Summary
Her præsenterer vi en protokol for at kvantificere reden bygnings adfærd i mus, som vides at være svækket i flere neurologiske lidelser og sygdomme. Denne protokol undersøger nytten af fire materialer og giver mulighed for at kvantificere rater aftalen i scoring, forbedre validiteten og pålideligheden af analysen.
Abstract
Nest Building er en medfødte adfærd i mandlige og kvindelige gnavere, selv når de rejses i laboratorie indstillinger. Som sådan giver mange forskere gnavere syntetiske og/eller naturlige materialer (såsom sejlgarn, væv, bomuld, papir og hø) som en målestok for deres generelle trivsel og som en supplerende vurdering for at forudsige det mulige fald i kognition. Ændringer i indlejrings adfærd, såsom manglende oprettelse af en reden, indikerer typisk en ændring i sundhed eller velfærd. Hertil kommer, at indlejring adfærd er følsom over for mange miljømæssige og fysiologiske udfordringer, samt mange genetiske mutationer underliggende patologiske sygdomstilstande. Følgende protokol beskriver et nesting Behavior paradigme, der udforsker brugen af fire typer af indlejrings materiale. Desuden anvender protokollen intraclass korrelationer til at påvise, at Inter-rater pålidelighed er højere, når reder er konstrueret ud af strimlet papir sammenlignet med andre fælles redematerialer såsom bomulds firkanter, papir drejninger og bløde COB Sengetøj. Den valgte metodologi og statistiske overvejelser (dvs. intraclass korrelation) for denne analyse kan være af interesse for dem, der udfører eksperimenter, der vurderer leve kvaliteten af mus.
Introduction
Nest Building er en medfødte opførsel i mange dyr som fugle, fisk, gnavere og store aber, og det tiltrækker mere opmærksomhed for dets potentielle nytte i studiet af neurologiske sygdomme og lidelser karakteriseret ved formindsket velvære og nedsat dagligdags aktiviteter1. Mus, både mænd og kvinder, opbygge lignende mellemstore reder til reproduktive formål, varme bevarelse, og husly; endnu vigtigere, de fortsætter med at gøre det, selv når de rejses i laboratorie indstillinger2. Hess, Petrovich, og Goodwin3 hævder, at biologisk-passende stimuli er altafgørende for at fremkalde biologisk-passende adfærd såsom indlejring; men en række naturlige og kunstige materialer, såsom hø, hamp, bomuld sejlgarn, papirstrimler, bomuld dental bolde, og pressede bomulds firkanter, er blevet brugt til at vurdere reden bygning adfærd2. Ændringer i disse indlejrings adfærd (dvs. manglende oprettelse af en rede ud af det medfølgende materiale) indikerer generelt en ændring i sundhed eller velfærd. I de fleste tilfælde, en mangel på reden bygning tilskrives flere faktorer, der negativt påvirker trivsel. Sådanne eksempler, der alle effektivt har reduceret kvaliteten af reden bygning i mus omfatter ekstreme temperaturer; smertefuld stimulation; induceret sygdom og infektion; genetiske mutationer; og hjernelæsioner i de mediale præoptiske områder, septum, og hippocampus4,5,6.
Alzheimers sygdom er en progressiv neurodegenerativ sygdom karakteriseret ved tab af hjernevæv, ophobning af ekstracellulære amyloid-β plaques, og intracellulære neurofibrillære tangles komponeret hyperfosforyleret microtubule-associeret protein, Tau7. Desuden er Alzheimers sygdom karakteriseret ved, især, underskud i læring og hukommelse og nedskrivninger af dagligdags aktiviteter. I mus undersøges dagligdags aktiviteter almindeligvis via cirkadiske hjul, der kører8,9,10,11, selv om nye alternativer, såsom indlejring, vokser i popularitet. Nesting har vist sig at være følsom over for manipulationer (f. eks. genetiske mutationer, miljømæssige stressorer), der er identificeret som risikofaktorer og/eller årsager til Alzheimers sygdom. Som sådan, indlejring kan bruges som en supplerende eller supplerende analyse i mange muse stammer, der modellere disse egenskaber af Alzheimers sygdom. For eksempel har diakon og kolleger12 målt reden bygning af Tg2576 mus med den svenske amyloid forløber protein (APPswe) og presenilin 1 (PS1) genetiske mutationer. Kvaliteten af reder konstrueret af gruppe-husede Tg2576 mus var betydeligt værre end dværg kontrol på både 3-og 12-måneders alderen. Efter aftale med disse resultater rapporterede FILALI et al.13 , at de enkelt husede APPswe/PS1 hanmus givet to stykker af 5 x 5 cm bomuld bygget betydeligt fattigere reder som bedømt på en skala fra 1-5 (1 = nestlet ikke rørt, 5 = en nær perfekt reden). Transgene mus konsekvent bygget dårligere reder på 6-, 9-og 12-måneders alderen i forhold til deres dværg modparter, og i nogle tilfælde, appswe/PS1 mus helt undladt at bygge en reden ud af den medfølgende bomuld.
