Indicateurs synapses uniques de la libération et de l’absorption des glutamates dans les tranches cérébrales aigues des souris normales et huntingtones

L’impact relatif de chaque terminal synaptique appartenant à une « connexion unitaire » (c.-à-d. la connexion entre 2 cellules nerveuses) est généralement évalué par son influence sur le segment initial du neurone postynaptique^1,2. Les enregistrements somatiques et/ou dendritiques des neurones postsynaptiques représentent les moyens les plus courants et, jusqu’à présent, aussi les moyens les plus productifs de clarifier le traitement de l’information sous une perspective descendante ou verticale^3,4,5. Cependant, la présence d’astrocytes avec leurs territoires discrets et (chez les rongeurs) non-overlapping peut contribuer à une perspective horizontale qui est basée sur les mécanismes locaux d’échange de signaux, d’intégration et de synchronisation aux sites synaptiques^6,7,8,9,10.

Parce qu’on sait que les astroglias jouent, en général, un rôle majeur dans la pathogénie de la maladie neurodégénérative^11,12 et, en particulier, un rôle dans l’entretien et la plasticité des synapses glutamatergiques^13,14,15,16, il est concevable que les modifications de la performance synaptique évoluent en fonction de l’état des astrocytes dans la zone cible partagée des fibres afferentes avec diverses origines. Pour explorer davantage les mécanismes de réglementation locaux dérivés de la cible/astroglia dans la santé et la maladie, il est nécessaire d’évaluer les synapses individuelles. La présente approche a été élaborée pour estimer la gamme d’indicateurs fonctionnels de rejet et de dégagement du glutamate et pour définir des critères qui peuvent être utilisés pour identifier les synapses dysfonctionnelles (ou récupérées) dans les zones du cerveau les plus étroitement liées à l’initiation des mouvements (c.-à-d. tout d’abord dans le cortex moteur et le striatum dorsale).

Le striatum manque de neurones glutamatergiques intrinsèques. Par conséquent, il est relativement facile d’identifier les afferents glutamatergiques d’origine extrastriatale. Ce dernier provient principalement du thalamus médial et du cortex cérébral (voir^17,18,19,,20 pour plus). Les synapses corticostriatales sont formées par les axones des neurones pyramidaux localisés dans les couches corticales 2/3 et 5. Les axones respectifs forment des connexions bilatérales intra-télencéphaliques (IT) ou des connexions ipsilateral via un système de fibres qui constitue plus caudally le tractus pyramidal (PT). Il a également été suggéré que les terminaux de type IT et PT diffèrent dans leurs caractéristiques de libération et la taille^21,22. Compte tenu de ces données, on pourrait également s’attendre à des différences dans le traitement du glutamate.

Le striatum est la zone du cerveau la plus touchée dans la maladie de Huntington (HD)⁵. La MH humaine est un trouble neurodégénératif génétiquement héréditaire grave. Le modèle de souris Q175 offre l’occasion d’étudier la base cellulaire de la forme hypokinétique-rigide de la MH, un état qui a beaucoup en commun avec le parkinsonisme. À partir d’un âge d’environ 1 an, les souris homozygote Q175 (HOM) présentent des signes d’hypokinésie, comme révélé en mesurant le temps passé sans mouvement dans un champ ouvert²³. Les expériences actuelles avec des souris hétérozygote Q175 (HET) ont confirmé les déficits moteurs précédents observés dans LE CDM et, en outre, ont montré que les déficits moteurs observés étaient accompagnés d’un niveau réduit du transporteur d’acide aminé excitatoire astrocytique 2 protéine (EAAT2) dans le voisinage immédiat des terminaux synaptiques corticostriatal²⁴. Il a donc été supposé qu’un déficit dans l’absorption astrocytique de glutamate pourrait conduire à un dysfonctionnement ou même à la perte de synapses respectives^25,26.

Ici, nous décrivons une nouvelle approche qui permet d’évaluer le dégagement unique de glutamate de synapse par rapport à la quantité du neurotransmetteur libéré. Le nouveau capteur de glutamate iGlu_u a été exprimé dans les neurones pyramidaux corticostriatal. Il a été développé par Katalin Târôk²⁷ et représente une modification du capteur de glutamate de haute affinité précédemment introduit mais lent iGluSnFR²⁸. Les deux capteurs sont des dérivés de la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP). Pour les caractéristiques spectrales et cinétiques, voir Helassa et al.²⁷. En bref, iGlu_u est un capteur de faible affinité avec une cinétique rapide de désactivation et donc particulièrement bien adapté pour étudier le dégagement de glutamate aux terminaux synaptiques de glutamate-libération. La constante de temps de dissociation d’iGlu_u a été déterminée dans un dispositif d’arrêt-flux, qui a rendu un Tau_hors valeur de 2,1 ms à 20 oC, mais 0,68 ms lorsqu’il est extrapolé à une température de 34 oC²⁷. Les terminaux collatéraux Schaffer simples sondés à 34 oC avec balayage de laser en spirale dans la région de CA1 des cultures hippocampales organotypiques sous un microscope de 2-photon ont montré une constante moyenne de temps de décomposition de 2,7 ms.

