigma	107689
ProLong&trade ; Montage anti-effacement en or avec DAPI	Invitrogen	P36931
QIAamp MinElute Virus Spin Kit	Qiagen	57704

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