Tidligere forskning fra vores laboratorium har vist, at dværg C57BL/6j-mus opbygger betydeligt bedre reder ud af bomulds firkanter sammenlignet med CRND8 og CRND8/E4-mus9. Men de fleste eksperimenter med pressede bomulds firkanter ser ud til at være variable, mens dværg-mus ikke viser forventede high scores i forhold til Transgene mus, der forventes at vise meget lave scorer i indlejring2, hvilket delvis kan føre til en manglende forskelle i de anslåede parametre (dvs. gennemsnitlige forskelle) og Statistisk signifikans. Manglen på forskelle kan delvis skyldes utilstrækkelig ældning af mus eller tid afsat til indlejring. Alternativt kan indlejrings materiale være en yderligere udfordring, hvilket resulterer i større variation på grund af forskernes metodologiske præferencer i mængden og typen af materiale, som endda kan interagere med muse stammen. F. eks. leverede Robinson-Junker og kolleger14 forarbejdede eller uforarbejdede strøelse af forskellige størrelser (dvs. små eller store flager) til C3H/hencrl-mus og Balb/canncrl-mus, som almindeligvis observeres henholdsvis som fattige og stærke Nest Builders. Når de leveres uforarbejdede strøelse, C3H mus bygget mindre komplekse, men lignende i kvalitet reder i forhold til dem af BALB/c mus. På samme måde sammenlignede Martin og kolleger15 reden kompleksitet af forskellige indlejrings materialer givet til hjorte mus, en fjern slægtning af mus musculus arter, der har særskilte evolutionære forskelle (dvs. mere tilbøjelige til at burrow i træer og under børsten og er mere aktive i fangenskab), men modtager lignende opdræts pleje som almindelige laboratorie mus og bygge reder ud af alle tilgængelige bløde, fibrøse materiale16,17,18. Hunner og opdrættere med pup i hjemmet bur bygget mere komplekse reder end mænd, og forfatterne tyder på, at disse adfærdsmæssige forskelle kan skyldes tilknyttede ændringer i progesteron koncentrationer i hjorte mus15. Endnu vigtigere er det, at mus byggede mere komplekse reder bestående af brunt papir efterfulgt af bomulds firkanter og bomulds cylindre, og de mindst komplekse reder blev konstrueret ud af hvidt papir og spredte mini-bomulds firkanter.
På trods af den stigende popularitet af indlejring, overvejelser om videnskabeligt gyldige, omkostningseffektive, og tidsfølsomme praksis er minimalt diskuteret. I betragtning af ovennævnte metodologiske og økonomiske udfordringer, undersøger denne protokol nytten af forskellige indlejrings materialer-bomulds firkanter, papir drejninger, strimlet papir og forarbejdet strøelse-i indlejrings adfærd. Specifikt, vi leverede alle redematerialer til både alderen C57BL/6j dværg kontroller og Alzheimers sygdom ApoE E4 mus for at undersøge enhver potentiel genotype af materielle interaktioner i indlejring kvalitet. Derudover søgte eksperimentet at vurdere Inter-rater pålidelighed af reder konstrueret af forskellige materialer. Samlet set viser denne protokol overlegenhed af et redemateriale i denne prøve-makuleret papir-i form af reden kvalitet og scorer aftale, med den hensigt at forbedre validiteten og pålideligheden af nesting assay.
Protocol
Alle procedurer blev godkendt af George Mason University institutionel Animal Care og brug udvalg og er i overensstemmelse med retningslinjer, der er fastsat af vurdering og akkreditering af Laboratoriedyrs pleje.
1. dyr og overvejelser forud for vurderingen
- For denne protokol, brug voksen, 9-12-month-Old C57BL/6j (n = 10) (Stock # 000664) dværg mus og ApoE E4 mus (n = 11) fra en hemizygous J20 (Stock #006293) x homozygot ApoE E4 (Stock #012307) Cross.
- I boligrummet, gruppe-House mus med littermates af samme køn med passende berigelse (f. eks, for denne protokol, mus blev leveret et løbehjul, Igloo, og en lille nylon tygge legetøj). Group-House 4-6 hunmus og 4 hanner i en 356 mm L x 485 mm W x 218 mm H hjem bur.
Bemærk: forskerne kan overveje at implementere strategier før og/eller efter indlejring for at undgå bur-Mate aggression, når mus er genindført efter indlejring forsøg. Sådanne strategier kan omfatte, men er ikke begrænset til, daglig håndtering før adfærdsmæssige tests for bedre at akkliere mus til håndtering under adfærdsmæssige tests, forskere og opdræts personale19, adskillelse og individuelt boliger aggressive mus, eller reducere antallet af mus i homecage20, afhængigt af sværhedsgraden af in-Cage kampe, observerede sår21, etc.
