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Article de méthode

Plate-forme de transplantation de moelle osseuse pour étudier le rôle des cellules dendritiques dans la maladie de greffe-contre-hôte

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DOI :

10.3791/60083

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17 mars 2020

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1Cancer Division, Burnett School of Biomedical Sciences, University of Central Florida, 2Department of Biochemistry, Hanoi University of Pharmacy, 3Center for Cardiovascular Regeneration, Department of Cardiovascular Sciences, Houston Methodist Research Institute, 4Department of Epidemiology, University of Pittsburgh Graduate School of Public Health, 5Division of Cancer Control and Population Sciences, University of Pittsburgh Medical Center, Hillman Cancer Center

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

La maladie de greffe-contre-hôte est une complication principale après la transplantation allogeneic de moelle. Les cellules dendritiques jouent un rôle critique dans la pathogénie de la maladie de greffe-contre-hôte. L’article actuel décrit une nouvelle plate-forme de transplantation de moelle osseuse pour étudier le rôle des cellules dendritiques dans le développement de la maladie de greffe-contre-hôte et de l’effet de greffe-contre-leucémie.

Résumé

La transplantation allogeneic de moelle (BMT) est une thérapie efficace pour des malignités hématologiques due à l’effet de greffe-contre-leucémie (GVL) pour éradiquer des tumeurs. Cependant, son application est limitée par le développement de la maladie de greffe-contre-hôte (GVHD), une complication majeure de BMT. GVHD est évoqué quand les lymphocytes T dans les greffes de donneur reconnaissentalloantigen exprimées par les cellules de destinataire et montent des attaques immunologiques indésirables contre les tissus sains de destinataire. Ainsi, les thérapies traditionnelles sont conçues pour supprimer l’alloreactivité de T-cellule de donneur. Cependant, ces approches nuisent considérablement à l’effet GVL afin que la survie du receveur ne soit pas améliorée. Il est donc essentiel de comprendre les effets des approches thérapeutiques sur le BMT, le GVL et le GVHD. En raison des capacités de présentation et de sécrétion de cytokine de l’antigène pour stimuler les lymphocytes T donneurs, les cellules dendritiques du receveur jouent un rôle significatif dans l’induction de GVHD. Par conséquent, le ciblage des CD destinataire devient une approche potentielle pour contrôler GVHD. Ce travail fournit une description d’une nouvelle plate-forme BMT pour étudier comment les DCs hôtes régulent les réponses GVH et GVL après la transplantation. Un modèle BMT efficace pour étudier la biologie de la GVHD et du GVL après la transplantation est également présenté.

Introduction

La transplantation de cellules souches hématopoïétiques allogéniques (BMT) est une thérapie efficace pour traiter les malignités hématologiques1,2 par l’effet greffe-contre-leucémie (GVL)3. Cependant, les lymphocytes de donneur montent toujours des attaques immunologiques non désirées contre des tissus de destinataire, un processus appelé greffe-contre-hôte maladie (GVHD)4.

Les modèles murins de GVHD sont un outil efficace pour étudier la biologie de GVHD et la réponse GVL5. Les souris sont un modèle animal de recherche rentable. Ils sont petits et efficacement dosés avec des molécules et des produits biologiques aux premières phases du développement6. Les souris sont des animaux de recherche idéaux pour les études de manipulation génétique parce qu’ils sont génétiquement bien définis, ce qui est idéal pour étudier les voies biologiques et les mécanismes6. Plusieurs modèles de souris majeure histocompatibilité complexe (MHC) MHC-dépareillé modèles de GVHD ont été bien établis, tels que C57BL/6 (H2b) à BALB / c (H2d) et FVB (H2q) C57BL/6 (H2b)5,7. Ce sont des modèles particulièrement précieux pour déterminer le rôle des types de cellules, des gènes et des facteurs qui affectent la GVHD. La transplantation de C57/BL/6 (H2b) donneurs parentaux à des receveurs présentant des mutations dans le MHC I (B6.C-H2bm1) et/ou MHC II (B6.C-H2bm12) a révélé qu’un décalage dans la classe I et la classe II du MHC est une exigence importante pour le développement de GVHD aigus. Ceci suggère que les cellulesT de CD4et de CD8 sont exigées pour le développement de la maladie7,,8. GVHD est également impliqué dans une cascade inflammatoire connue sous le nom de «tempête de cytokine pro-inflammatoire»9. La méthode de conditionnement la plus courante dans les modèles murins est l’irradiation totale du corps (TBI) par rayon X ou 137Cs. Ceci mène à l’ablation de moelle d’os du destinataire, permettant ainsi l’engraftment de cellules souches de donneur et empêchant le rejet de la greffe. Ceci est fait en limitant la prolifération des lymphocytes T bénéficiaires en réponse aux cellules de donneur. En outre, les disparités génétiques jouent un rôle important dans l’induction de la maladie, qui dépend également de l’inadéquation mineure du MHC10. Par conséquent, la dose d’irradiation myéloablative varie selon différentes souches de souris (p. ex., BALB/c-C57BL/6).

