Mesurer les rythmes diurnes dans le flux autophagique et protéasomal

Résumé

Nous décrivons notre protocole pour mesurer des rythmes biologiques dans le catabolisme de protéine par l'autophagie et le protéasome dans le foie de souris.

Résumé

Les cellules utilisent plusieurs méthodes pour recycler les protéines indésirables et d'autres matériaux, y compris les voies lysosomal et non-lysosomal. La voie lysosome-dépendante principale est appelée autophagie, alors que la méthode non-lysosomale primaire pour le catabolisme de protéine est le système ubiquitine-protéasome. Des études récentes sur des organismes modèles suggèrent que l'activité de l'autophagie et du système ubiquitine-protéasome n'est pas constante tout au long de la journée, mais varie plutôt selon un rythme quotidien (circadien). La capacité de mesurer les rythmes biologiques dans le renouvellement des protéines est importante pour comprendre comment le contrôle de la qualité cellulaire est atteint et pour comprendre la dynamique de protéines spécifiques d'intérêt. Ici nous présentons un protocole normalisé pour quantifier le flux autophagique et protéasomal in vivo qui capture la composante circadienne du chiffre d'affaires de protéine. Notre protocole inclut des détails pour la manipulation de souris, le traitement de tissu, la fractionnement, et la quantification automatique de flux utilisant le foie de souris comme matériel de commencement.

Introduction

Les rythmes circadiens se réfèrent à des variations quotidiennes et prévisibles de la fonction biologique qui sont apparentes dans toute la nature. Ils existent à toutes les échelles biologiques, des comportements macroscopiques comme les cycles veille-sommeil, aux phénomènes moléculaires comme l'abondance rythmique des biomolécules. Ces dernières années, la recherche sur les rythmes circadiens a été transformée par la découverte de « gènes de l'horloge » qui sont essentiels pour la génération de rythmes circadiens. Les études dans les souris knock-out de gène d'horloge ont indiqué un rôle central pour des rythmes circadiens en organisant temporellement des processus cellulaires de noyau tels que le métabolisme^1. Parmi les façons dont les rythmes circadiens y arriver est de transmettre une structure temporelle au catabolisme protéique.

Plusieurs groupes, dont le nôtre, ont montré que les deux principales avenues pour le catabolisme des protéines cellulaires, l'autophagie et le système ubiquitine-protéasome, sont soumises à des rythmes diurnes^2,3,4,5. L'autophagie représente le bras lysosome-dépendant du catabolisme protéique dans lequel les protéines d'intérêt sont livrées à cet organelle dégradante soit par la construction d'une vésicule nouvelle (macroautophagie) ou par translocation directe par un canal (autophagie médiée par chaperon)⁶. Le système ubiquitine-protéasome est la principale voie non-lysosomale, où les protéines sont poly-ubiquitinated et ensuite alimentés dans le protéasome, une machine de dégradation macromoléculaire trouvée dans tout le cytoplasme et le noyau^7,8. Les rythmes dans l'activité autophagique et protéasomale sont importants parce qu'ils jouent probablement un rôle dans l'entretien ménager cellulaire. En conséquence, il est utile d'avoir une procédure standardisée qui peut détecter les oscillations quotidiennes dans le catabolisme protéique qui est compatible avec les modèles précliniques de maladie.

Ici, nous fournissons notre protocole pour quantifier les variations diurnes dans le flux autophégique dans le foie de souris, qui a servi de base pour le travail dans notre laboratoire^3,9. Notre méthode est classée comme un « ruse »¹⁰, une approche utilisée par de nombreux groupes pour mesurer l'activité protéolytique (ou flux). Dans cette approche, des inhibiteurs de la protéase spécifiques aux lysosomes ou aux protéasomes sont administrés à des souris, puis des échantillons de tissus sont obtenus après un intervalle de temps fixe. En parallèle, des échantillons de tissus sont obtenus à partir de souris soumises à des injections fictives. Les échantillons de tissus sont homogénéisés, puis biochimiques séparés pour obtenir les fractions lysosome-enrichies et cytoplasmiques. Ces fractions sont ensuite analysées en parallèle par le biais de ballonnements occidentaux à l'aide d'anticorps spécifiques aux marqueurs macroautophanes (LC3b et p62) ou de substrats protéasomals (protéines poly-ubiquitinated). Au fil du temps, les animaux injectés avec des inhibiteurs de la protéase accumulent des protéines qui auraient normalement été recyclées. En conséquence, le taux de rotation est déduit en comparant l'abondance des protéines marqueurs dans les échantillons traités par protéase-inhibiteur aux échantillons traités par faux. En répétant cette méthode à intervalles fixes tout au long de la journée, il est possible de reconstituer les variations circadiennes de la protéolyse (Figure 1A).