2. rum-og indlejrings opsætning
- Sørg for, at hver mus fuldfører fire forsøg (1 materiale pr. prøveversion). Randomiserer rækkefølgen af indlejrings materiale for hver mus for at undgå en ordre effekt.
- Forbered burene i et separat testrum. Optag miljøforhold (f. eks. 22,2 – 22,3 °C, 45-47% fugtighed, lys på 9:00 AM – 9:00 PM), således at de er konsekvente på tværs af forsøg og er identiske med boligrummet. Giv mad og vand ad libitum.
- Tildel hver mus et tilfældigt identifikationsnummer (ID) eller bogstav. Fastgør det tilfældige id-kort til et 29,2 x 18,4 cm bur.
- Registrer det oprindelige dyre-ID/tag og anden nødvendig identifikation i en koloni rekord for at sikre, at assistenter og husdyrhold forbliver blinde for forholdene.
- Bestil tilfældigt bur placering i testrummet, således at dværg og Transgene mus ikke er uhensigtsmæssigt adskilt (dvs. på modsatte sider af rummet, på separate hylder, etc.).
- Forbered redematerialet ved at dække bunden af buret tilstrækkeligt. Brug ca. 100 g tørvægt af kolbe-strøelse til kvadratet, twist og strikkede papir prøver og ca. 100 g af det bløde COB-sengetøj til den bløde COB-prøve.
- Hvis du bruger et bægerglas til at sprede redematerialet, så fyld bægerglasset ikke mere end 100 ml med kolbe strøelse eller blødt COB strøelse.
- Placer det første indlejrings materiale i sekvensen, før du introducerer musen i buret. Denne protokol udnyttede (1) en enkelt presset bomulds firkant, (2) et enkelt papir twist, (3) 100g af blødt COB strøelse (dvs. ingen ekstra strøelse eller indlejrings materiale tilføjet) og (4) 2,5 g ren (ingen blæk), strimlet hvid printerpapir skåret i 5-7cm strimler. Disperse nesting materialer som vist i figur 1 (baseline).
Figur 1: Opsætning af bur for hvert materiale. Alle mus afsluttede en retssag med hver type materiale til i alt fire forsøg. Corncob strøelse foret hele bunden af bure, der indeholder et papir twist, en presset bomulds firkant, og strimlet papir. Blødt COB strøelse var jævnt fordelt over buret for at opmuntre mus til at adskille de små bomulds firkanter fra corncob. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
3. nesting retssag
- Begynd den første indlejrings prøve på samme tidspunkt af dagen i starten af lyscyklussen (f. eks. 9:00 AM).
- Bring den hjemkomst, der indeholder musene, ind i testlokalet. Fjern hver mus fra hjemkomst og Placer den i dens tildelte indlejrings bur med det materiale, der allerede er placeret i buret. Returner hjemkomsten til boligrummet.
- Lad mus til at fuldføre 1 retssag for 24 h uforstyrret.
- 24 timer efter starten af den første retssag, vend tilbage til testlokalet.
- Fjern forsigtigt låget af buret og fotografere hver mus reden, fange den tildelte ID i fotografiet og minimere udseendet af eventuelle materialer uden for buret.
Bemærk: Vent på, at musen bevæger sig væk fra reden, før du forsøger at fjerne den fra buret. Det anbefales kraftigt at fotografere reden, mens musen er i buret, men væk fra reden. Forsøg på at fjerne musen fra buret før fotografering kan potentielt forårsage musen til at blive forsket, således bevæge sig på toppen af, og sprede, indlejrings materialer. - Fjern forsigtigt musen fra indlejrings buret og Placer den i et midlertidigt holde bur. Kassér strøelse og eventuelle redematerialer, Udskift strøelse og give den næste redemateriale i sekvensen, og returnere musen til redeburet bur.
- Gentag efter behov for at opnå resultater for alle 4 forsøg. Det anbefales at bruge strimlet papir og de ledsagende scoring kriterier, selv om forskerne kan være interesseret i at bruge de alternative materialer, der er omtalt i denne protokol.
- Når alle forsøg er afsluttet, returnere mus til deres hjem bure. Overhold musene for enhver potentiel aggressiv opførsel. Aggression kan forekomme hos ældre dværg mænd.
Bemærk: med henblik på denne protokol blev mus testet én gang ved ca. 9 – 12 måneders alderen. Nesting bør gennemføres i flere aldre (dvs. i en tidligere alder, afhængig af den valgte stamme, før fremkomsten af fænotypiske træk) at dokumentere faldet i nesting kapacitet over tid og demonstrere den sandsynlige årsagssammenhæng rolle neurodegeneration.