Tous les travaux ont été effectués conformément à la directive de l’UE 2010/63/UE pour les expériences animales et ont été enregistrés au Bureau de la protection de la santé et de la sécurité technique de Berlin (G0233/14 et G0218/17).

REMARQUE : Les enregistrements de type sauvage Q175 (WT) et hétérozygotes (HET) peuvent être effectués à tout âge et sexe. Ici, nous avons étudié les hommes et les femmes à un âge de 51 à 76 semaines.

1. Injection du capteur glutamate iGlu_u pour l’expression dans les axons corticostriatal

1. Utilisez le puller pipette (mode étape) pour préparer des pipettes en verre borosilicate pour l’injection du virus. Après avoir tiré, casser manuellement la pipette pour obtenir un diamètre de pointe de 30 à 50 m. Autoclave la pipette et les instruments chirurgicaux, y compris la perceuse pour ouvrir le crâne.
2. Stocker le virus AAV9-CaMKIIa.iGlu_u. WPRE-hGH (7,5 x 10¹³gc/mL) à -80 oC en aliquots de 10 L. Si des injections sont effectuées peu de temps après la production du virus (dans les 6 mois), conserver à 5 oC. Avant la chirurgie, sortez la fiole et maintenez-la à température ambiante.
3. Remplissez la pipette en verre et retirez les bulles.
4. Anesthésiez l’animal avec une injection intraperitonéale d’une solution contenant 87,5 mg/kg de kétamine et 12,5 mg/kg de xylazine. Injectez sous-cutanée 0,25 % de bupivacain (8 mg/kg) pour soulager davantage la douleur. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en surveillant le tonus musculaire et en observant l’absence de réflexes induits par la douleur.
5. Raser la peau sur la tête et la stériliser avec 70% d’alcool. Ajuster la souris dans le cadre stéréotaxique.
6. Utilisez un scalpel pour enlever la peau et une perceuse à grande vitesse (38 000 tr/min) pour faire un trou de 1,2 mm dans l’os au-dessus du cortex moteur.
7. Monter la seringue avec la pipette d’injection attachée dans le support d’un manipulateur de précision. Insérez la pipette orientée verticalement dans le cortex à 4 sites différents. Les coordonnées d’injection sont, en ce qui concerne le bregma (en mm): antérieur 1,5, latéral 1,56, 1,8, 2,04, 2,28. La profondeur par rapport au dura mater est (en mm): 1.5-1.7.
8. À l’aide du système d’injection, injectez 0,3 l par site de la solution virale non diluée avec une vitesse de 0,05 l/min. Après chaque injection, laisser la pipette en place pendant 1 min avant de la retirer lentement (1 mm/min).
9. Terminer en fermant la plaie chirurgicale avec une suture en nylon.
10. Laisser la souris de 0,5 à 1 h sur un coussin chauffant dans une cage propre avant de la retourner dans sa cage d’origine.
11. Maintenir la souris sur un cycle de 12 h jour-nuit pendant 6 à 8 semaines avant la préparation des tranches cérébrales aigues.
    REMARQUE : Pour éviter les réactions immunitaires entraînant des dommages cellulaires et une perte de synapse, l’injection de plusieurs constructions virales doit être effectuée simultanément ou dans les 2 à 3 heures suivant l’injection primaire. Les coordonnées de l’injection_{d’iGlu u} ont été sélectionnées selon l’atlas du cerveau Paxinos et Franklin^29. Ils correspondent au cortex moteur M1. L’immunostaining des cerveaux injectés a visualisé de nombreux axones mais surtout bien isolés et varicosities d’axone dans le striatum ipsi-et contralateral et dans les cortices contralatéraux M1 et S1.

