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Article de méthode

Microinjection d'ADN dans eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

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DOI :

10.3791/60123

⸱

4 septembre 2019

 ,  , 
1College of Osteopathic Medicine, Touro University California

Dans cet article

Résumé

Ce protocole vise à démontrer comment microinjecter un mélange ADN/DOTAP dans les œilcs d'embryons de Xenopus laevis d'un jour, et comment imager et reconstruire la protéine fluorescente verte individuelle (GFP) exprimant des arborescences axonales optiques dans les midbrains tectal de intacts, les têtards Xenopus vivants.

Résumé

La projection visuelle primaire des têtards de la grenouille aquatique Xenopus laevis sert d'excellent système modèle pour étudier les mécanismes qui régulent le développement de la connectivité neuronale. Pendant l'établissement de la projection rétino-tectal, les axones optiques s'étendent de l'oeil et naviguent par des régions distinctes du cerveau pour atteindre leur tissu cible, le tectum optique. Une fois que les axones optiques entrent dans le tectum, ils élaborent des arborescences terminales qui fonctionnent pour augmenter le nombre de connexions synaptiques qu'ils peuvent faire avec les interneurons cibles dans le tectum. Ici, nous décrivons une méthode pour exprimer l'ADN codant la protéine fluorescente verte (GFP), et le gain- et la perte-de-fonction des constructions de gène, dans les neurones optiques (cellules de ganglion rétinien) dans les embryons de Xenopus. Nous expliquons comment microinjecter un réagent combiné d'ADN/lipofection dans des bourgeons oculaires des embryons d'un jour de sorte que les gènes exogènes soient exprimés dans un nombre simple ou petit de neurones optiques. En étiquetant les gènes avec GFP ou en co-injectant avec un plasmique GFP, les arborescences axonales terminales des neurones optiques individuels avec la signalisation moléculaire altérée peuvent être représentés directement dans les cerveaux des têtards Xenopus intacts et vivants plusieurs jours plus tard, et leur morphologie peut être quantifiée. Ce protocole permet de déterminer les mécanismes moléculaires autonomes des cellules qui sous-tendent le développement de l'arborescence optique des axones in vivo.

Introduction

Pendant le développement du système nerveux, les axones des neurones presynaptiques naviguent à travers diverses régions du cerveau pour atteindre leurs zones cibles. Lorsque les axones envahissent leurs tissus cibles, ils établissent des connexions synaptiques avec les neurones cibles postsynaptiques. Dans de nombreux types de neurones, les axones augmentent le nombre et l'étendue spatiale des connexions synaptiques qu'ils peuvent faire en élaborant des réseaux de branches terminales ou d'arborescences1. La projection rétino-tectale des têtards de la grenouille aquatique Xenopus laevis est un puissant modèle vertébré pour l'examen des mécanismes sous-jacents à l'arboriculture terminale axon et à la connectivité synaptique2,3,4 . GFP individuel exprimant des arborescences axonales optiques avec la signalisation moléculaire normale et altérée peut être observé directement dans intact, vivant tadpoles de Xenopus 5,6,7,8. Pour exprimer GFP seul ou avec des versions pleine longueur ou tronquées de gènes dans un petit nombre de neurones optiques, nous utilisons une technique impliquant la microinjection / lipofection de l'ADN dans les bourgeons oculaires d'un jour vieux embryons Xenopus 9, 10. Cette technique a été développée à l'origine pour étudier des mécanismes de releveur optique d'axone dans de jeunes têtards de Xenopus, et a depuis été appliquée par nous et d'autres pour déterminer les mécanismes moléculaires cellulaires-autonomes sous-jacents à l'axon optique arborisation dans les têtards Xenopus 5,6,7,8,9,10.