4. scoring og vurdering Inter-rater pålidelighed
- Levere baseline-billeder for hvert redemateriale til mindst 2 personer, som er blinde for studiet. Selv om det ikke er nødvendigt, sikre, at de scorere er bekendt med begrebet indlejring. Når du træner scorere, give en række eksempel reder (f. eks figur 2 for strimlet papir) for at gøre de scorere med hver type materiale (hvis relevant) og scoring kriterier.
- Evaluer hver reden på en skala fra 1 – 5 ved hjælp af følgende skala oplysninger (tilpasset fra Deacon, 2006)2. Se figur 2 som eksempel scoring ved hjælp af strimlet papir.
- Tildel en score på 1, når det strikkede papir eller små firkanter forblev spredt i hele buret, eller bomulds firkanten eller vingen forblev uberørt;
- Tildel en score på 2, når noget af materialet blev konstrueret til en rede, men over 50% af materialet blev ikke brugt til Nest byggeri (dvs. forblev spredt eller størstedelen af det oprindelige materiale forblev uberørt);
- Tildel en score på 3, når en mærkbar reden blev bygget, men flere stykker var stadig spredt;
- Tildel en score på 4, når næsten alt materialet blev brugt til reden, men kun få stykker materiale forblev spredt eller var i nærheden af reden;
- Tildel en score på 5, når alt materiale blev brugt til at lave en identificerbar reden.
Bemærk: scorere bør tage pauser og revidere baseline fotos for at undgå træthed og bias under scoring procedure. Scorere bør ikke diskutere scores med hinanden for at undgå bias. Scorere bør diskutere scorer efter scoring er afsluttet, eller hvis yderligere diskussion er nødvendig for at ændre scores, som potentielt kan løse problemer med intraclass korrelationer (ICC). Intraclass korrelationer vil blive gennemført med de trin, der er anført i afsnit 4,2.
Figur 2: eksempel på scoring ved hjælp af kriterierne for strimlet papir, det foretrukne materiale. Fra venstre mod højre: 1 – det strikkede papir forblev uberørt; 2 – noget af papiret blev bygget ind i en rede, men de fleste af brikkerne forblev spredt; 3 – en mærkbar reden blev konstrueret, men flere stykker var stadig spredt; 4 – de fleste stykker blev brugt til reden, men nogle stykker blev spredt i nærheden af reden; 5 – alle brikker blev brugt til at lave reden. Bemærk, at på fotografierne vises dyrets tildelte nummer for at undgå afblinding. Farven på kortet er tilfældig. Forskerne bør tillade musen til at forblive i buret for at undgå overraskende musen, som potentielt kunne sprede reden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Indsamle og input scorer og formatere datafilen sådan, at hver målscorer scorer for hvert materiale er i separate kolonner.
Bemærk: Hvis du bruger supplerende fil 1, skal du være opmærksom på, at kodnings scriptet til denne analyse kræver gratis open source-software (f. eks. IRR -pakke i rstudio)22,23. Scriptet fjerner headere og variabler (dvs. den øverste række og dyre-id'er) til at gennemføre intraclass korrelation (ICC). Kør scriptet til at gennemføre en tovejs, aftale, gennemsnit måler ICC ved at fremhæve den afgrænsede del af koden og trykke på CTRL + ENTER eller kommando + ENTER. - Sammenlign ICC med eksisterende kriterier24,25,26. ICC-værdier over 0,80 svarer typisk til stærk Inter-rater pålidelighed, hvilket berettiger scorer til at blive gennemsnitligt på et givent tidspunkt (supplerende fil 2).
- Brug de samme ICC-kriterier for intra-rater pålidelighed, som kan være af interesse for dem, der foretager scoring for første gang.
Forsigtig: scorere skal score de samme fotograferede reder inden for en uge fra den første vurdering. Fortsæt med forsigtighed med gennemsnit data, når ICC er lav, da dette kan skævvride data eller producere null fund. Hvis ICC-værdier er lave, så (1) yderligere træning for scorere kan være påkrævet, (2) scorere kan være nødvendigt at diskutere deres ræsonnement for Nest scores, (3) en anden uafhængig korrekturlæser kan være nødvendig for at foretage en dom opfordring vedrørende scores, eller (4) intra-rater Det kan være nødvendigt at vurdere pålideligheden. Hvis intra-rater pålidelighed er dårlig, kan der være behov for yderligere træning eller en anden målscorer.
5. statistiske overvejelser
- Foretage statistiske analyser, hvor det er relevant. For data, der ikke overtræder normalitets antagelser, men bruger flere materialer til hver mus (dvs. en påvirkning inden for forsøgspersonerne), skal du bruge en blandet analyse af variansen (ANOVA).
- Hvis du bruger koder, der leveres som supplerende filer, skal du downloade yderligere add-on pakker, som er angivet i scriptet27,28,29,30.