L’activation des lymphocytes T donneurs par les cellules présentant des antigènes hôtes (APC) est essentielle pour le développement de la DGV. Parmi les APC, les cellules dendritiques (DCs) sont les plus puissantes. Ils sont héréditairement capables d’induire le GVHD en raison de leur absorption supérieure d’antigène, expression des molécules co-stimulatrices de lymphocytes T, et production de cytokines pro-inflammatoires qui polarisent les lymphocytes T en sous-ensembles pathogènes. Les CD bénéficiaires sont essentiels pour faciliter l’amorçage des lymphocytes T et l’induction de GVHD après la transplantation11,12. En conséquence, les CDC sont devenus des cibles intéressantes dans le traitement de GVHD12.

TBI est nécessaire pour améliorer l’engraftment cellulaire donneur. En raison de l’effet TBI, les CD destinataires sont activés et survivent pendant une courte période après la transplantation12. Malgré les progrès importants dans l’utilisation de la bioluminescence ou de la fluorescence, l’établissement d’un modèle efficace pour étudier le rôle des CD bénéficiaires dans le GVHD est toujours difficile.

Parce que les lymphocytes T donneurs sont la force motrice de l’activité GVL, les stratégies de traitement utilisant des médicaments immunosuppresseurs tels que les stéroïdes pour supprimer l’alloreactivité à cellule T causent souvent une rechute de tumeur ou une infection13. Par conséquent, le ciblage des CD destinataires peut fournir une approche alternative pour traiter le GVHD tout en préservant l’effet GVL et en évitant l’infection.

En bref, la présente étude fournit une plate-forme pour comprendre comment différents types de signalisation dans les CD destinataires régule le développement de GVHD et l’effet GVL après BMT.

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Protocole

Les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Floride centrale.

1. Induction GVHD

REMARQUE : La transplantation de cellules de moelle osseuse allogeneic (BM) (étape 1.2) est effectuée dans les 24 h après l’irradiation. Toutes les procédures décrites ci-dessous sont effectuées dans un environnement stérile. Effectuez la procédure dans un capot de culture tissulaire et utilisez des réactifs filtrés.