D'autres techniques d'expression des gènes exogènes dans un petit nombre de neurones optiques ont été développées chez d'autres espèces modèles, ainsi que chez X. laevis. Cependant, chacune de ces approches présente des défis et des limitations par rapport à la microinjection de réagent d'ADN/lipofection dans les oculaires des embryons de Xenopus. Chez la souris, la transgenèse peut être utilisée pour exprimer des gènes dans un petit nombre de neurones optiques, mais la génération de souris transgéniques est coûteuse et longue et les souris transgéniques présentent souvent des effets secondaires indésirables11. Le poisson zèbre transgénique qui exprime des gènes exogènes dans les neurones optiques peut également être créé en injectant des plasmides dans les embryons de stade de clivage précoce12. Cependant, ce processus exige le clonage d'un promoteur spécifique pour exprimer des gènes dans un modèle de mosaïque dans les neurones optiques dans les larves de poissons zèbres12. La fréquence d'expression de l'ADN exogène dans les neurones optiques chez le poisson zèbre transgénique est également un peu plus faible (lt;30%) par rapport aux têtards Xenopus qui ont été microinjectés avec de l'ADN/réactif liposomal (30 à 60 %)12. Dans ovo électroporation a également été utilisé pour exprimer les gènes dans un petit nombre de neurones optiques chez les poussins13. Cependant, cette procédure n'a pas réussi à caractériser complètement les mécanismes qui établissent des projections optiques parce que l'arboriculture d'axone optique ne peut pas être imagedans intact, embryons de poussins vivants. Enfin, plusieurs laboratoires ont utilisé l'électroporation pour transfect gènes dans un petit nombre de neurones optiques dans les têtards Xenopus 14,15. Pourtant, l'électroporation nécessite l'optimisation de l'équipement et des protocoles (stimulateur, électrodes, schémas spatiaux et temporels des impulsions d'ondes) au-delà de celui utilisé pour la microinjection d'ADN/réagent de lipofection dans les oculaires des embryons xenopus.

Nous et d'autres précédemment utilisé la technique de microinjection / lipofection de l'ADN dans les bourgeons oculaires des embryons Xenopus pour déterminer les mécanismes de signalisation autonome scellule qui établissent l'arboriculture d'axone optique5,6, 7 Annonces , 8. Nous avons d'abord utilisé cette approche pour disséquer les fonctions de la protéine d'adaptateur Cadherin et Wnt- caténine dans l'arboriculture axonale optique dans les têtards Xenopus 5,6. Dans une étude, nous avons montré que la liaison de la caténine à la caténine et à la PDZ est nécessaire, respectivement, pour lancer et façonner des arbres axonaux optiques in vivo5. Dans un deuxième rapport, nous avons démontré que les domaines de liaison de la caténine pour la caténine et gsk-3 modulent en contrepartie les modèles de projection des arborescences axonales optiques ventrales6. Plus récemment, nous avons identifié des rôles pour le facteur Wnt, adénomatous poliposis coli (APC), dans la régulation des caractéristiques morphologiques des arborescences axonales optiques dans les têtards Xenopus 7. En co-exprimant les domaines N-terminal et central d'APC qui modulent la stabilité et l'organisation de la caténine et de la microtubule avec GFP dans les neurones optiques individuels, nous avons déterminé des rôles partagés et distincts pour ces domaines d'interaction APC sur le nombre de succursales, longueur, et l'angle dans les arborescences axonales optiques in vivo7. Un autre laboratoire a utilisé la technique de microinjection/lipofection pour déterminer les rôles autonomes cellulaires pour la signalisation par le récepteur BDNF, TrkB, dans les arborescences axonales optiques dans les têtards Xenopus 8. Ce groupe a montré que l'expression d'une branchement et de maturation synaptique perturbée par trkB dominant-négatif dans les arborescences individuelles d'axone optique in vivo8. Dans l'ensemble, la technique de lipofection dans Xenopus a déjà illuminé les rôles spécifiques de différents gènes dans la ramification d'axone optique dans l'environnement indigène.

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Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université De Touro en Californie (Protocole - TUCA003TE01X).