- Hvis du udfører en blandet ANOVA ved hjælp af det medfølgende script, skal du køre scriptet for at konvertere alle Wide-format-datafiler til lang format (dvs. i stedet for variabler, der gentages på tværs af kolonner, konvertere cellerne til at gentage på tværs af rækker). Et eksempeldatafil er inkluderet i dette manuskript for at demonstrere, hvordan du konverterer en datafil fra bredformat til lang format.
- Udfør den blandede ANOVA, som angivet i scriptet. Bemærk, at hvis Mauchly's test af Sfæicitet er overtrådt, derefter implementere korrektionsfaktorer såsom drivhus-Geisser korrektion.
- Foretage de nødvendige posthoc-tests for at undersøge forskelle mellem faktorer med mere end 2 niveauer, som angivet i kodnings scriptet. I dette eksempel gennemføre Bonferroni posthoc tests for at sammenligne de forskellige typer af indlejrings materiale.
Bemærk: Hvis du kun bruger et nesting materiale, så ikke indarbejde en inden for faktor. Hvis indsamling af data på flere tidspunkter, dog indarbejde disse gentagne-foranstaltninger, som hvis niveauer af en inden for faktor.
Bemærk: i nogle tilfælde kan Wild type-mus have perfekte scorer og vil således udvise en lofts effekt, hvilket fører til en ikke-normal fordeling2. Overvej passende statistiske tests (f. eks. ikke-parametriske tests med alternative målinger af central tendens og dispersion), normaliserings metoder eller robuste tilgange (modellering af blandingseffekter for gentagne målinger) ved analyse af data.
Representative Results
Resultaterne fra de fire forskellige indlejrings materialer til dværg og ApoE E4-mus forklares som følger. Baseret på eksisterende kriterier, ICC viste en stærk aftale blandt alle tre kodere for alle fire indlejrings materialer (shredded papir ICC = 0,94; kvadrat ICC = 0,91; sengetøj ICC = 0,87; twist ICC = 0,87); Derfor blev de tre scorer gennemsnitligt sammen for at skabe en enkelt score for hvert leveret materiale. En 2 x 4 blandet ANOVA gav en signifikant hoved effekt af genotype, F(1, 19) = 31,30, p < 0,01, ηp2 = 0,62. På tværs af alle fire leverede materialer scorede dværg-mus højere på Nest-kvalitet (3,18 ± 0,20) sammenlignet med ApoE E4-mus (1,98 ± 0,16). Desuden gav den blandede ANOVA en signifikant hoved effekt af materiale, F(3, 57) = 57,48, p < 0,01, ηp2 = 0,75. Parvise sammenligninger med Bonferroni korrektion viste, at det strikkede papir (4,11 ± 0,20) blev vurderet signifikant højere (p < 0,05) i kvalitet end kvadratet (1,95 ± 0,21), strøelse (2,21 ± 0,21) eller twist (1,94 ± 0,20) materialer, uden forskelle set mellem pladsen, strøelse og twist materialer (alle p > 0,99). Der var ingen signifikant interaktion mellem genotype og materiale. Data er vist i figur 3.
Andre eksperimenter fra vores laboratorium har givet lignende resultater i tidlige debut modeller af Alzheimers sygdom. For eksempel, som påvist i figur 4, 5,5-måneders-gamle P301L rTg4510 (htau) mus bygget betydeligt dårligere reder ud af strimlet papir i forhold til deres alders matchede dværg modparter31. På samme måde byggede Dual J20 (Happ)/htau og single htau-mus fattigere reder ud af strimlet papir i forhold til deres dværg og camkiia-Promoter kun modparter, både på 3,5-og 7-måneders alderen32 (data ikke vist).