  1. Jour 0 : Préparer les souris receveures.
    1. Utilisez des souris femelles de type sauvage (WT) sur un fond BALB/c (CD45.2- H2kd '), 10-12 semaines en tant que receveurs.
    2. Ear-tag et peser les destinataires avant TBI. Ensuite, placez jusqu’à 11 souris dans la chambre d’irradiation et gardez-la dans l’irradiateur. Irradiate à une seule dose de 700 cGy pendant 10-15 min.
    3. Retournez les animaux irradiés dans les cages et logez-les dans des installations exemptes d’agents pathogènes avant la greffe.
      REMARQUE: Le poids corporel minimal des destinataires devrait être d’environ 20 g. Utilisez ce poids comme référence pour calculer la perte de poids du corps au cours de la période expérimentale.
  2. Jour 1 : Préparer la moelle osseuse appauvrie à cellule T (TCD-BM) des souris donneuses.
    1. Euthanasiez les souris CD45.1/Ly5.1 C57BL/6 par asphyxie de CO2 et attendez 2 à 3 min jusqu’à ce qu’elles soient inconscientes. Effectuer la dislocation cervicale comme euthanasie secondaire si nécessaire.
    2. Placez chaque souris sur un tableau de travail propre. Désinfecter la fourrure et la peau avec 70% d’isopropanol.
    3. Recueillir le tibia et le fémur des deux jambes à l’aide de forceps et de ciseaux. Mettez-les dans un RPMI glacé contenant 1% de FCS et 100 U/mL pénicilline/streptomycine et 2 mM L-glutamine (1% RPMI) dans des tubes coniques de 50 ml. Nettoyez le fémur et les os du tibia à fond en enlevant tous les tissus musculaires à l’aide de forceps et de ciseaux. Transférer le fémur et le tibia des tubes coniques de 50 ml à un plat Petri de 92 mm de diamètre contenant 1% de RPMI.
    4. À l’aide de ciseaux, couper les extrémités du fémur ou du tibia. Remplir un tube de 50 ml avec 25 ml de 1% RPMI 1640 moyen. Utilisez-le pour remplir une seringue de 3 ml attachée à une aiguille de 26 G avec 3 ml de RPMI de 1 %. Insérez cette seringue dans l’os et poussez le piston à rincer la moelle osseuse (BM) de la cavité dans le tube de collecte avec 1% de RPMI (3 ml/os).
    5. Répéter l’étape 1.2.4 pour tous les os restants de tibia et de fémur d’autres souris de donneur. Gardez tous les tubes de collecte sur la glace.
    6. Faire la suspension à cellule unique en rinçant les morceaux de moelle osseuse à travers une passoire à cellules en maille de 75 m. Recueillir la suspension à cellule unique dans un tube de 50 ml.
    7. Tubes de centrifugeuse à 800 x g pendant 5 min à 4 oC. Aspirer et jeter le supernatant. Réutilisez la granule dans le tampon PBS contenant 0,5% d’albumine de sérum bovin (BSA) à 20 x 106 cellules/mL. Enregistrer un aliquote de 2 x 106 cellules pour la coloration de pureté.
    8. Ajouter Thy 1 anticorps à 0,05 g/106 cellules14 et incuber pendant 30 min à 4 oC. Laver une fois avec 25 ml de PBS glacé. Résuspendez à 20 x 106/mL dans 0,5% BSA/10% jeune lapin complément/2% DNase (10.000 U/mL en sterile H2O). Incuber pendant 45 min à 37 oC et laver 2x comme avant.
      REMARQUE : Les lymphocytes T sont épuisés à l’aide d’un mAb spécifique pour Thy1, une protéine exprimée par toutes les lymphocytes T, mais pas d’autres leucocytes.
    9. Résuspendez les cellules dans 20 ml de tampon PBS contenant 0,5% BSA. Comptez les cellules de moelle osseuse dans 1% d’acide acétique à l’aide d’un hémocytomètre. Conserver un aliquote de 2 x 106 cellules pour un contrôle de pureté par cytométrie d’écoulement après la purification cellulaire.
      REMARQUE : Une souris de donneur génère normalement environ 25 x 106 TCD-BM.