1. Obtenir X. laevis Embryons

  1. Obtenir des embryons x. laevis par accouplement naturel de paires de grenouilles adultes mâles et femelles apprêtées à la gonadotropine chorionique humaine (HCG), par fécondation in vitro d'ovules prélevés sur des grenouilles adultes femelles apprêtées par HCG, ou en commandant directement (Tableau de Matériaux).
  2. Embryons de gelée obtenus avec une solution de cystéine de 2% à température ambiante (Tableau des matériaux)16.
    1. Recueillir de 50 à 100 embryons dans un grand plat Petri. Retirez la solution dans laquelle se trouvent les embryons en décantant ou en utilisant une pipette de transfert en plastique. Ajouter 25 ml de solution de cystéine de 2 % (0,5 g de cystéine en 25 ml de ddH2O, pH à 8,0) au plat contenant les embryons.
    2. Faites tourbillonner doucement le plat Petri contenant les embryons dans la solution de cystéine jusqu'à ce que les manteaux de gelée des embryons tombent et que les embryons s'accumulent en touffe au centre du plat (5 à 10 min). À ce stade, versez lentement et doucement la solution de cystéine dans un bécher. Veillez à ne pas verser trop d'embryons dans le bécher avec la solution de cystéine.
    3. Rincez les embryons dans le plat Petri 6x avec une solution Mark's Ringer modifiée à 10 % (MMR) ou d'autres solutions appropriées (p. ex., solution de Barth modifiée, MBS), en faisant tourbillonner le plat chaque fois que la solution est remplacée.
  3. Culture des embryons dans 10% ROR jusqu'à ce qu'ils atteignent les stades de développement 22-2417. Les embryons de Xenopus peuvent être incubés à des températures comprises entre 15 et 25 oC. Le taux de développement des embryons dépend de la température qu'ils sont incubés à17.
    REMARQUE: Les embryons de Xenopus commandés dans un catalogue arrivent généralement en laboratoire à des stades de développement 20 à 24, de sorte qu'ils peuvent être déjellied et microinjectés immédiatement.

2. Préparation des plasmides d'ADN et fabrication d'un mélange ADN/DOTAP

  1. L'expression de l'ADN subclone se construit en vecteurs d'expression Xenopus pCS2 ou pCS2-MT ou dérivés de celui-ci (construit à l'origine par D. Turner et R. Rupp)5,6,7. Les vecteurs pCS2MD contiennent un promoteur modifié de cytomégalovirus (CMV) qui facilite l'expression des gènes chez les grenouilles.
  2. Amplifier les plasmides pCS2 contenant du GFP et/ou des gènes d'intérêt avec des kits de miniprep (Table of Materials) suivant la procédure standard. Dans l'étape finale de l'élution du protocole de miniprep, effectuer une élution séquentielle de l'ADN en ddH2O pour produire une concentration finale de 'gt;1 'g/L.
  3. Entreposez tous les plasmides pCS2 à -80 oC jusqu'à ce qu'ils soient prêts à effectuer une expérience de microinjection/lipofection, c'est-à-dire lorsque les embryons sont à un stade de développement de 22 à 24.
  4. Décongeler les plasmides d'ADN à lipofected à température ambiante. Immédiatement avant la lipoféction, brièvement centrifuger plasmides de l'ADN. Cela empêchera le précipité de se former dans le mélange ADN/DOTAP qui pourrait obstruer la pointe de la pipette microcapillaire.
  5. Combinez les plasmides d'ADN avec le réactif de transfection liposomique DOTAP (Tableau des Matériaux) à un rapport de 1:3 (w/v)9,10. Par exemple, transférer 2 g d'ADN dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml et ajouter 6 l de DOTAP, ou transférer 3 g d'ADN dans un tube de microcentrifuge et ajouter 9 l de DOTAP.
  6. Une fois l'ADN et le DOTAP combinés, faites glisser doucement le tube de microcentrifuge pour mélanger la solution. La solution DNA/DOTAP doit devenir légèrement opaque après le mélange.
  7. Si deux plasmides doivent être lipofectés ensemble (p.p., pCS2-GFP avec un deuxième plasmide pCS2 contenant une version tronquée ou intégrale d'un gène) dans les neurones optiques, combinez d'abord les deux plasmides (après avoir brièvement centrifué les deux) à un rapport de 1:1, puis ajoutez DOTAP à un ratio 1:3 (w/v). Par exemple, combiner 1 g de pCS2-GFP avec 1 g d'un deuxième plasmide pCS2, puis ajouter 6 'L de DOTAP.
    REMARQUE: Des études ont montré que la lipoféction de deux plasmides dans les œilles des embryons xenopus à ces stades de développement se traduira par leur co-expression dans les neurones optiques individuels9,10.