Figur 3: nominel kvalitet af reder fremstillet af forskellige materialer til dværg og ApoE E4-mus. En hoved effekt af genotype (* p < 0,01) viste, at dværg-mus konsekvent byggede bedre reder fremstillet af det strikkede papir, pressede bomulds firkanter, papir twist og blødt COB-strøelse sammenlignet med ApoE E4-mus. Den vigtigste effekt af materiale (* * p < 0,01) viste også, at reder konstrueret fra det strikkede papir blev bedømt højere i kvalitet sammenlignet med de tre andre materialer. Den strikkede papir havde den højeste Inter-rater pålidelighed foranstaltning som vurderet af ICC. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: shredded papir reder bygget af dværg og htau mus, on eller off zink vand. a) repræsentative reder konstrueret af 5,5-måneders gamle dværg og htau-mus, på kontrol (TAP) vand eller vand suppleret med 10 dele per million med zink (et biometal, der er impliceret i Alzheimers sygdom). Nests blev scoret på skalaen 1-5 ved hjælp af de angivne kriterier. Fra venstre mod højre: dværg + zink vand (4.54 ± 0.52); dværg + kontrol vand (4.15 ± 0,80); htau + kontrol vand (3,08 ± 0,64); htau + zink vand (2.46 ± 0,97). B) en genotype * vand interaktion viste, at htau-mus på zink vand blev konstrueret væsentligt dårligere i forhold til de andre grupper (*) Desuden viste simple effekter, at htau-mus på zink vand byggede dårligere reder end htau-mus på kontrol vand. Wildtype mus på kontrol vand og zink vand-byggede reder af højere, og lignende kvalitet, i forhold til deres htau modparter. Genoptrykt fra Journal af Alzheimers sygdom, vol 64, Craven, KM, Kochen WR, Hernandez CM, Flinn JM, zink forværrer Tau patologi i en Tau muse model, 671-630, Copyright (2018), med tilladelse fra IOS Press31. Publikationen er tilgængelig på IOS Press gennem http://dx.doi.org/10.3233/JAD-180151. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende fil 1: Supplerende kodning fil – indlejring. R venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2: ANNONCE undersøgelse indlejring scores. csv venligst klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Indlejring er en evolutionært vigtig gnaver adfærd og er blevet brugt til at vurdere aktiviteten af daglig levende og generelle trivsel i mus2. Den lethed at gennemføre testen, dens pålidelighed, og dens ansigt gyldighed gør indlejring et praktisk supplement til mange adfærdsmæssige tests såsom burroning, døgnrytme, og grooming. Men, som indlejring bliver mere almindeligt udnyttet i laboratoriet, de forskellige kombinationer til at gennemføre, kvantificere, og fortolke indlejring stigning. Som sådan er der behov for yderligere forskning for at udforske de bedste metodisk og praktisk forsvarlige procedurer for indlejring, således at validiteten og pålideligheden af analysen ikke ofres for omkostninger, tidspunkt for testning og andre procedurer, der reducerer test byrden .
Nest bygnings kvalitet er faktisk følsom over for den type strøelse, der leveres, samt genotype. Samlet set byggede dværg-mus betydeligt bedre reder sammenlignet med ApoE E4-mus uanset redematerialet; men både dværg og ApoE E4 mus bygge betydeligt højere kvalitet reder ud af strimlet papir i forhold til de tre andre nesting materialer. Andre undersøgelser giver underbyggende beviser vedrørende det strikkede papir: mus konstrueret mere komplekse reder ud af strikkede papirstrimler end med presset bomuld firkanter, væv, og Aspen sengetøj33. Desuden er reder konstrueret ud af strikkede papirstrimler blevet kvalitativt evalueret som mere "naturalistiske" end dem, der er lavet af andre materialer, som er karakteriseret ved formen af reden selv og højden af væggene omkring reden hulrum i for at danne en kuppel6,33. Som sådan, udvælgelse af korrekt materiale til denne analyse er afgørende for bedre at observere naturlige adfærd i et relativt kontrolleret miljø, dvs, at laboratoriet indstilling. Endnu vigtigere, selv om denne protokol vurderet indlejring én gang på 9 – 12 måneder, vi understreger, at nesting skal udføres i flere aldre. Enkelheden i denne protokol gør det muligt at gennemføres flere gange, ideelt før fremkomsten af underskud, der ledsager neurodegeneration. Gentagne målinger giver mulighed for at dokumentere den sandsynlige årsagssammenhæng med neurodegeneration i nedsat indlejrings evne.
Naturlige reden bygning har vist sig at afvige blandt mus af forskellige baggrunds stammer34, og som sådan, den samlede kvalitet og form af reden kan afvige ikke på grund af transgenet af interesse, men på grund af baggrundsstammen. For eksempel blev forfædrene til C57BL/6 mus betragtet som "Hole"-nestere, hvorimod forfædrene til BALB/C-mus blev betragtet som "Surface"-nestere35. Mus på C3H baggrund eller krydser med denne stamme, såsom hybrid C3H/he-C57BL/6 med E4 anvendes i Graybeal et al.9 anses også for at være fattige nestere; således bør forskerne kraftigt overveje at bruge Control mus på samme baggrund som Transgene mus, som generelt ville forbedre den direkte, kausative rolle af transgenet (s), snarere end baggrunden, i neurodegeneration og efterfølgende underskud i reden bygnings adfærd.
Nogle eksperimenter udnytter ofte en enkelt målscorer til kvalitativt at bedømme kompleksiteten af reden; men vi gør argumentet til at omfatte flere scorere, og endnu vigtigere, scorers blinde til eksperimentelle betingelser. Gennem denne tilgang udnyttede vi tre uafhængige, blinde scorere og en intraclass korrelation til at vurdere aftalen blandt de scorere, der med grunduddannelse gav høje intraclass korrelationer, som var tegn på høj Inter-rater pålidelighed og stærk aftale om Nest kvalitet. Desuden havde snesevis af reder bestående af strikkede papir og bomulds firkanter den højeste intraclass korrelationer, en indikation af stærkere aftale og større konsistens blandt de scorere. Den stærke aftale giver også berettigelse til gennemsnitlige de mange scores sammen, en strategi tilfældigt implementeret i adfærdsmæssige forskning. Selv om denne strategi kræver flere individer og formentlig mere tid til at score reder, det effektivt reducerer bias i kvalitative vurderinger såsom indlejring.