    10. Utilisez la cytométrie d’écoulement pour confirmer un appauvrissement réussi de cellule T. Tache 1 x 106 cellules, conservées à partir des étapes 1.2.7 (avant l’épuisement des lymphocytes T) et 1.2.9 (TCD-BM après l’épuisement des lymphocytes T) avec les anticorps suivants : 'CD3 (17A2), 'CD4 (GK1.5), et '-CD8 ' (53-6.7).
  3. Jour 1 : Préparer les lymphocytes T des souris donneurs
    1. Utilisez des souris de+ type T (WT) de CD45.2 et H2kb' C57BL/6 comme donneurs de lymphocytes T.
    2. Euthanasier les souris C57BL/6 par le dioxyde de carbone (CO2) l’asphyxie telle que décrite dans 1.2.1.
    3. Nettoyer la fourrure et la peau de la souris à fond avec 70% d’éthanol. Accise les rates et les ganglions lymphatiques et les séparer en une seule suspension cellulaire de spénocytes à l’aide d’un piston de seringue et de passoires à mailles de 40 m. Laver la passoire et la seringue avec 1% de RPMI (1% FBS contenant des supports RPMI) pour collecter tous les ratenocytes.
    4. Centrifuge la suspension cellulaire à 800 x g pendant 5 min à 4 oC. Ajouter 5 mL de tampon de lysing ACK (1 mM Na2EDTA, 10 mM KHCO3, 144 mM NH4Cl, pH 7.2) après avoir jeté le supernatant. Incuber la suspension cellulaire pendant 5 minutes à température ambiante.
      REMARQUE : Le tampon de lyse ACK est utilisé pour lysing globules rouges.
    5. Ajouter 5 ml de RPMI à 1 % pour arrêter la lyse. Centrifugeuse à 800 x g pour 5 min à 4 oC. Jetez le supernatant.
    6. Préparer le tampon de tri magnétique à froid glacé (MACS) tampon (0,5 % BSA, 2 mM EDTA dans PBS, pH 7.2). Dégazer le tampon avant l’utilisation. Réutilisez les granulés de cellules dans 5 ml de tampon MACS.
    7. Comptez les plénocytes et vérifiez les cellules vivantes et mortes à l’aide d’un hémocytomètre et de 1% de bleu trypan. Enregistrer un aliquote de 2 x 106 cellules pour évaluer le rendement de purification avec l’analyse de cytométrie de débit.
    8. Resuspendez les plénètes à la concentration de 200 x 106/mLdans le tampon MACS. Ajoutez 0,03 L de biotine anti-souris-Ter-119, 0,03 L de biotine anti-souris-CD11b, 0,03 L d’anti-souris-CD45R de biotine et 0,03 L d’anti-souris-DX5 biotin pour 106 cellules. Incuber pendant 15 min à 4 oC.
      REMARQUE : Biotin anti-mouse-Ter-119, biotin anti-mouse-CD11b, biotin anti-mouse-CD45R, et biotin anti-mouse-DX5 ont été employés pour réagir avec des cellules érythroides, granulocytes, B-cells, et NK respectivement. Par conséquent, ces sous-ensembles cellulaires sont épuisés dans la foulée de l’étape15.
    9. Ajouter 10 ml de tampon MACS glacé à la suspension cellulaire. Centrifugeuse à 800 x g pour 5 min à 4 oC. Jetez le supernatant.
    10. Réutilisez les granulés cellulaires dans le tampon MACS à une concentration de 100 x 106/mL. Ajouter les microbilles antibiotines (0,22 l/106 cellules) à la suspension de la rate. Bien mélanger et incuber pendant 15 minutes supplémentaires à 4 oC. Laver la suspension cellulaire une fois avec 10 ml de tampon MACS glacé. Centrifugeuse à 800 x g pendant 5 min à 4 oC et jeter le supernatant.
    11. Placez une colonne de séparation magnétique dans le champ magnétique. Rincer la colonne avec 3 ml de tampon MACS. Déposez la suspension de la cellule sur la colonne. Recueillir le flux-through composé de non liés, enrichis lymphocytes T, dans un nouveau tube conique de 15 mL. Laver la colonne MS avec 3 ml de tampon MACS glacé.
      REMARQUE : Assurez-vous que la colonne est vide avant d’effectuer les étapes de lavage.
    12. Centrifuge la suspension cellulaire à 800 x g pendant 5 min à 4 oC. Réutilisez la pastille cellulaire dans 5 ml de tampon MACS.