3. Chargement d'une aiguille à microinjection avec de l'ADN/DOTAP

  1. Clip doucement la pointe d'une pipette microcapillaire en verre tiré avec des forceps fins (Table of Materials).
  2. Remblayez la pipette microcapillaire en verre avec de l'huile minérale à l'aide d'un microfil de telle sorte qu'une petite goutte d'huile minérale apparaît à l'extrémité coupée de la micropipette. Remplir la pipette microcapillaire à mi-chemin avec de l'huile minérale.
  3. Chargez la pipette microcapillaire en verre tiré qui est maintenant remplie d'huile minérale dans un support d'injection approprié relié à un injecteur. Si vous utilisez un injecteur (Table of Materials), éjecter le piston à mi-chemin avant de charger la pipette microcapillaire sur elle. Une fois que la pipette microcapillaire est solidement fixée à l'injecteur, étendre le piston dans toute la mesure pour confirmer que la pipette microcapillaire est fortement attachée à l'injecteur et ne se déplace pas avec l'extension du piston.
  4. Transférer une goutte de 3 livres ll du mélange ADN/DOTAP sur une feuille de papier paraffine carré e (1 pouce carré).
  5. Sous un microscope stéréo disséquant, déplacez la pointe de la pipette microcapillaire en verre dans la goutte D'ADN/DOTAP.
  6. Aspirez lentement la goutte d'ADN/DOTAP dans la pipette microcapillaire en verre en utilisant l'option de remplissage sur l'appareil d'injection. Comme le liquide est chargé dans la pipette microcapillaire, la goutte va devenir plus petite. En raison de la légère opacité de la solution ADN/DOTAP, la frontière entre l'huile minérale et la solution DNA/DOTAP doit être visible dans la pipette microcapillaire en verre (figure 1). Au besoin, arrêtez de remplir périodiquement la pipette microcapillaire pour permettre à la pression de la pipette microcapillaire en verre de se recalibrer.

figure-protocol-1
Figure 1 : Images de pipette microcapillaire. Les images montrent une pipette microcapillaire sur l'appareil d'injection, avant (A), et après (B) remplissage avec de l'ADN / DOTAP. Flèches ouvertes, pointe de piston dans la pipette microcapillaire (A,B). Flèche fermée, ligne entre l'huile minérale et l'ADN/DOTAP dans la pipette microcapillaire remplie (B). Barre d'échelle de 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