2. Recherche de terminaux glutamatergiques exprimant le capteur glutamate iGlu_u

1. Mode d’étalonnage
   1. Préparez la caméra sCMOS et le logiciel de contrôle de la caméra avec les paramètres suivants. Sur la page Readout set Pixel readout rate: 560 MHz (- lecture la plus rapide), Sensibilité/Gamme dynamique: bit, Spurious Noise Filter: Yes, Overlap Readout: Yes. Sur la page Binning/ROI, sélectionnez Plein écran.
   2. Préparer une glissière en verre contenant une goutte de 5 mg/mL Lucifer Jaune (LY) sous un glissement de couvercle.
   3. Placez la diapositive LY sous un objectif 63x, ouvrez l’obturateur laser et effectuez une acquisition en série en utilisant les réglages suivants : Pixel Binning: 1x1, mode Déclencheur: Interne, Temps d’exposition: Minimal (à déterminer).
   4. Ajuster la puissance laser pour produire une tache de fluorescence de 4 m de diamètre (l’image ne doit pas contenir de pixels saturés).
   5. Pour effectuer un étalonnage du système de positionnement laser, sélectionnez les paramètres suivants dans le logiciel de positionnement laser : diamètre de la taille d’un spot: 10, vitesse de balayage: 43.200 kHz. Cliquez sur le bouton d’acquisition d’images Démarrer sur le panneau droit. Set Runs: 0, Run delay: 0, et sélectionnez l’option Run at TTL sur la page Séquence. Cliquez sur le bouton Calibrate sur la page Calibration et étalonnez le logiciel de commande laser selon les instructions affichées dans le coin supérieur gauche de l’écran d’acquisition.
   6. Si la configuration utilise un logiciel indépendant pour le contrôle de la caméra et du laser, acquérez des captures d’écran de la fenêtre d’acquisition de la caméra et envoyez-la au logiciel de commande laser pour un re-calcul des coordonnées XY. Si le logiciel est installé sur différents ordinateurs, puis utilisez un saisisseur vidéo pour importer l’image dans le logiciel de contrôle laser. Le logiciel de commande laser aura besoin de l’information sur les facteurs de mise à l’échelle XY et les compensations. À cette fin, déterminez les coordonnées des coins supérieurs gauche, en bas et en bas-gauche de l’image dans la fenêtre d’acquisition du programme de commande laser. Calculez les facteurs d’échelle en fonction des équations suivantes : facteur X (X en bas à droite et X en bas à gauche)/2048, décalage X X en bas à gauche, facteur Y (en haut à gauche , Y en bas à gauche)/2048, Y offset - Y en bas à gauche.
   7. À la fin de la procédure d’étalonnage, créez une région d’intérêt rectangulaire (ROI) de 267x460 pixels, déplacez-la au centre de l’écran et cliquez sur le bouton Séquence Démarrer.
   8. Retour aux paramètres suivants du logiciel de contrôle de la caméra : Binning: 2x2, Mode Déclencheur: Exposition externe, Temps d’exposition: Minimal (à déterminer).
2. Mode de correction de l’autofluorescence
   REMARQUE: Le niveau de repos de [Glu] dans l’environnement des terminaux synaptiques actifs est généralement inférieur à 100 nM^{14,30,31,32,33,34}. En conséquence, tout capteur de glutamate, en particulier un capteur de faible affinité comme iGlu_u sera plutôt faible en l’absence de libération de glutamate synaptique. Néanmoins, une certaine fluorescence iGlu_u peut même être détectée au repos, mais doit être distinguée de l’autofluorescence tissulaire. L’éclairage de 473 nm suscite à la fois iGlu_u fluorescence et autofluorescence(figure 1A-C). Ce dernier occupe un large éventail de longueurs d’onde, tandis que la fluorescence iGlu_u est limitée à 480-580 nm (avec un maximum à 510 nm). La correction de l’autofluorescence est basée sur l’acquisition de deux images avec différents filtres à passage élevé.
   1. Préparer les tranches de cerveau à l’avance comme décrit ailleurs³⁵. Gardez les tranches de son prêtes.
   2. Transférer les tranches dans la chambre d’enregistrement, les submerger en crérebrospinalfluide artificiel oxygéné (ACSF) contenant 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,25 m NaH₂PO₄, 25 mM NaHCO₃, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl2 , 10 m de glucose (pH 7, 3 303 mOsm/L), complété par 0,5 mM de pyruvate de sodium, 2,8 mM d’ascorbate de sodium et 0,005 mM glutathion.₂ Utilisez un débit de 1 à 2 ml/min. Maintenir la température du bain à 28 à 30 oC.
   3. Localiser le striatum dorsale dans le cadre d’un objectif d’immersion 20x. Fixer les tranches avec une grille de nylon sur une harpe en platine pour minimiser le mouvement des tissus. Passez à l’objectif d’immersion 63x /NA 1.0. Sélectionnez des filtres réfléchissant la lumière à 473 nm (miroir dichroique) et la lumière de passage avec des longueurs d’onde 'gt;510 nm (filtre d’émission).