Protocole

Le protocole décrit ici a été approuvé par l'Université de Washington à St. Louis Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Logement de souris et conception expérimentale

1. Pour détecter les rythmes quotidiens dans le renouvellement des protéines, les souris domestiques (mâles ou femelles C57BL/6J, 4 à 8 semaines, 20 à 25 g) dans le cadre de cycles standard de lumière/obscurité de 12 h avec de la nourriture fournie ad libitum. Pour éviter de stresser les animaux, acclimater les souris pendant au moins une semaine dans l'établissement avant d'utiliser et éviter le logement unique. Pour prouver que les rythmes dans le catabolisme protéique sont vraiment circadiens (c.-à-d., entraînés par l'horloge biologique interne de l'animal), les souris de maison dans des conditions sombres constantes, en prenant soin d'éviter d'exposer les souris à la lumière exogène.
   REMARQUE: Pour plus de détails sur le logement de la souris pour les expériences de rythme circadien voir la référence suivante¹¹.
2. Pour chaque point de temps, allouer trois souris comme contrôles fictifs et au moins trois souris pour chaque type d'inhibiteur de la protéase utilisé (leupeptin pour le flux autophagique et bortezomib pour les mesures de flux protéasomal). Planifiez six points de temps uniformément espacés à intervalles de 4 h tout au long du cycle jour/nuit pour obtenir des échantillons de tissus.
   REMARQUE: Une expérience de 24 h, 6 points de temps avec la saline tamponnée de phosphate (PBS), la leupeptin, et le bortezomib exigera un total de 54 souris (3 par traitement x 3 traitements x 6 points de temps).

2. Préparation de la solution d'homogénéisation, des solutions de stock d'inhibiteur, et des vials pour la collection de foie de souris

1. Préparer un tampon d'homogénéisation frais (HB) et garder sur la glace : 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM de saccharose, 5 mM EDTA pH 8,0 et 1 comprimé inhibiteur de la protéase par 100 ml.
   REMARQUE: Environ 10 ml de HB sont nécessaires par souris.
2. Pour le traitement en aval d'échantillons biologiques, chaque échantillon nécessite un tube conique de 15 ml pour contenir l'homogénéisation brute, un tube de 15 ml pour contenir le supernatant post-nucléaire, deux tubes microcentrifuges de 1,5 ml pour contenir les 3 000 x g et 20 000 x g granulés matériau, respectivement, et un tube de microcentrifuge de 1,5 ml pour tenir la fraction cytoplasmique. Ajouter 7 ml de HB froid à chaque tube destiné à l'homogénéisation brute et conserver sur la glace.
3. Préparer une solution de stock de 2 mg/mL de leupeptin hemi-sulfate dans le PBS stérile. Préparez également une solution de 50 mg/mL de bortezomib dans du sulfoxide de diméthyle (DMSO). Aliquot et stocker les solutions à -80 oC.