4. Micro-injection d'ADN/DOTAP dans les boutons oculaires des embryons Xenopus de 1 jour

  1. Dévitelliniser manuellement dix embryons Xenopus de stade 20 à 24 avec des forceps fins dans un plat Petri de 10 mm rempli de 0,1x MMR. Saisissez l'enveloppe vitelline à la taille pour éviter de blesser les embryons. Avec des forceps dans les deux mains gauche et droite de l'expérimentateur, faites éclater la bulle de l'enveloppe vitelline et relâchez l'embryon de l'enveloppe vitelline. Veillez à ne pas blesser les embryons lors de l'enlèvement de l'enveloppe vitelline.
    REMARQUE: À partir du stade 20, les embryons xenopus développent une indentation ou une « taille » entre les moitiés antérieure et postérieure de l'embryon. Cette taille permet de se former un espace entre l'enveloppe vitelline et l'embryon à cette position.
  2. Utilisez une pipette de transfert en plastique avec une pointe coupée pour transférer 5 à 10 embryons de stade 22 à 24 dévitellinisés dans un plat Petri de 10 mm rempli de 1x ROR.
    REMARQUE: La solution de sel plus élevée dans 1x ROR facilite la guérison des plaies perforées qui résulteront de la microinjection.
  3. Sous le stéréomicroscope, saisissez l'un des embryons dévitellinisés dans le plat Petri avec des forceps dans chaque main, et arrangez l'embryon de sorte que son pôle antérieur soit pointé vers le haut dans le champ de vision. Orientez l'embryon de façon à ce qu'il mente latéralement et que l'un de ses œilleux (à gauche ou à droite) soit orienté vers le haut.
  4. Sous le stéréomicroscope, maintenez l'embryon avec les forceps dans la main non dominante de l'expérimentateur, et avec la main dominante de l'expérimentateur introduire la pointe de la micropipette en verre dans le bourgeon (du côté ventral ou du côté dorsal, selon la moitié de l'embryon actuellement injecté), juste sous l'épiderme (Figure 2). Injecter entre 70 et 210 nL de la solution DNA/DOTAP. Cela peut être fait en plusieurs impulsions, selon la taille de l'impulsion de l'injecteur est réglé à (généralement 70 nL).
    REMARQUE: La profondeur de l'injection est très importante pour la lipoféction dans les neurones optiques. Si la position de la pointe du microcapillaire est correctement insérée très superficiellement dans le bourgeon oculaire, puis après la microinjection, l'épiderme gris qui recense le bourgeon oculaire gonflera. Si la position est trop profonde, le bouton oculaire gris ne montrera aucun changement, et la fréquence d'expression de l'ADN dans les neurones optiques sera plus faible.
  5. Retournez l'embryon et effectuez la même microinjection dans le bourgeon oculaire du côté contralatéral de l'embryon.
  6. Injecter les deux œilleux de 6 à 10 (ou plus) embryons dans chaque expérience.
  7. Après la microinjection, entreposez les embryons dans un plat Petri avec 1x ROR pendant environ 30 min pour faciliter la cicatrisation des plaies.
  8. Après 30 min, transférer les embryons injectés dans une solution ROR de 0,1x avec un agent de blanchiment de 0,001% (phénylthiocarbamide) pour réduire la pigmentation. Culture les embryons couverts pendant environ cinq jours, jusqu'à ce que les embryons se soient développés en têtards à des stades 46-4716.

figure-protocol-2
Figure 2 : Délimitation de la région des œilleux pour la microinjection. Schematic (A) et photomicrographe (B) de l'embryon x. laevis aux stades de développement 22/23 montrent la région oculaire qui devrait être ciblée pour la microinjection (points saillants rouges). Barre d'échelle de 1 mm. Le panneau A a été modifié à partir de Zahn et coll.18. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

5. Imagerie de GFP Exprimant Optic Axonal Arbors in Intact, Living Tadpoles

REMARQUE: Lorsque les têtards qui ont été lipofected avec l'ADN atteignent des stades développementaux 46-47, ils sont prêts pour l'imagerie.

  1. Avant l'imagerie, les têtards doivent être anesthésiés. Pour anesthésier les têtards, transférer les têtards lipofected dans une solution de tricaine de 0,02% en ddH2O dans un plat Petri de 10 mm. Attendez 5 à 10 min jusqu'à ce que les têtards deviennent immobiles. Vérifiez que les têtards sont encore en vie en observant leurs cœurs battants sous un microscope stéréo disséquant.
  2. Placer un têtard anesthésié dans une chambre en silicone sur mesure sur un toboggan en verre et sceller avec un bordereau. Le têtard doit s'incliner légèrement de sorte qu'un côté (gauche ou droite) de sa tête est incliné vers le haut et touche à peine le bordereau de couverture.
  3. Filtrer la moitié du cerveau central tectal dorsal du têtard qui est incliné vers le haut à faible grossissement pour GFP exprimant des arborescences axonales optiques.
    REMARQUE: Un microscope droit de large champ équipé d'un éclairage d'épilfuorescence et d'une lentille objective apochromatique (Tableau des matériaux)peut être employé pour dépister des arbores fluorescentes.
  4. Si l'hémisphère tectal contient entre un et trois GFP exprimant des arborescences axonales optiques, capturez une série z d'images de ces arborescences à l'aide d'un objectif de distance de travail à long terme de 40x d'air à fort contraste(Tableau des matériaux). Pour chaque arborescence axonale, capturez des tranches de la série z à intervalles de 1,5 m.
  5. Afin de voir les arborescences d'axone de l'autre côté du cerveau central tectal, recharger le têtard dans la chambre de silicium de sorte qu'il s'incline de l'autre côté et sceller avec un glissement de couverture. Répétez ensuite les étapes 5.3 et 5.4.