   4. Synchroniser l’éclairage, la stimulation et l’acquisition d’images à l’aide d’un tableau AD/DA avec le logiciel de contrôle respectif. Définissez le programme de déclenchement pour contrôler l’acquisition avec un temps d’exposition au laser de 180 ms et un temps d’acquisition d’image de 160 ms. Utilisez le dispositif de positionnement laser pour envoyer le faisceau laser à un nombre prédéterminé de points et définir les paramètres pour la vitesse de balayage et la taille de tache.
   5. Acquérir une image de l’autofluorescence et iGlu_u-structures positives à l’aide d’un filtre à col élevé à 510 nm ("image jaune").
   6. Acquérir une image avec l’autofluorescence seul à l’aide d’un filtre à cols hauts à 600 nm ("image rouge").
   7. Échelle des images rouges et jaunes, en utilisant les intensités moyennes des 10 pixels les plus brillants et les 10 pixels les plus foncés pour définir la gamme. Effectuez une soustraction « jaune moins image rouge » et réaménagez l’image soustraite pour générer un fichier standard 8 bits tif pour une visualisation pratique du bouton d’intérêt(figure 1D). Il contient les pixels lumineux_udes structures iGlu u-positives, des pixels gris de l’arrière-plan et des pixels sombres des structures à l’autofluorescence.
      REMARQUE : Avec l’équipement donné, la fluorescence moyenne au repos (F) sera inférieure à 700 A.U.
3. Mode de recherche Bouton
   REMARQUE : les pixels iGlu_u-positifspeuvent appartenir à des éléments fonctionnellement différents de l’arbre axonal, tels que des branches d’axone de différents ordre, des sites de bifurcation, des varices après l’épuisement vésicle ou des varices entièrement actives. Cependant, il est presque impossible d’identifier les terminaux synaptiques fonctionnels simplement par inspection visuelle. Par conséquent, chaque terminal synaptique glutamatergique a besoin d’identification par sa réactivité à la dépolarisation électrique. Les sites qui ne répondent pas à la stimulation doivent être jetés. Les moyens physiologiques d’induire la libération de glutamate des axones corticostriatal est d’obtenir un potentiel d’action. Ceci peut être réalisé soit en utilisant un canal rhodopsin de caractéristiques spectrales appropriées ou par stimulation électrique d’un axone visualisé par iGlu_u lui-même. Pour éviter l’activation accidentelle de l’opsine, nous avons préféré ce dernier
   1. Utilisez le puller de micropipette (en mode quatre étapes) pour produire des pipettes de stimulation à partir de capillaires en verre borosilicate. Le diamètre interne de la pointe doit être d’environ 1 m. Lorsqu’elle est remplie d’ACSF, la résistance aux électrodes doit être d’environ 10 M.
   2. Pour induire la libération potentielle de glutamate d’un ensemble de boutons synaptiques attachés au même axon, utilisez le grossissement 63x, le filtre d’émission de 510 nm et l’image soustraite pour placer une électrode de stimulation de verre à côté d’une varice fluorescente . Évitez la proximité d’axones supplémentaires.
   3. Allumez le stimulateur pour délivrer des impulsions de courant dépolarisantes à la pipette de stimulation. Utilisez des intensités actuelles autour de 2 A (pas plus de 10 a).
   4. Activez le système d’application de bain multicanal où un canal offre la solution de bain standard et les autres canaux livrent les bloqueurs nécessaires des canaux ioniques, des transporteurs ou des récepteurs membranaires. Contrôler le flux sur le site de l’enregistrement, puis passer au canal de tétrodotoxine (TTX) (solution de bain plus 1 M TTX). Après 2 à 3 min, stimulez à nouveau le bouton d’intérêt, mais maintenant en l’absence de génération potentielle d’action. La libération est directement due à l’afflux de calcium par des canaux de calcium dépendants de la tension.
   5. En tournant la clé d’intensité sur le stimulateur, ajuster le courant de stimulation pour obtenir des réponses similaires à celles obtenues par des potentiels d’action. Typiquement, le courant de stimulation serait d’environ 6 'A pour une dépolarisation de 0,5 ms.
   6. Pour les tests de base de la préparation, appliquez 0,5 mM CdCl₂. La présence de ce canal de calcium bloquant la libération de glutamate empêche complètement la libération synaptique de glutamate validant ainsi la dépendance de calcium du signal de glutamate directement évoqué.
      REMARQUE : La recommandation générale suivante peut aider à augmenter le taux de réussite des expériences synapses uniques dans le striatum. Pour sélectionner des terminaux synaptiques glutamatergiques avec des machines de libération intactes, une varice devrait : (i) Avoir une forme lisse ressemblant à un fuseau; (ii) Ne pas être associé à une bifurcation d’axone; (iii) Soyez plus lumineux que d’autres structures sur « l’image jaune » ; (iv) Résidez dans le neuropil striatal plutôt que dans les tractations de fibres; v) Résidez sur une branche axone très mince; (vi) Ne pas résider dans les parties les plus profondes de la tranche.