    13. Comptez les cellules en bleu trypan de 1 % à l’aide d’un hémocytomètre. Enregistrer un aliquote de 2 x 106 cellules pour un contrôle de pureté par cytométrie d’écoulement.
      REMARQUE : Le rendement moyen des lymphocytes T spléniques isolés par cette méthode est de 20 à 25 x 106 cellules par souris.
    14. Confirmer le rendement de l’enrichissement des lymphocytes T par cytométrie d’écoulement. Tache 1 x 106 cellules, conservées à partir des étapes 1.3.7 (avant l’épuisement des lymphocytes T) et 1.3.13 (TCD-BM après l’épuisement des lymphocytes T), avec les anticorps suivants: 'CD3 (17A2), 'CD4 (GK1.5), et '-CD8 ' (53-6.7).
  4. Jour 1 : Injectez des souris irradiées avec des lymphocytes T donneurs et TCD-BM.
    1. Laver le TCD-BM et les lymphocytes T 2x avec PBS (800 x g pendant 5 min à 4 oC). Réutilisez les cellules dans PBS glacé pour l’injection. Ajuster la concentration cellulaire à 20 x 106/mL pour TCD BM et 4 x 106/mL pour les lymphocytes T.
    2. Chauffer l’animal à l’aide d’une lampe chauffante pour augmenter la visibilité des veines de queue bilatérales. Si nécessaire, placez la souris dans une retenue.
    3. Nettoyez la surface de la queue à l’aide de 70% d’isopropanol. Injecter TCD-BM (5 x 106 cellules/souris) avec ou sans lymphocytes T (0,75 x 106 cellules/souris). Veillez à ne pas introduire d’air dans la seringue.
    4. Retirez l’aiguille et appliquez un écouvillon antiseptique directement au site d’injection 5 à 10 s pour arrêter tout saignement.
  5. Évaluer le GVHD les jours 2-80.
    1. Gardez une trace de la survie de l’animal. Surveillez les signes cliniques de GVHD adaptés du système de notation établi précédemment par Cook et al.16 et le poids corporel des souris receveures 2x par semaine. Utilisez le poids corporel déterminé avant l’ITT pour calculer la perte de poids corporelle.
    2. Peser chaque souris individuellement. Marquez la perte de poids comme suit : grade 0 - moins de 10%; grade 1 - 10%-20%; grade 2 - plus de 20%.
    3. Marquez le signe de posture des receveurs : grade 0 , pas d’intuition; grade 0.5 - légère intuition, mais se redresse lors de la marche; grade 1 - l’animal reste voûté lors de la marche; grade 1.5 - l’animal ne se redresse pas; grade 2.0 - stand animal sur les pattes arrière.
    4. Marquez le signe de mobilité des bénéficiaires : 0e année et très actif; grade 0.5 - plus lent que les souris naïves; grade 1.0 - se déplace seulement lorsqu’il est piqué; grade 1.5 - se déplace légèrement lorsqu’il est piqué; grade 2.0 - ne bouge pas lorsqu’il est piqué.
    5. Score de la peau des receveurs: grade 0 - pas d’abrasions, lésions ou mise à l’échelle; grade 0.5 - rougeur dans un domaine spécifique; grade 1 - abrasion dans une zone ou abrasion douce dans deux secteurs ; grade 1.5 - abrasions graves dans deux zones ou plus; grade 2.0 - abrasions sévères, peau craquante, sang séché.
    6. Notons la fourrure des receveurs : grade 0, aucun signe anormal; grade 0.5 - débarrassant sur le côté du ventre ou de la nuque, grade 1.0 - se débarrassant à travers ou sur le côté du ventre et du cou; grade 1.5 - fourrure emmêlée et ébouriffée; grade 2.0 - fourrure mal emmêlée sur le ventre et le dos.
    7. Notons la diarrhée des receveurs : grade 0, pas de diarrhée; grade 0.5 - selles légères et molles; grade 1.0 - doux (selles jaunes); grade 1.5 - modéré (selles jaunes avec un peu de sang); grade 2 - sévère (jaune clair et selles sanglantes, « tabourets à gâteau séchés » apparaissent à la zone anale).