6. Reconstruction et quantification de la morphologie optique de l'arborescence axonale

  1. Sélectionnez une pile d'images qui contient entre un et trois GFP exprimant des arborescences axonales optiques.
  2. Utilisez l'outil de dessin à main levée dans le logiciel d'édition graphique (Table of Materials) pour retracer la partie de chaque arborescence axonale optique visible dans chaque z-tranche. Tracer à travers les morceaux de chaque arborescence évidente dans chaque z-tranche créera une projection 2D précise de l'arborescence. Différentes couleurs peuvent être utilisées pour tracer distincte GFP exprimant des arborescences axonales optiques.
  3. Faire toutes les mesures morphométriques sur les reconstructions 2D des arborescences axonales, en référence à la série z originale d'images en cas de besoin7. À l'aide du logiciel Image J(Tableau des matériaux),mesurez les paramètres morphologiques tels que le nombre de branches (c.-à-d. le nombre de pointes de branche ou de points de branche), la longueur totale des branches d'arborescence, la longueur par branche, la longueur et la largeur de l'arborescence, la forme globale de l'arborescence (L/W rapport, circularité) et angle des branches7.

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Résultats

Le protocole décrit dans cet article donne un taux de réussite de 30 à 60% des embryons Xenopus injectés exprimant gFP (seul ou avec une construction supplémentaire d'ADN) dans une à dix arborescences axonales optiques. Dans la figure 3, nous montrons des images confocales représentatives de GFP exprimant le contrôle et les arborescences axonales optiques mutantes dans les têtards Xenopus intacts de notre étude récemment éditée7. Pour cette étude, no...

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Discussion

Dans cet article, nous démontrons comment exprimer les constructions exogènes d'ADN dans un nombre simple ou petit de neurones optiques et comment imager les GFP individuels exprimant les arborescences axonales optiques avec la signalisation moléculaire normale et modifiée dans intact, têtards vivants de la grenouille X . laevis. Nous expliquons également comment reconstruire et quantifier la morphologie de GFP exprimant des arborescences axonales optiques à partir d'images capturées in vivo. Pour exprimer des p...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Nous remercions le Touro University California College of Osteopathic Medicine d'avoir soutenu notre recherche. Nous rendons hommage aux anciens étudiants du laboratoire (Esther Wu, Gregory Peng, Taegun Jin, John Lim) qui ont participé à la mise en œuvre de cette technique de microinjection dans notre laboratoire. Nous sommes reconnaissants à la Dre Christine Holt, dont le laboratoire a développé cette technique de microinjection/lipofection de l'ADN chez les embryons Xenopus.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Micropipettes 3,5"Drummond Scientific3-000-203 - Logiciel G/X
&mu ;-manager (Version 1.4)Vale Labwww.micro-manager.org
Caméra CCDScion CorporationCFW-1312 M
Chorulon (gonadotrophine chorionique humaine)AtoZ Vet SupplyN/A
CysteineSigma-Aldrich168149-100G
DOTAPSigma-Aldrich11202375001
Dumont Forceps #5Fine Science Tools11250-10
Eclipse E800 microscope épifluorescentNikonObjectifs : Nikon Plan Apo 20x/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75
Programme de manipulation d’images GNU (Version 2.10.10)GIMP
Illustrator (2017 Créatif Cloud)Adobe
ImageJ (Version 1.46r)NIH
MicrofilWorld Precision InstrumentsMF 34G-5
Micromanipulateur avec adaptateur universel et base de supportDrummond Scientific3-000-024-R
3-000-025-SB
3-000-024-A
Extracteur de micropipetteSutter InstrumentP-30
Miniprep KitQiagen27104
Z-stage motoriséApplied Scientific InstrumentationMFC-2000
Injecteur Nanoject IIDrummond Scientific3-000-204
Powerpoint (Version 15.31)Microsoft
Xenopus laevis embryonsNascoLM00490

Références

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Microinjection d ADNArborisation des axones optiquesExpression de la GFPInjection d embryonsImagerie confocaleAutonome cellulaireCellules ganglionnaires de la r tineTectum optiqueTechnique de lipofection
Microinjection d'ADN dans eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles
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