3. Visualisation de la libération et du dégagement du glutamate

1. Mode d’enregistrement
   REMARQUE : Après la soustraction de l’autofluorescence (étape 2.2) et quelques tests initiaux pour la réactivité du bouton d’intérêt (étape 2.3), l’acquisition de données peut commencer. Les réponses à l’activation électrique de la libération de glutamate à partir de terminaux axones simples peuvent être observées directement dans l’image(figure 2), sans appliquer d’autres outils d’analyse. Cependant, il s’est avéré très pratique d’extraire immédiatement certains indicateurs de base de la performance synapse(figure 3). Cette information est nécessaire pour prendre des décisions sur le cours ultérieur de l’expérience, comme la sélection de types terminaux particuliers, l’évaluation rapide des modifications liées à la MH, le nombre et la fréquence des essais ou des médicaments à appliquer avec le système de superfusion. Il pourrait également être nécessaire de traiter éventuellement des artefacts apparaissant. Tout d’abord, les paramètres standard pour l’enregistrement des données sont décrits.
   1. À l’aide du microscope XY lecteurs, placez le bouton testé iGlu_u-positifprès du centre de champ de vision. Arrêtez l’acquisition d’image avec le bouton d’acquisition Abort. Sur la dernière photo acquise, déterminez la position XY du centre bouton au repos en cliquant dessus avec le bouton de la souris gauche. Les coordonnées XY du curseur défini seront affichées sur le panneau d’état inférieur de la fenêtre d’acquisition.
   2. À l’aide des données d’étalonnage (étape 2.1.6), calculez les coordonnées du site où le faisceau laser doit être envoyé pour l’excitation de la fluorescence iGlu_u. Utilisez les équations suivantes : X laser ' X caméra ' X factor ' X offset, Y laser ' Y offset ' Y camera ' Y facteur. Lors de l’exécution de ce recalcul, faites attention aux réglages de retournement vertical ou horizontal de la caméra.
   3. Créez une séquence d’un point dans le logiciel de commande laser à l’aide des coordonnées calculées. À cette fin, sélectionnez Point in the Add à la boîte de séquence sur la page Séquence du logiciel de contrôle laser. Sélectionnez 10 's pour le retard pour déclencher le début et 180 ms pour le temps d’impulsion laser. Déplacez la souris vers les coordonnées calculées et cliquez sur le bouton gauche.
   4. Sélectionnez les paramètres suivants dans le logiciel de commande laser : Exécute: 0, Retard d’exécution: 0, Séquence: Exécuter à TTL. Cliquez ensuite sur la séquence Démarrer.
   5. Dans le logiciel de contrôle de la caméra, sélectionnez les paramètres suivants : Sur la page Binning/ROI, set Image Area: Custom, Pixel Binning: 2x2, Hauteur: 20, Largeur : 20, Gauche: X-coordinate de l’iGlu_uau repos -spot positif moins 10 px, Bottom: Y-coordinate of the resting iGlu_u-positive spot minus 10 px, Acquisition: Kinetic Series, Kinetic Series Length: 400 : 0.0003744s (valeur minimale). Avec de tels paramètres, le taux d’acquisition sera de 2,48 kHz.
   6. Sélectionnez mode Déclencheur: Externe. Cliquez sur Prenez le signal dans le logiciel de contrôle de la caméra. Initier le protocole expérimental établi pour le dispositif de déclenchement.
   7. Mettre en œuvre le protocole expérimental Essai avec la ligne de temps suivante: 0 ms - début de l’essai, 1 ms - commencer l’éclairage laser, 20 ms - commencer l’acquisition d’images avec la caméra, 70 ms - commencer la stimulation électrique 1, 120 - commencer la stimulation électrique 2, 181 ms - essai de fin (laser et caméra éteint). Ainsi, au cours d’un essai, la caméra acquiert 400 images d’une fréquence de 2,48 kHz. Voir les étapes 2.3.3 et 2.3.5. pour plus de détails sur la stimulation électrique.
   8. Pour permettre un rétablissement suffisant des piscines de vésicules présynaptiques, appliquez le protocole Essai avec une fréquence de répétition de 0,1 Hz ou plus bas.
2. Construction hors ligne du glutamate évaluation transitoire et rapide de la libération et de l’autorisation du glutamate pour l’identification des synapses pathologiques
   1. Activez les routines d’évaluation. Ici, nous utilisons un logiciel écrit en interne SynBout v. 3.2. (auteur: Anton Dvorzhak). Les étapes suivantes sont nécessaires pour construire un transitoire de F/F à partir des pixels avec la fluorescence élevée d’iGlu_u comme dans la vidéo de la figure 2.
   2. Pour déterminer la taille du bouton, calculer l’écart moyen et standard (SD) de l’intensité de fluorescence du retour sur investissement au repos (F), avant le début de la stimulation. Déterminer et boxer la zone occupée par des pixels avec F 'gt;mean 3 SD (Figure 3A). Déterminer un diamètre virtuel (en m) en supposant une forme circulaire de la zone supra-seuil.
   3. Déterminer la différence entre la valeur d’intensité maximale et F. Tracer le courant stimulant et le courant stimulant et le F/F contre le temps(figure 3B). Calculez le SD de F/F au repos (avant le début de la stimulation) et l’amplitude maximale. Utilisez pixel avec amplitude maximale plus de 3 SD de 'F/F pour effectuer un ajustement monoexponentiel pour la décomposition du pic. Déterminer la constante de temps de la pourriture TauD de F/F.
   4. Pour estimer l’amplitude maximale à une synapse donnée, sélectionnez le pixel avec la valeur la plus élevée de F/F. Il est généralement situé à l’intérieur ou à côté des limites du bouton de repos iGlu_u fluorescence. L’amplitude maximale serait le meilleur indicateur de la charge de glutamate présentée à la machinerie de dégagement d’une seule synapse.
   5. Pour estimer l’extension spatiale du signal iGlu_u, déterminez le diamètre de la zone de tous les pixels supra-seuil combinés pour former un cercle virtuel. Le diamètre respectif est appelé "Spread". Le terme « écart de pointe » fait alors référence à la valeur maximale de l’écart moyen transitoire(figure 3C, différence entre les lignes rouges pointillées).
3. Corrections pour les artefacts possibles
   REMARQUE : La dépolarisation électrique est associée à un flux extérieur de la solution intra-pipette. Cela peut entraîner un petit déplacement de tissus. Pour faire la distinction entre les changements induits par la stimulation d’iGlu_u et les changements hors foyer de l’image, on pourrait utiliser l’approche suivante pour identifier et éliminer les artefacts de déplacement(figure 4).
   1. Analyser les caractéristiques spatiales des pixels suprathreshold dérivés d’un retour sur investissement avec des signes de déplacement(figure 4F-H).
   2. Trouvez des pixels en dehors des limites initialement déterminées du bouton au repos(figure 4F-H, en boîte en rouge).
   3. Identifier les valeurs d’intensité négatives des pixels (figure 4I, J). Toute F/F dans la direction négative avec une amplitude plus grande que la moyenne pré-stimulation 3 SD doit être considérée comme un artefact, et l’enregistrement doit être jeté.
   4. Pour éviter les artefacts désentraux, placez l’électrode de stimulation sur le côté antero-latéral du bouton synaptique, utilisez la stimulation électrique biphasique et minimisez l’intensité/durée de stimulation.
      REMARQUE : Des artefacts flous peuvent également être dérivés de la caméra. Si ce dernier n’est pas fixé de façon optimale au microscope, il peut produire des oscillations, probablement en raison de petites vibrations du système de refroidissement de la caméra. Ces vibrations créent un motif "yin et yang" dans les images de F/F tournant avec une fréquence de 50 Hz. Les vibrations peuvent être mathématiquement soustraites du signal de fluorescence, mais la qualité finale des mesures dépendrait alors de façon critique du temps d’enregistrement.
   5. Fixez la caméra au microscope de telle sorte que les vibrations sont absentes. Si ce dernier reste, placez un joint en caoutchouc entre la caméra et l’adaptateur au microscope.
      REMARQUE : On ne peut négliger la possibilité que le neuropil striatal autour de la synapse d’intérêt contienne des varicosities glutamatergiques qui n’expriment pas iGlu_u et restent donc invisibles. Dans le cas de leur co-activation (plus probablement en l’absence de TTX), les transitoires obtenus à partir des boutons d’intérêt pourraient être affectés par le débordement. La même chose_us’applique à iGlu u-exprimant des terminaux qui étaient hors de propos. Un phénomène caractéristique serait dans ce cas que les transitoires de fluorescence proviennent d’une zone beaucoup plus large. Comme cette réponse est éliminée par TTX, on peut l’interpréter comme une réponse non spécifique induite par l’activation multi-fibres injustifiée.
   6. Pour corriger cette réponse multifibre non spécifique, suivez la procédure décrite dans la figure 5. Utilisez le signal de fluorescence des pixels aux limites du champ de vision. Pour minimiser la réponse de fond, minimisez l’intensité et la durée de stimulation ou utilisez TTX.