2. Modèle de cotransplantation

  1. Générer des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse (BM-DCs).
    1. Isoler la moelle osseuse des fémurs et des tibias de WT ou du facteur B (fB)-/- souris sur le fond B6 comme décrit dans les étapes 1.2.3-1.2.4. Tourner les cellules à 800 x g pendant 5 min.
    2. Résuspendez la pastille dans 5 ml de tampon de lysage ACK pour la lyse des globules rouges. Incuber la suspension cellulaire pendant 5 min sur la glace. Ajouter 10 ml de RPMI à la suspension cellulaire pour arrêter la lyse et la centrifugeuse à 800 x g pendant 5 min à 4 oC. Jetez le supernatant.
    3. Ressuspendez les granulés de cellules dans 10 ml de supports culturels (RPMI 1460 contenant 10% FBS, 100 U/mL de pénicilline/streptomycine, 2 mM l-glutamine, et 50 mM -mercaptoethanol) et ajuster le volume pour répondre à la concentration finale de 2 x 106/mL cellules.
    4. Ajoutez 20 ng/mL granulocyte-macrophage facteur de stimulation de la colonie (GM-CSF) à la suspension cellulaire. Culture les cellules de moelle osseuse dans des plats Petri de 100 x 15 mm à 37 oC en 5 % de CO2 pendant 6 jours.
    5. Remplacez la moitié des supports culturels en cours (environ 5 ml) par des supports frais contenant 40 ng/mL GM-CSF le jour 3.
    6. Avant la guerre, les médias culturels dans un bain d’eau à 37 oC. Recueillir environ 5 ml de médias à partir des plats de culture de la moelle osseuse. Centrifugeuse à 800 x g pour 5 min à 4 oC. Jetez le supernatant. Réutilisez la pastille cellulaire dans un support culturel de 5 ml contenant 40 ng/mL GM-CSF.
    7. Ajouter 25 g/mL lipopolysaccharide (LPS) aux médias le jour 6 de la culture pour mûrir les BM-DCs. Enregistrer un aliquot de 2 x 106 cellules pour déterminer l’efficacité de différenciation DC par cytométrie d’écoulement.
    8. Recueillir des BM-DCs matures : Utilisez des élévateurs cellulaires pour gratter doucement les DC des plats Petri. Recueillir toutes les suspensions cellulaires dans des tubes coniques de 50 ml. Centrifugeuse à 800 x g,pour 5 min à 4 oC. Jetez le supernatant. Laver les granulés de cellules 3x avec 50 ml de PBS glacé. Économisez environ 2 x 106 BM-DCs pour l’analyse immunologique du phénotype par cytométrie d’écoulement.
  2. Effectuez la co-transplantation de cellules dendritiques de BMT (DC-cotransplanting BMT).
    REMARQUE : Utilisez des souris FVB (H2kq)comme donneurs pour les lymphocytes T et les cellules BM. Irradiate B6 Ly5.1 souris receveures à une dose de 1 100 cGy (2 doses, 3 h d’intervalle). Voir les détails à l’étape 1.1.
    1. Isoler BM des fémurs et des tibias des souris donneuses de FVB. Voir les détails dans les étapes 1.2.3-1.2.10.
      REMARQUE : Utilisez la moelle osseuse isolée totale au lieu de TCD-BM dans ce modèle.
    2. Purifier les lymphocytes T des rates et des ganglions lymphatiques des souris donneurs de FVB. Voir les détails dans les étapes 1.3.1-1.3.13.
    3. Injecter BM (5 x 106/souris), T-cells (0.5 x 106/mouse) avec BM-DCs (2 x 106/mouse) le jour 0 du cours expérimental.
    4. Le jour 3 après la transplantation, examinez la reconstitution de DC de donneur par cytométrie d’écoulement.
      1. Recueillir le sang des yeux des receveurs.
      2. Anesthésiez les souris CD45.1/Ly5.1 B6 par 3% d’inhalation d’isoflurane. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réponse à un pincement d’un toe.
      3. Placez un tube de pipette en verre stérile dans le canthus médial de l’œil dirigé caudally à un angle de 30 à 45 degrés du plan du nez. Appliquer une pression tout en faisant pivoter doucement le tube.
      4. Déposer le sang dans un tube stérile de microcentrifuge stérile de 1,5 mL contenant de l’héparine. Transférer 50 L de sang dans des tubes de flux de verre de 5 ml.
      5. Ajouter 2 ml de tampon de lysage ACK. Incuber à 37 oC dans un bain d’eau pendant 45 min. Ajouter 2 ml de tampon de colorant FACS. Centrifugeuse à 800 x g pour 5 min à 4 oC. Jetez le supernatant.
      6. Resuspendez les granulés de cellules avec 200 l de tampon FACS contenant des anticorps appropriés de coloration de débit (jaune vivant/mort, '-H-2Kb, '-CD45.1, '-CD45.2, 'CD11c, et '-MHCII). Incuber pendant 15 min à 4 oC dans l’obscurité. Laver 2x avec 1 mL tampon FACS. Réutilisez les granulés de cellules dans 200 L de tampon FACS et effectuez l’analyse par cytométrie d’écoulement.