3. Administration d'inhibiteur de protéase

1. Décongeler les solutions de leupeptin (2 mg/ml) et de bortezomib (50 mg/ml) à température ambiante 15 min avant chaque point de temps. Le stock de leupeptin est prêt pour l'injection. Diluer le bortezomib dans un PBS stérile pour obtenir une solution de travail de 50 g/mL.
   REMARQUE: Bortezomib est sensible à la lumière, afin de protéger le stock de travail de la lumière jusqu'à l'utilisation.
2. Peser les souris et effectuer des injections intrapéritones de PBS « fictif » (0,5 ml), de leupeptin (40 mg/kg) ou de bortezomib (1,6 g/kg). Retournez les souris dans des cages bien marquées regroupées par le type d'injection qu'elles ont reçue. Enregistrez l'heure à laquelle les souris sont traitées ou manipulées dans un tableau standardisé (voir Fichier supplémentaire « Donnéesd'échantillons»).
   REMARQUE: Un calculateur de dose est inclus comme une aide dans le fichier supplémentaire "Données d'échantillon". Il est important d'effectuer des injections rapidement et dans le même ordre de temps en temps pour minimiser la variabilité.

4. Acquisition et stockage de tissus

1. Deux heures après l'injection, euthanasiez les souris une à la fois conformément au protocole approuvé par l'AIIACUC. Par exemple, anesthésier les souris puis euthanasier par luxation cervicale. Passez à l'étape de dissection immédiatement après l'euthanasie.
   REMARQUE: Assurer une anesthésie complète avant la luxation cervicale en pinçant les pattes avant sans réflexe observable.
2. Enlever le lobe gauche du foie en faisant une incision de 1,5 à 2,0 cm avec des ciseaux Metzenbaum sur l'abdomen ventral de la souris. Extérisez le lobe gauche du foie et expirez-le avec des ciseaux chirurgicaux. Immerger l'échantillon de foie dans 7 ml de HB glacé dans un tube conique de 15 ml correctement étiqueté. Garder l'échantillon sur la glace tout au long du traitement.
   REMARQUE: Les échantillons peuvent être conservés sur la glace ou à 4 oC pendant la nuit avant de procéder. Si les marqueurs standard de la macroautophagie et de l'activité protéasomal sont les seuls résiliations prévus, les échantillons de foie peuvent être congelés flash dans de l'azote liquide et stockés à -80 oC pour un traitement ultérieur. Pour examiner d'autres cibles de dégradation (p. ex., par protéomique), traiter les échantillons sans congélation.
3. Procéder à l'euthanasie et disséquer la souris suivante jusqu'à ce que tous les échantillons sont acquis. Traiter les souris dans le même ordre de groupe qu'elles ont été injectées et enregistrer la durée de cette étape (voir Fichier supplémentaire "Données d'échantillon"). Chaque souris doit être traitée en moins de 5 min pour limiter la différence dans les temps d'exposition pour les inhibiteurs injectés.

5. Fractionnement biochimique des échantillons de foie

REMARQUE: La figure 1B montre le schéma de fractionnement.

1. Transférer chaque échantillon de foie et 7 ml de HB dans un homogénéisateur Dounce de 15 ml. Homogénéiser l'échantillon avec 10 coups de piston lâche et 15 coups de piston serré. Retournez l'homogénéat brut résultant au tube conique de 15 ml dont il provient. Répétez l'opération jusqu'à ce que tous les échantillons de foie aient été homogénéisés.
2. Faire tourner les échantillons d'homogénéisme brut à 700 x g pendant 10 min à 4 oC pour granuler les noyaux et les débris. Transférer le top 4 ml de supernatant post-nucléaire (S1) dans un tube conique frais de 15 ml.
3. Déterminer la concentration en protéines de la fraction S1 à l'aide de Bradford ou d'acide bicinchoninique (BCA) selon les instructions du fabricant. Ensuite, égalisez les concentrations de tous les échantillons à 2,1 mg/mL ou à la concentration désirée en ajoutant du HB frais à S1 si nécessaire. Les échantillons normalisés sont la fraction « Protéines totales » (Tot). Pour des raisons d'analyse en aval et d'amélioration de la qualité, aliquot 500 'L de la fraction Tot et stocker à -80 oC.
4. Transférer 1,5 ml de la fraction tot restante dans un tube de microcentrifuge et tourner à 3 000 x g pendant 15 min à 4 oC. Transférer 1 ml du supernatant résultant (S2) dans un tube de microcentrifuge frais et mis sur la glace.
5. Aspirez le reste du supernatant et lavez le 3 000 x g de granule (3KP) deux fois avec 1,5 ml de HB froid. Le granule 3KP peut être stocké à sec à -80 oC si l'on s'attend à une protéomique en aval. Si l'on ne prévoit que des ballonnements occidentaux, suspendez la pastille 3KP dans 200 L de polyacrylamidede sulfate de sodium polyacrylamide gel électrophoresis (SDS-PAGE) et faites bouillir à 95 oC pendant 5 min.
6. Faire tourner la fraction S2 à 20 000 x g pendant 20 min à 4 oC. Transférer le supernatant résultant (S3) dans un tube microcentrifuge frais. S3 est la fraction cytoplasmique (Cyto). Pour sDS-PAGE, combiner 150 oL de fraction cyto avec 50 oL de tampon d'échantillon SDS-PAGE 4x et faire bouillir à 95 oC pendant 5 min.
7. Aspirez le reste du supernatant de la 20 000 x g de granule (20KP) et lavez deux fois avec 1,5 ml de HB froid. Le granule de 20KP peut être stocké à sec à -80 oC si l'on s'attend à une protéomique en aval. Si l'on ne prévoit que des ballonnements occidentaux, suspendez la pastille de 20 KP dans 100 l de tampon d'échantillon SDS-PAGE et faites bouillir à 95 oC pendant 5 min.