Identification de deux types de varicosses glutamatergiques corticostriatale
Les afferents d’it et de PT proviennent respectivement des couches 2/3 et 5, et présentent des modèles différentiels de ramification et de terminaison dans le striatum ipsilateral et contralatéral (terminaux IT seulement). On sait encore peu de choses sur les propriétés de la libération et du dégagement du glutamate dans des conditions d’activation répétitives observées lors de l’initiation des mouvements, mais il est bien documenté que les varices de glutamate-libération respective diffèrent dans la taille22. Appliquant un critère de taille, il a été constaté que les terminaux informatiques et PT présentent des formes contrastées de plasticité à court terme24. À des intervalles de stimulation de 50 ms, les plus petits terminaux informatiques étaient enclins à la dépression d’impulsion appariée (PPD) tandis que les terminaux plus grands de PT ont montré la facilitation d’impulsion appariée. Cette différence a également été observée à des intervalles plus courts (20 ms) et tout au long d’une série de 6 impulsions. La figure 3 et la figure 6 illustrent ces expériences où la libération synaptique de glutamate a été obtenue par le mécanisme potentiel d’action à la concentration physiologique de Ca2/Mg2.

Identification des synapses dysfonctionnelles chez les souris atteintes de la maladie avancée de Huntington
Les maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson et la maladie de Huntington sont caractérisées par une perte toujours en progression des synapses glutamatergiques36. Les nouvelles thérapies visent à entraver ou même inverser cette progression fatale. Ce qui déclenche exactement la disparition d’une synapse, et quand, est largement inconnu. On peut s’attendre à une meilleure compréhension des études qui offrent des critères pour (a) l’identification vitale d’une classe particulière de synapses glutamatergiques et (b) la détection de contacts dysfonctionnels par rapport à des contacts normalement performants. Ici, il sera montré comment les valeurs TauD obtenues à partir de type PT de terminaux ont été utilisés pour estimer la fraction des synapses dysfonctionnelles dans Q175 hétérozygotes avec un phénotype moteur identifié.

Avant les expériences d’imagerie synapse unique, les souris ont été soumises à un test rapide mais plutôt robuste pour des altérations dans leurs comportements exploratoires. Ce test s’appelle « test de step-over ». L’animal a été placé au centre d’un plat Petri (de 185 mm de diamètre et 28 mm de hauteur de mur). Le test a été enregistré avec une caméra vidéo. À l’aide d’une analyse hors ligne, on peut déterminer le temps entre le décollage de la main de l’expérimentateur et le moment où l’animal a tous les 4 pieds du plat. Tracer les données de plus de 100 WT et Q175 HET à des âges entre 12 et 18 mois suggère que les souris avec une latence step-over de 'gt;300 s peuvent être diagnostiqués comme hypokinétique. La figure 7A illustre une corrélation positive significative entre les résultats obtenus pour le parcours total parcouru dans le champ ouvert et la latence progressive.

