Ce protocole vise à démontrer comment microinjecter un mélange ADN/DOTAP dans les œilcs d'embryons de Xenopus laevis d'un jour, et comment imager et reconstruire la protéine fluorescente verte individuelle (GFP) exprimant des arborescences axonales optiques dans les midbrains tectal de intacts, les têtards Xenopus vivants.
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Article de méthode
Microinjection d'ADN dans eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles
Dans cet article
Résumé
Résumé
La projection visuelle primaire des têtards de la grenouille aquatique Xenopus laevis sert d'excellent système modèle pour étudier les mécanismes qui régulent le développement de la connectivité neuronale. Pendant l'établissement de la projection rétino-tectal, les axones optiques s'étendent de l'oeil et naviguent par des régions distinctes du cerveau pour atteindre leur tissu cible, le tectum optique. Une fois que les axones optiques entrent dans le tectum, ils élaborent des arborescences terminales qui fonctionnent pour augmenter le nombre de connexions synaptiques qu'ils peuvent faire avec les interneurons cibles dans le tectum. Ici, nous décrivons une méthode pour exprimer l'ADN codant la protéine fluorescente verte (GFP), et le gain- et la perte-de-fonction des constructions de gène, dans les neurones optiques (cellules de ganglion rétinien) dans les embryons de Xenopus. Nous expliquons comment microinjecter un réagent combiné d'ADN/lipofection dans des bourgeons oculaires des embryons d'un jour de sorte que les gènes exogènes soient exprimés dans un nombre simple ou petit de neurones optiques. En étiquetant les gènes avec GFP ou en co-injectant avec un plasmique GFP, les arborescences axonales terminales des neurones optiques individuels avec la signalisation moléculaire altérée peuvent être représentés directement dans les cerveaux des têtards Xenopus intacts et vivants plusieurs jours plus tard, et leur morphologie peut être quantifiée. Ce protocole permet de déterminer les mécanismes moléculaires autonomes des cellules qui sous-tendent le développement de l'arborescence optique des axones in vivo.
Introduction
Pendant le développement du système nerveux, les axones des neurones presynaptiques naviguent à travers diverses régions du cerveau pour atteindre leurs zones cibles. Lorsque les axones envahissent leurs tissus cibles, ils établissent des connexions synaptiques avec les neurones cibles postsynaptiques. Dans de nombreux types de neurones, les axones augmentent le nombre et l'étendue spatiale des connexions synaptiques qu'ils peuvent faire en élaborant des réseaux de branches terminales ou d'arborescences1. La projection rétino-tectale des têtards de la grenouille aquatique Xenopus laevis est un puissant modèle vertébré pour l'examen des....
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Protocole
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université De Touro en Californie (Protocole - TUCA003TE01X).
1. Obtenir X. laevis Embryons
- Obtenir des embryons x. laevis par accouplement naturel de paires de grenouilles adultes mâles et femelles apprêtées à la gonadotropine chorionique humaine (HCG), par fécondation in vitro d'ovules prélevés sur des grenouilles adultes femelles apprêtées par HCG, ou en commandant directement (Tableau de Matériaux).
- Embryons de gelée obtenus avec une solution d....
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Résultats
Le protocole décrit dans cet article donne un taux de réussite de 30 à 60% des embryons Xenopus injectés exprimant gFP (seul ou avec une construction supplémentaire d'ADN) dans une à dix arborescences axonales optiques. Dans la figure 3, nous montrons des images confocales représentatives de GFP exprimant le contrôle et les arborescences axonales optiques mutantes dans les têtards Xenopus intacts de notre étude récemment éditée7. Pour cette étude, no.......
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Discussion
Dans cet article, nous démontrons comment exprimer les constructions exogènes d'ADN dans un nombre simple ou petit de neurones optiques et comment imager les GFP individuels exprimant les arborescences axonales optiques avec la signalisation moléculaire normale et modifiée dans intact, têtards vivants de la grenouille X . laevis. Nous expliquons également comment reconstruire et quantifier la morphologie de GFP exprimant des arborescences axonales optiques à partir d'images capturées in vivo. Pour exprimer des p.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Nous remercions le Touro University California College of Osteopathic Medicine d'avoir soutenu notre recherche. Nous rendons hommage aux anciens étudiants du laboratoire (Esther Wu, Gregory Peng, Taegun Jin, John Lim) qui ont participé à la mise en œuvre de cette technique de microinjection dans notre laboratoire. Nous sommes reconnaissants à la Dre Christine Holt, dont le laboratoire a développé cette technique de microinjection/lipofection de l'ADN chez les embryons Xenopus.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Micropipettes 3,5" | Drummond Scientific | 3-000-203 - Logiciel G/X | |
| &mu ;-manager (Version 1.4) | Vale Lab | www.micro-manager.org | |
| Caméra CCD | Scion Corporation | CFW-1312 M | |
| Chorulon (gonadotrophine chorionique humaine) | AtoZ Vet Supply | N/A | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 168149-100G | |
| DOTAP | Sigma-Aldrich | 11202375001 | |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools | 11250-10 | |
| Eclipse E800 microscope épifluorescent | Nikon | Objectifs : Nikon Plan Apo 20x/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75 | |
| Programme de manipulation d’images GNU (Version 2.10.10) | GIMP | ||
| Illustrator (2017 Créatif Cloud) | Adobe | ||
| ImageJ (Version 1.46r) | NIH | ||
| Microfil | World Precision Instruments | MF 34G-5 | |
| Micromanipulateur avec adaptateur universel et base de support | Drummond Scientific | 3-000-024-R | |
| 3-000-025-SB | |||
| 3-000-024-A | |||
| Extracteur de micropipette | Sutter Instrument | P-30 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Z-stage motorisé | Applied Scientific Instrumentation | MFC-2000 | |
| Injecteur Nanoject II | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Powerpoint (Version 15.31) | Microsoft | ||
| Xenopus laevis embryons | Nasco | LM00490 |
Références
- Gibson, D. A., Ma, L. Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system. Development. 138 (2), 183-195 (2011).
- Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: d....
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Réimpressions et autorisations