De nesting materialer, der anvendes i denne analyse, var omtrent lige i prisen, bortset fra det bløde COB-sengetøj. Kommerciel strøelse til indlejring kan være økonomisk ressourcestærke for nogle eksperimentanter; Men, Martin et al.15 Bemærk, at bomulds firkanter, sammenlignet med andre materialer såsom mønster papir, er et af de dyreste materialer til rådighed for køb. Dette kan skyldes let tilgængelighed, opbevaring og administration, men andre forskere kan vælge tilsvarende gyldige og pålidelige materialer, især når de udfordres af et stort antal dyr i et anlæg, antallet af indlejrings forsøg, tidsbegrænsninger for scorer reder, og høje bur omkostninger. Således, strimlet papir kan være en mere gennemførlig og passende løsning. Derudover kan dataopsamling for vores metode udføres med det samme (dvs. scoring personligt), selv om fotografier bør overvejes højt for at registrere, gemme og omkvantificere reder, hvis det ønskes med henblik på at vurdere Inter-og intra-rater pålidelighed på et senere tidspunkt. Som bemærket, vi kraftigt understrege inddragelsen af flere scorere for "test, re-test" praksis til at vurdere for aftale, da disse metodisk forsvarlige procedurer ofte overset.
Afslutningsvis mener vi, at metodologien og de statistiske overvejelser (dvs., intraclass korrelation) for denne analyse kan være af interesse for eksperimenter, der vurderer kvaliteten af levende, generelle trivsel, og aktiviteter i daglig lever i mus.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Kevin Quant, Mario Martinez og Edwin Portillo for at have scoret Nests, Rachel Barkey for at assistere i forberedelsen til optagelserne, og Stephen Lippi og Deborah Neely for korrekturlæsning af dette manuskript. Vi vil også gerne takke Institut for psykologi for at dække omkostningerne ved bure til dette eksperiment, og krasnow Institute Animal Facility pedeller for deres støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corncob bedding | Envigo | 7092 | 1/8 in bedding for cotton squares, shredded paper, and paper twist trials |
| Cotton Squares | Envigo | Iso-Blox | |
| Diamond Twists | Envigo | 7979C.CS | Paper twists used in protocol |
| Mouse - APOE4 e4 | Jackson Laboratories | #012307 | Homozygous APEO4 e4 mouse bred with hemizyous J20 mouse |
| Mouse - C57BL/6J | Jackson Laboratories | #000664 | Wildtype mouse for controls |
| Mouse - J20 | Jackson Laboratories | #006293 | Hemizygous mouse bred with the homozygous APOE e4 mouse to generate cross |
| Rstudio | R Core Team | V1.1.463 | Run with R version 3.5.3 (2019-03-11) -- "Great Truth". Note: additional R Packages are included in provided code and can be installed from CRAN |
| Soft Cob | Envigo | 7087C |
References
- Torres-Lista, V., Gimenez-Llorta, L. Impairment of nesting behavior in 3cTg-AD mice. Behavioural Brain Research. 247, 153-157 (2013).
- Deacon, R.
- Hess, E., Petrovich, S., Goodwin, E. Induction of Parental Behavior in Japanese Quail. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 90 (3), 244-251 (1976).
- Deacon, R. Hippocampal cytotoxic lesion effects on species-typical behaviors in mice. Behavioural Brain Research. 132, 203-213 (2002).
- Deacon, R. Effects of medial prefrontal cortex cytotoxic lesions in mice. Behavioural Brain Research. 139, 139-155 (2003).
- Gaskill, B. N., Karas, A. Z., Garner, J. P., Pritchett-Corning, K. R. Nest building as an indicator of health and welfare in laboratory mice. Journal of Visualized Experiments. (82), 51012 (2013).
- Mayeux, R., Stern, Y.
- Boggs, K. N., Kakalec, P. A., Smith, M. L., Howell, S. N., Flinn, J. M. Circadian wheel running behavior is altered in an APP/E4 mouse model of late onset Alzheimer's disease. Physiology and Behavior. 182, 137-142 (2017).
- Graybeal, J. J., et al. Human ApoE ε4 alters circadian rhythm activity, IL-1β, and GFAP in CRND8 mice. Journal of Alzheimer's Disease. 43 (3), 823-834 (2015).