L’imagerie iGluu de synapse unique a montré que ces souris MH symptomatiques présentaient un déficit de la vitesse de la carie de glutamate juxtasynaptic comme en témoignent les valeurs TauD des stimuli simples (ou premiers dans une séquence)(figure 7B,C). Dans WT, une telle prolongation n’a été observée qu’après l’application d’un inhibiteur sélectif non transportable de l’absorption du glutamate — DL-threo--t-benzyloxyaspartic acide (TBOA, figure 7D,E). Ceci suggère un rôle des transporteurs astrocytiques de glutamate dans la régulation du dégagement synaptique de glutamate. Les changements dans la diffusion de Glu dans l’espace perisynaptique n’ont pas été trouvés24. Mais, bien sûr, beaucoup plus de travail est nécessaire pour identifier réellement la cause de l’autorisation du glutamate ralenti dans la MH ainsi que dans d’autres formes de parkinsonisme. Outre les changements dans la proximité9 de l’astrocyte et l’expression réduite de slc1A2 37, on peut aussi bien considérer l’instabilité liée à la maladie d’EAAT2 dans la membrane plasmatique des processus d’astrocyte perisynaptic (PAPs). Cela pourrait être le résultat de changements dans l’interaction EAAT2. En effet, les récentes expériences de spectroscopie de masse en laboratoire indiquent une perte d’interaction EAAT2-dystrophine chez les astrocytes striatal (Hirschberg, Dvorzhak, Kirchner, Mertins et Grantyn, non publiés).

On sait très peu de choses concernant la chronologie du dysfonctionnement synaptique avec la progression de la MH, mais il est très probable que les synapses saines coexistent avec les synapses déjà altérées. En recherchant un critère de classification, nous avons examiné les données tauD de différentes souris. À cette fin, les valeurs d’amplitude et de TauD de trois essais appariés consécutifs ont été normalisées à la première réponse (voir la figure 6F pour un régime expérimental), et la probabilité d’occurrence d’une valeur TauD donnée a été comparée dans les WT appariés par rapport au T175 HET(figure 6G). Il a été constaté que dans WT TauD n’a jamais dépassé 15 ms, tandis que dans symptomatique Q175 HET, 40% des synapses ont montré des valeurs TauD entre 16 et 58 ms, en dépit d’une tendance à une réduction de la quantité de glutamate libéré (figure 6H,I). TauD pourrait alors être considéré comme un biomarqueur pour les synapses dysfonctionnelles en HD et être utilisé pour vérifier la récupération fonctionnelle dans les expériences ciblant le transport astrocytique de glutamate.