3. Modèles GVHD/GVL de BMT

  1. Effectuez l’induction GVHD/GVL.
    1. Culture la luciferase transduite au lymphome de cellules A20 B dans les médias de culture RPMI.
    2. Irradiate BALB/c fond WT ou Ly5.1 receveur à 700 cGy (dose unique). Voir les détails à l’étape 1.1.
    3. Isoler TCD-BM des fémurs et des tibias de B6. Ly5.1 souris donneuses. Voir les détails dans les étapes 1.2.1-1.2.10.
    4. Purifier les lymphocytes T des rates et des ganglions lymphatiques des souris donneurs C57BL/6. Voir les détails dans les étapes 1.3.1-1.3.15.
    5. Laver le lymphome A20 2x avec 25 ml de PBS. Réutilisez les granulés de cellules dans 10 ml de PBS glacé. Prenez un aliquot de suspension cellulaire (10 l) et comptez les cellules à l’aide de 1% de bleu trypan et d’un hémocytomètre. Ajuster la concentration cellulaire à 20 000 cellules/mL.
    6. Injecter TCD-BM (5 x 106/souris)avec ou sans lymphocytes T (0,75 x 106/souris)et lymphome A20 (5 000 cellules/souris).
    7. Suivi de la survie du destinataire, des signes cliniques GVHD, et de la perte de poids corporelle pendant le cours expérimental. Voir les détails à l’étape 1.5.
  2. Effectuez l’imagerie bioluminescente.
    1. Surveiller la croissance tumorale dans le receveur transplanté en injectant aux souris receveures 4 mg de D-luciferine. Incuber pendant 5 min pour s’assurer que la luciferine réagit avec la luciferase.
    2. Anesthésiez la souris à l’aide de 3% d’isoflurane dans la chambre d’un imageur de bioluminescence et imagez les destinataires pendant 5 min dans le champ D et le temps d’exposition de 1 min.
    3. Analyser les données à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Modifier l’échelle des images pseudo couleur pour de meilleurs résultats.
      REMARQUE: Toutes les images doivent être à la même échelle à travers les expériences.
    4. Utilisez le logiciel d’analyse d’images pour déterminer les régions d’intérêt et quantifier la densité du signal en calculant le flux (photons/s) émis par chaque région d’intérêt.

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Résultats

Le modèle B6 majeur dépareillé MHC (H2kb)-BALB/C (H2kd)correspondait étroitement au développement du GVHD après la transplantation(figure 2). Les six signes cliniques de GVHD établis précédemment par Cooke et coll.16 se sont produits dans les destinataires transplantés avec des lymphocytes T WT-B6 mais pas dans les destinataires transplantés avec BM seul (étape 1.5), qui représentaient le groupe GVHD-négatif. Il y...

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Discussion

L’utilisation de cellules souches pour convenir à une personne particulière est une approche efficace pour traiter les cancers avancés et résistants18. Les produits pharmaceutiques à petites molécules, cependant, sont longtemps restés un foyer principal de la thérapie personnalisée de cancer. D’autre part, dans la thérapie cellulaire une multitude d’interactions entre le donneur et l’hôte peut influencer de façon décisive les résultats du traitement, tels que le développement de GVHD après BMT

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont pas de conflits d’intérêts.

