Mesurer les rythmes diurnes dans le flux autophagique et protéasomal

Résumé

Nous décrivons notre protocole pour mesurer des rythmes biologiques dans le catabolisme de protéine par l'autophagie et le protéasome dans le foie de souris.

Résumé

Les cellules utilisent plusieurs méthodes pour recycler les protéines indésirables et d'autres matériaux, y compris les voies lysosomal et non-lysosomal. La voie lysosome-dépendante principale est appelée autophagie, alors que la méthode non-lysosomale primaire pour le catabolisme de protéine est le système ubiquitine-protéasome. Des études récentes sur des organismes modèles suggèrent que l'activité de l'autophagie et du système ubiquitine-protéasome n'est pas constante tout au long de la journée, mais varie plutôt selon un rythme quotidien (circadien). La capacité de mesurer les rythmes biologiques dans le renouvellement des protéines est importante pour comprendre comment le contrôle de la qualité cellulaire est atteint et pour comprendre la dynamique de protéines spécifiques d'intérêt. Ici nous présentons un protocole normalisé pour quantifier le flux autophagique et protéasomal in vivo qui capture la composante circadienne du chiffre d'affaires de protéine. Notre protocole inclut des détails pour la manipulation de souris, le traitement de tissu, la fractionnement, et la quantification automatique de flux utilisant le foie de souris comme matériel de commencement.

Introduction

Les rythmes circadiens se réfèrent à des variations quotidiennes et prévisibles de la fonction biologique qui sont apparentes dans toute la nature. Ils existent à toutes les échelles biologiques, des comportements macroscopiques comme les cycles veille-sommeil, aux phénomènes moléculaires comme l'abondance rythmique des biomolécules. Ces dernières années, la recherche sur les rythmes circadiens a été transformée par la découverte de « gènes de l'horloge » qui sont essentiels pour la génération de rythmes circadiens. Les études dans les souris knock-out de gène d'horloge ont indiqué un rôle central pour des rythmes circadiens en organisant temporellement des processus ....

Protocole

Le protocole décrit ici a été approuvé par l'Université de Washington à St. Louis Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Logement de souris et conception expérimentale

1. Pour détecter les rythmes quotidiens dans le renouvellement des protéines, les souris domestiques (mâles ou femelles C57BL/6J, 4 à 8 semaines, 20 à 25 g) dans le cadre de cycles standard de lumière/obscurité de 12 h avec de la nourriture fournie ad libitum. Pour éviter de stresser les animaux, acclimater les souris pendant au moins une semaine dans l'établissement avant d'utiliser et éviter le logement unique. Pour prouver que les rythmes dans le catabol....

Résultats

Les données représentatives sont présentées à la figure 2A,B, et la quantification de ces données est fournie à la figure 2C,D (voir aussi Le fichier supplémentaire « Données d'échantillon »). Par souci de simplicité, nous n'avons pas représenté les commandes de chargement à la figure 2, mais celles-ci doivent être obtenues en parallèle. Typiquement, les taches occidentales contre l.......

Discussion

Notre protocole décrit un moyen techniquement simple de mesurer les rythmes biologiques dans le renouvellement des protéines chez les souris à l'aide d'équipements de biologie moléculaire couramment disponibles. En raison de la durée des expériences de la série chronologique et du nombre d'échantillons biologiques impliqués, il est important d'être cohérent dans l'ensemble de l'expérience en ce qui concerne la façon dont les souris sont injectées, le moment de l'acquisition des tissus et le traitement biochimique de Écha.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
4x SDS PAGE Tampon d’échantillon	Invitrogen	Cat# NP0008
Bortezomib	EMD Millipore	Cat# 5.04314.0001 ; CAS : 179324-69-7
Image Studio	LICOR	N/A
Immobilon-FL Membrane PVDF 0,45 micron	Merck Millipore Ltd	Cat# IPFL00010
K48-linkage Polyubiquitine spécifique (D9D5) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	Cat#8081S ; RRID :AB_10859893
LC3a	Boston Biochem	Cat# UL-430
LC3b anticorps	Novus	Cat#NB100-2220 ; RRID :AB_10003146
Technologie de signalisation cellulaire	de l’anticorps LC3b	Cat#2775 ; RRID :AB_915950
Leupeptin	Sigma	Cat# L2884 ; CAS : 103476-89-7
NuPAGE 4-12 % Bis-Tris Midi Protein Gels	Thermo Fisher Scientific	Cat# WG1403BOX
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	Thermo Fisher Scientific	Cat# NP0007
P62-his	Novus	Cat# NBP1-44490
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards	Bio-Rad	Cat# 1610373
Lapin Anti-P62/SQSTM1	Millipore-Sigma	Cat#P0067 ; RRID :AB_1841064
rhPoly-Ub WT (2-7) (K48)	Boston Biochem	Cat# UC-230
SDS-PAGE Gels de taille midi	Invitrogen	Cat# WG1403
SIGMAFAST Inhibiteur de protéase	Comprimés Millipore-Sigma	Cat# S8830