Figure 1 : Identification des varices iGluu-positives. (A) Image de fluorescence obtenue avec un filtre de passage de 510 nm de haut ("image jaune"). (B) Même champ de vue acquis avec un filtre de passage de 600 nm de haut ("image rouge"). Notez que l’endroit marqué avec la pointe de flèche noire a disparu dans (B). Superposition de (A) et (B). Flèche blanche - autofluorescence, flèche noire - iGluu-varicosity positive. (D) Image obtenue par soustraction de (B) de (A). Les taches autofluorescentes sont sombres et l’iGluu-spot est lumineux. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Film encore à partir d’une vidéo au ralenti (facteur de ralentissement 1240x). Rangée supérieure : Images de WT (à gauche), Q175 HET (au milieu) et HOM (à droite). Rangée inférieure: Respective iGluu transitoires du pixel avec l’élévation de glutamate la plus élevée (Maximal 'F/F). Le curseur rouge indique le point sur le transitoire correspondant à l’image au-dessus de la trace. noter l’élévation prolongée de la fluorescence iGluu (pixels rouges et transitoires F/F). Modifié et réimprimé avec la permission de Dvorzhak et coll.24S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Extraction d’indicateurs fonctionnels à partir d’images synapses uniques du capteur Glu ultrarapyé génétiquement codé iGluu dans les neurones corticostriatal. (A, D) Exemple d’un bouton PT (A) et IT (D) avec la fluorescence iGluu respective au repos (à gauche) et au sommet d’une réponse iGluu (droite) à médiation AP. (B, C, E, F) iGluu réponses enregistrées à partir du bouton montré dans (A, D); Expérimentez en 2 mM Ca2 et 1 mM Mg2. (B) Enregistrement simultané du courant de stimulation (trace supérieure) et intensité moyenne des pixels supra-seuil (trace inférieure). Même échelle de temps pour toutes les traces. Amplitudes maximales (entre lignes horizontales rouges pointillées) et fonction monoexponentielle adaptée à la décomposition de ce pic (superposition rouge). Les valeurs correspondantes de TauD () sont affichées à côté des courbes d’ajustement. (E, F) Terrain de propagation contre le temps. Écart de pointe : différence entre les lignes horizontales rouges pointillées. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : Caractéristiques d’un iGluu transitoire induit par le glutamate (A-E) par opposition à un artefact de déplacement (F-J). (A, B) et (F, G) montrent l’intensité absolue de fluorescence au repos (A, F) et après stimulation (B, G) dans les unités arbitraires (au). (C, H) Changement de fluorescence en pourcentage de la fluorescence au repos avant la stimulation (F/F%). (D, je) Superposition des transitoires iGluu de tous les pixels en unités arbitraires. (E, J) Superposition des transitoires iGluu de tous les pixels dans 'F/F %. Dans le cas de la libération de glutamate synaptique, les pixels à côté du terminal de repos présentent une augmentation de fluorescence après stimulation, tandis que dans le cas de décalages hors foyer le pixel le plus brillant au repos ne font que changer leur position dans le roi d’roi, sans une augmentation d’accompagnement de l’intensité de fluorescence globale du champ de vision. Un artefact de déplacement peut également être reconnu par l’apparition de signaux négatifs de F/F (J). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5 : Correction pour la réponse non spécifique d’iGluu. (A-D) Exemple de réponse synaptique jumelée contaminée par une réponse de fond non spécifique. (E-H) Idem après correction. (A, E) Avant la stimulation. (B, F) Pendant la stimulation. (C, G) Après stimulation. (D, H) Transitoires d’intensité superposées correspondantes (en F/F) à partir de tous les pixels du retour sur investissement. Le délai d’acquisition des images est marqué par de petites lettres correspondantes sur les pointes de flèche. Notez que dans le panneau C la réponse de fond est très répandue et lentement en décomposition. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6 : Différences distinctes de taille et de taille dans le rapport d’impulsion apparié d’amplitude (PPR) de l’iGluu transitoire. (A) Schéma simplifié des circuits corticostriatal22, illustrant le concept de projection préférentielle des neurones pyramidaux (PT) aux neurones de projection striatale de voie indirecte (iSPNs) et aux neurones intratelencéphaliques (IT) pour diriger les SPN de voie directe (dSPN), avec des différences de taille entre les terminaux it et PT. (B) Distribution bimodale des diamètres de bouton tel que déterminé par la fluorescence de repos supra-seuil avant la stimulation. Les boutons d’un diamètre de 0,63 m ont été définis comme « grands » et supposés être émis par des axones PT. Pour les images originales et les traces de spécimens de PT- et IT-type de synapses voir la figure 3. (C) Une corrélation positive significative est observée entre le PPR des amplitudes de pointe et les diamètres de bouton. Chaque point de données représente la moyenne des 3 premiers essais de chaque bouton. P et lt; 0,05, 'P’lt; 0.01, 'P 'lt; 0.001. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7 : Identification des synapses dysfonctionnelles chez les souris Q175 avec un phénotype hypokinétique. (A) Résultats des essais moteurs le jour de l’imagerie synapse unique. Step-over latencies -gt;300 ms ont été considérés comme pathologiques. À l’âge testé (moyenne de 16 mois), 17/54 HET a montré un phénotype prononcé dans le test d’étape-over. En ce qui concerne l’hypokinésie, le test de step-over semble être plus sensible que l’essai sur le terrain ouvert. Néanmoins, il y avait une corrélation significative entre l’issue de l’essai de step-over (temps entre le placement et la barrière franchie avec les quatre pieds) et l’essai sur le terrain ouvert (c.-à-d. le chemin total parcouru en 5 min). Y - -0.01511X ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' P 0,0044 (simple régression). (B) Moyenne évoquée synapse unique iGluu transitoires normalisés à la même amplitude de pointe pour illustrer les différences HD-connexes dans le dégagement du glutamate synaptiquement libéré. Les courbes d’ajustement respectives mettent en évidence les différences dans la durée des transitoires glutamate. (C) Quantification des résultats de type sauvage (gris), HET (rouge) et HOM (magenta). (D, E) L’incubation de tranches de WT dans 100 nM de TFB-TBOA a simulé la dépression de l’autorisation de glutamate observée dans LE CDM. (F) Schéma d’activation synapse et organisation de données. (G) Histogrammes cumulatifs de valeurs de #1 TauD. (H, I) Parcelles de réponses #2 normalisées. Données de 31 synapses WT et 30 HET (tous de type PT). Dans l’échantillon WT, toutes les valeurs de TauDmax étaient de 15 ms. Dans l’échantillon HET, 40 % des synapses présentaient des valeurs TauDmax dépassant le seuil de 15 ms défini par le plus long TauDmax de WT. Ces graphiques mettent l’accent sur les différences liées à la HD dans les gammes d’amplitude maximale (c’est-à-dire la valeur du pixel avec l’augmentation la plus élevée de fluorescence iGluu) et TauDmax (le TauD du pixel avec la plus haute altitude). Les valeurs TauDmax exclusivement rencontrées dans HET sont représentées en rouge, et les valeurs d’amplitude exclusivement observées dans WT sont montrées en gris. P et lt; 0,05, 'P’lt; 0.01, 'P 'lt; 0.001. Les tests statistiques utilisés sont indiqués à côté du graphique respectif. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.