Remerciements

Cette étude est soutenue par l’Université de Central Florida College of Medicine subvention de démarrage (à HN), l’Université de Pittsburgh Medical Center Hillman Cancer Center start-up subvention (à HL), les États-Unis NIH Grant #1P20CA210300-01 et le ministère vietnamien de la Santé Grant #4694/QD-BYT (à PTH). Nous remercions le Dr Xue-zhong Yu de l’Université médicale de Caroline du Sud d’avoir fourni du matériel pour l’étude.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,5 M EDTA pH 8,0 100MLFisher ScientificBP2482100Tampon MACS
10X PBSFisher ScientificBP3994Tampon MACS
A20 Lymphome à cellules BUniversité de Floride centrale ExpérienceinterneGVL
ACC1 fl/flJackson Lab30954Expérience GVL
ACC1 fl/fl CD4creUniversité de Floride centraleExpérience GVL
Microbilles anti-biotineMiltenyi Biotec130-090-485Enrichissement par lymphocytes T
Anti-Homme/Souris CD45R (B220)Thermo Fisher Scientific13-0452-85Enrichissement par lymphocytes T
Anti-souris B220 FITCThermo Fisher Scientific10452-85Analyse par cytométrie en flux
Anti-souris CD11c- AF700Thermo Fisher Scientific117319Analyse par cytométrie en flux
Anti-souris CD25 PEThermo Fisher Scientific12-0251-82Coloration en flux
Anti-souris CD4 BiotineThermo Fisher Scientific13-0041-86Enrichissement en lymphocytes T
Anti-souris CD4 eFluor® ; 450 (Pacific Blue® ; remplacement)Thermo Fisher Scientific48-0042-82Coloration en flux
Anti-souris CD45.1 PEThermo Fisher Scientific12-0900-83Analyse par cytométrie en flux
Anti-souris CD8a APCThermo Fisher Scientific17-0081-83Analyse par cytométrie en flux
Anti-souris H-2Kb PerCP-Fluor 710Thermo Fisher Scientific46-5958-82Analyse par cytométrie en flux
Anticorps anti-CMH de souris Classe II APCThermo Fisher Scientific17-5320-82Analyse par cytométrie en flux
Anti-souris TER-119Biotine Thermo Fisher Scientific13-5921-85Enrichissement des lymphocytes T
Anti-Thy1.2Bio ExcelBE0066BM génération
B6 fB-/- sourisUniversité de Floride centraleReceveursinternes
B6. Ly5.1 (CD45.1+) sourisCharles River564Donneurs
Souris BALB/c CharlesRiver028Receveurs de greffe
C57BL/6 sourisCharles River027Donneurs/Receveurs
CD11bThermo Fisher Scientific13-0112-85Enrichissement en lymphocytes T
CD25-biotineThermo Fisher Scientific13-0251-82Enrichissement des lymphocytes T
CD45RThermo Fisher Scientific13-0452-82Enrichissement des lymphocytes T
CD49b Anticorps monoclonal (DX5)-biotineThermo Fisher Scientific13-5971-82Enrichissement des lymphocytes T
Filtre de cellules 40 uMThermo Fisher Scientific22363547Préparation de cellules
Passoire de cellules 70 uMThermo Fisher Scientific22363548Préparation
de cellulesD-LuciferinGoldbioLUCK-1GImagerie animale vivante
Sérum fœtal bovin (FBS)Atlanta Bilogicals R& D systemD17051Culture cellulaire
Tubes de cytométrie en fluxFisher Scientific352008Analyse par cytométrie en flux
FVB/NCrlCharles River207Donneurs
Lipopolysacharide (LPS)Millipore SigmaL4391-1MGDC
Colonne LSMitenyi Biotec130-042-401Préparation
cellulaire MidiMACSMiltenyi Biotec130-042-302Enrichissement des lymphocytes T Nouveau-Brunswick
Incubateur Galaxy 170REppendorfGalaxy 170 RCulture cellulaire
Pénicilline+streptomycinePénicilline/Streptomycine (10 000 unités de pénicilline / 10 000 mg/ml de streptocoque)GIBCO15140Média
RPMI 1640Thermo Fisher Scienctific11875-093Média
TER119Thermo Fisher Scientifique13-5921-82Enrichissement des lymphocytes T
Xenogen IVIS-200Perkin ElmerXenogen IVIS-200Imagerie des animaux vivants
X-RAD 320 Irradiateur biologiqueRadiographie de précision X-RAD320Irradiation corporelle totale
mature

Références

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