6. Western Blotting Readout

1. Afin de quantifier le flux macroautophagique et protéasomal par le biais du ballonnement occidental, composez une solution de stock de gst-LC3b purifié (2 g/mL), p62-His₆ (2 g/mL), et Lys⁴⁸ polyubiquitin lié (K48-Ub, 50 g/mL) dans 1 x tampon d'échantillon SDS-PAGE. Après ébullition à 95 oC pendant 5 min, aliquot et conserver à -80 oC pour une utilisation future.
2. Au moment de SDS-PAGE, générer une courbe standard de 6 points du mélange de protéines standard en diluant en série 1:3 dans 1x tampon d'échantillon SDS-PAGE. Chargez 10 L de chaque échantillon de courbe standard sur un puits de 26 puits 4 à 12 % SDS-PAGE midi-gel, suivi de normes de protéines présagées (Tableau des matériaux), une norme de poids moléculaire commercial.
3. Pour mesurer le flux autophagique, chargez 12 'L d'échantillon 3KP dans chaque puits.
   REMARQUE: En supposant que des traitements fictifs, de bortezomib et de leupeptin ont été faits et en supposant que 3 souris par traitement, chaque point de temps devrait se composer de 9 échantillons. Par conséquent, chaque midi-gel peut accueillir 2 points de temps plus la courbe standard et une expérience de série de temps typique nécessitera 3 midi-gels pour la lecture.
4. Pour mesurer le flux protéasomal, chargez 12 'L de fraction cyto dans chaque puits.
5. Séparer les échantillons de protéines par SDS-PAGE et le transférer aux membranes de fluorure de polyvinylide (PVDF) en utilisant des protocoles standard. Si l'on s'attend à des ballonnements occidentaux pour le LC3b, transférez les gels à l'aide d'un tampon de transfert contenant 20 % de méthanol. Dans le cas contraire, utilisez un tampon de transfert contenant 10 % de méthanol, car cela permettra un transfert plus efficace des espèces protéiques de poids moléculaire élevé.
6. Effectuer des ballonnements occidentaux à l'aide de protocoles standard. Pour l'analyse du flux macroautophégique, les membranes de tache contenant des échantillons 3KP avec des anticorps anti-p62 ou anti-LC3b (1:1,000) pendant la nuit à 4 oC. Pour l'analyse du flux protéasomal, les membranes de tache contenant des échantillons de Cyto avec la polyubiquitine spécifique d'anti-Lys⁴⁸ (1:1,000) pendant la nuit à 4 oC.
7. Image western blots à l'aide d'anticorps secondaires standard et des dispositifs d'imagerie. Imagetoutes de toutes les membranes qui constituent une expérience de série chronologique donnée ensemble.