- Leng, Y., Musiek, E. S., Hu, K., Cappuccio, F. P., Yaffe, K. Association between circadian rhythms and neurodegenerative diseases. The Lancet Neurology. 18 (3), 307-318 (2019).
- Zhou, L., Gao, Q., Nie, M., Gu, J. L., Hao, W., Wang, L., Cao, J. M. Degeneration and energy shortage in the suprachiasmatic nucleus underlie the circadian rhythm disturbance in ApoE-/- mice: Implications for Alzheimer's disease. Scientific Reports. 6, 36335 (2016).
- Deacon, R., et al. Age-dependent and -independent behavioral deficits in Tg2576 mice. Behavioural Brain Research. 189, 126-138 (2008).
- Filali, M., Lalonde, R., Riverst, S. Cognitive and non-cognitive behaviors in an APPswe/PS1 begenic model of Alzheimer's disease. Genes, Brain and Behavior. 8, 143-148 (2009).
- Robinson-Junker, A., Morin, A., Protchett-Corning, K., Gaskill, B. Sorting it out: Bedding particle size and nesting material processing method affects nest complexity. Laboratory Animals. 51 (2), 170-180 (2017).
- Martin, T., Balser, S., Young, G., Lewis, S. Cost and effectiveness of commercially available nesting substrates for Deer Mice (Peromyscus maniculatus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 55 (4), 412-418 (2016).
- Crossland, J. P., et al. Caring for Peromyscus spp. in research environments. Lab Animal. 43 (5), 162-166 (2014).
- Eisenberg, J. Studies on the Behavior of Peromyscus maniculatus gambelii and Peromyscus californicus parasiticus. Behaviour. 19 (3), 177-207 (1962).
- Joyner, C. P., Myrick, L. C., Crossland, J. P., Dawson, W. D. Deer mice as laboratory animals. ILAR Journal. 39 (4), 322-330 (1998).
- Neely, C., Lane, C., Torres, J., Flinn, J. The Effect of gentle handling on depressive-like behavior in adult male mice: Considerations for human and rodent interactions in the laboratory. Behavioural Neurology. , 2976014 (2018).
- Van Loo, P. L., Mol, J. A., Koolhaas, J. M., Van Zutphen, B. F., Baumans, V. Modulation of aggression in male mice: Influence of group size and cage size. Physiology & Behavior. 72 (5), 675-683 (2001).
- Kappel, S., Hawkins, P., Mendl, M. T. To group or not to group? Good practice for housing male laboratory mice. Animals. 7 (12), 88 (2017).
- Gamer, M., Lemon, J., Fellows, I., Singh, P. Irr: Various coefficients of interrater reliability and agreement. R package version 0.84. , Available from: http://CRAN.R-project.org/package=irr (2012).
- RStudio Team. RStudio: Integrated Development for R. RStudio, Inc. , Boston, MA. Available from: http://www.rstudio.com/ (2016).
- Cicchetti, D. V. Guidelines, criteria, and rules of thumb for evaluating normed and standardized assessment instruments in psychology. Psychological Assessment. 6 (4), 284-290 (1994).
- Hallgren, K. A. Computing inter-rater reliability for observational data: An overview and tutorial. Tutorials in Quantitative Methods for Psychology. 8 (1), 23-34 (2012).
- McGraw, K. O., Wong, S. P. Forming inferences about some intraclass correlation coefficients. Psychological Methods. 1 (1), 30-46 (1996).
- Ahlmann-Eltze, C. ggsignif: Significance Brackets for 'ggplot2'. R package version 0.5.0. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ggsignif (2019).
- Lawrence, M. A. ez: Easy Analysis and Visualization of Factorial Experiments. R package version 4.4-0. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ez (2016).
- Lenth, R. V. Least-Squares Means: The R Package lsmeans. Journal of Statistical Software. 69 (1), 1-33 (2016).
- Wickham, H. Ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , Springer-Verlag. New York. (2016).
- Craven, K. M., Kochen, W. R., Hernandez, C. M., Flinn, J. M. Zinc exacerbates tau pathology in a tau mouse model. Journal of Alzheimer's Disease. 64, 617-630 (2018).
- Lippi, S. L., Smith, M. L., Flinn, J. M. A novel hAPP/htau mouse model of Alzheimer's Disease: Inclusion of APP with tau exacerbates behavioral deficits and zinc administration heightens tangle pathology. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 382 (2018).
- Hess, S. E., et al. Home improvement: C57BL/6J mice given more naturalistic nesting materials build better nests. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 47 (6), 25-31 (2008).
- Jirkof, P. Burrowing and nest building behavior as indicators of well-being in mice. Journal of Neuroscience Methods. 234, 139-146 (2014).
- Van Oortmerssen, G. Biological significance, genetics and evolutionary origin of variability in behaviour within and between strains of mice (Mus musculus). A behavior genetic study. Behaviour. 38 (1), 1-92 (1971).