7. Analyse des données

REMARQUE: Voir Fichier supplémentaire "Données d'échantillon".

1. Pour effectuer la densitométrie sur des échantillons de taches occidentales, utilisez un logiciel graphiquestandard, Image Studio, ou bien ImageJ.
2. Effectuer des mesures densitométriques sur des bandes d'intérêt pour la courbe standard et les échantillons expérimentaux. Dans Image Studio, en utilisant p62 comme exemple, dessinez un long rectangle englobant le monomère de protéines au fond et s'étendant jusqu'au sommet de la membrane. Copier, coller et déplacer le rectangle vers les échantillons restants. Il est important de garder le rectangle utilisé pour la quantification compatible entre les échantillons.
3. Enregistrez la quantification dans une feuille de calcul en appuyant sur la feuille de calcul et de lancement en bas à droite de la fenêtre d'analyse.
4. Générer une courbe standard densitométrique avec feuille de calcul à l'aide de l'échantillon standard dilué en série et utiliser une régression linéaire ou polynomiale pour obtenir une équation de courbe standard la plus adaptée. À l'aide de cette équation, extrapolez la quantité de p62, LC3b-II ou Lys⁴⁸-poly Ub dans les échantillons expérimentaux.
5. Pour obtenir des mesures de flux, soustrayez la quantité de protéines extrapolées de chaque échantillon traité par inhibiteur de la valeur moyenne des échantillons de PBS à partir du même point de temps (voir Fichier supplémentaire « Données d'échantillons »).
6. Évaluer la signification statistique de la variation temporelle du renouvellement des protéines à l'aide d'ANOVA à sens unique. Cela peut être fait à l'aide d'un logiciel de tableur standard.

Résultats

Les données représentatives sont présentées à la figure 2A,B, et la quantification de ces données est fournie à la figure 2C,D (voir aussi Le fichier supplémentaire « Données d'échantillon »). Par souci de simplicité, nous n'avons pas représenté les commandes de chargement à la figure 2, mais celles-ci doivent être obtenues en parallèle. Typiquement, les taches occidentales contre l...

Discussion

Notre protocole décrit un moyen techniquement simple de mesurer les rythmes biologiques dans le renouvellement des protéines chez les souris à l'aide d'équipements de biologie moléculaire couramment disponibles. En raison de la durée des expériences de la série chronologique et du nombre d'échantillons biologiques impliqués, il est important d'être cohérent dans l'ensemble de l'expérience en ce qui concerne la façon dont les souris sont injectées, le moment de l'acquisition des tissus et le traitement biochimique de Écha...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
4x SDS PAGE Tampon d’échantillon	Invitrogen	Cat# NP0008
Bortezomib	EMD Millipore	Cat# 5.04314.0001 ; CAS : 179324-69-7
Image Studio	LICOR	N/A
Immobilon-FL Membrane PVDF 0,45 micron	Merck Millipore Ltd	Cat# IPFL00010
K48-linkage Polyubiquitine spécifique (D9D5) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	Cat#8081S ; RRID :AB_10859893
LC3a	Boston Biochem	Cat# UL-430
LC3b anticorps	Novus	Cat#NB100-2220 ; RRID :AB_10003146
Technologie de signalisation cellulaire	de l’anticorps LC3b	Cat#2775 ; RRID :AB_915950
Leupeptin	Sigma	Cat# L2884 ; CAS : 103476-89-7
NuPAGE 4-12 % Bis-Tris Midi Protein Gels	Thermo Fisher Scientific	Cat# WG1403BOX
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	Thermo Fisher Scientific	Cat# NP0007
P62-his	Novus	Cat# NBP1-44490
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards	Bio-Rad	Cat# 1610373
Lapin Anti-P62/SQSTM1	Millipore-Sigma	Cat#P0067 ; RRID :AB_1841064
rhPoly-Ub WT (2-7) (K48)	Boston Biochem	Cat# UC-230
SDS-PAGE Gels de taille midi	Invitrogen	Cat# WG1403
SIGMAFAST Inhibiteur de protéase	Comprimés Millipore-Sigma	Cat# S8830