Article de méthode

Transfection très efficace des macrophages primaires avec ARNm transcrit in vitro

DOI :

10.3791/60143

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9 novembre 2019

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1Institute for Medical Microbiology, Immunology and Hygiene, Faculty of Medicine and University Hospital Cologne, University of Cologne, 2Center for Molecular Medicine Cologne, 3Cologne Cluster of Excellence on Cellular Stress Responses in Aging-associated Diseases (CECAD), 4German Center for Infection Research (DZIF)

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les macrophages, en particulier les macrophages primaires, sont difficiles à transfect car ils se spécialisent dans la détection de molécules de non-auto-origine. Nous décrivons un protocole qui permet une transfection très efficace des macrophages primaires avec l'ARNm généré à partir de modèles d'ADN tels que les plasmides.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les macrophages sont des cellules phagocytiques spécialisées dans la détection de molécules non auto-d'origine. À cette fin, ils sont équipés d'un large éventail de récepteurs de reconnaissance de motifs (PrR). Malheureusement, cela rend également les macrophages particulièrement difficiles à transfect que le réactif transfection et les acides nucléiques transfectés sont souvent reconnus par les PrR comme non-auto. Par conséquent, la transfection entraîne souvent l'activation et la dégradation des acides nucléiques transfectés ou même le suicide des macrophages. Ici, nous décrivons un protocole qui permet la transfection très efficace des macrophages primaires de murine tels que les macrophages péritonéaux (PM) et les macrophages marrow-dérivés de moelle (BMDM) avec ARNm in vitro transcrits des modèles d'ADN tels que des plasmides. Avec ce protocole simple, les taux de transfection d'environ 50-65% pour PM et environ 85% pour BMDM sont réalisés sans cytotoxicité ou immunogénicité observée. Nous décrivons en détail la génération de l'ARNm pour la transfection des constructions d'ADN telles que les plasmides et la procédure de transfection.

Introduction

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Les macrophages sont des cellules phagocytiques qui se spécialisent dans la détection, l'ingestion et la dégradation des microbes, des cellules apoptotiques et des débris cellulaires. En outre, ils aident à orchestrer les réponses immunitaires en sécrétant des cytokines et des chemokines et en présentant des antigènes aux lymphocytes T et aux cellules B. Les macrophages jouent également un rôle important dans de nombreux autres processus, tels que la cicatrisation des plaies, l'athérosclérose, la tumorigénèse et l'obésité.

Pour être en mesure de détecter des molécules non autonomes telles que les modèles moléculaires associés aux agents pathogènes (PAMP) et les molécules hors de place telles que les modèles moléculaires associés aux dommages (DAMP), les macrophages sont équipés d'un large éventail de récepteurs de reconnaissance de modèles (PRR)1. Malheureusement, cela rend également les macrophages particulièrement difficiles à transfect2 que le réactif transfection3 et les acides nucléiques transfectés4,5,6,7sont souvent reconnus par les PrR comme non-auto. Pour cette raison, la transfection des macrophages utilisant des méthodes chimiques ou physiques8 entraîne généralement l'activation et la dégradation des macrophages des acides nucléiques transfectés ou même dans le suicide par macrophage par pyroptose, une forme de mort cellulaire lytique programmée déclenchée après la reconnaissance des PAMP/DAMP cytosoliques tels que l'ADN ou l'ARN étranger9. La transfection biologique des macrophages à l'aide de virus tels que les adénovirus ou les lentivirus comme vecteurs est souvent plus efficace, mais la construction de tels vecteurs viraux prend beaucoup de temps et nécessite un équipement de niveau 2 de biosécurité10,11.

Ainsi, bien que les macrophages soient l'objet de recherches intensives, l'analyse de leurs fonctions au niveau moléculaire est entravée parce que l'un des outils les plus importants de la biologie moléculaire, la transfection des constructions d'acide nucléique pour l'expression exogène de protéines, n'est guère applicable. Cela oblige souvent les chercheurs à utiliser des lignées cellulaires semblables à des macrophages plutôt que des macrophages de bonne foi. Les applications pour la transfection de construction d'acide nucléique incluent l'expression des versions mutées ou marquées de protéine, la surexpression d'une protéine spécifique, la réexpression de protéine dans un fond askouteux respectif et l'expression des protéines d'autres espèces (par exemple. , Cre recombinase ou guide RNA et Cas9 pour le gène ko ciblé).

Ici, nous décrivons un protocole qui permet la transfection très efficace des macrophages primaires (généralement difficiles à transfect), c'est-à-dire les macrophages péritonéaux de la murine (PM) et les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDM) avec l'ARNM généré à partir de modèles d'ADN tels que les plasmides. Fait important, l'ARNm transcrit in vitro généré à l'aide de ce protocole contient les nucléosides modifiés naturels 5-méthyl-CTP et pseudo-UTP qui réduisent l'immunogénicité et améliorent la stabilité4,6,7,12,13. En outre, les 5'-extrémités de l'ARNm transcrit in vitro sont déphosphorylées par la phosphatase antarctique pour empêcher la reconnaissance par le complexe RIG-I14,15. Ceci minimise la reconnaissance immunitaire innée de l'ARNm transcrit in vitro. Grâce à notre protocole facile à réaliser, les taux de transfection se siant entre 50 et 65 % (macrophages péritonéaux (PM)) et 85 % (BMDM) sont atteints alors que, ce qui est important, il n'y a pas de cytotoxicité ou d'immunogénicité observée. Nous décrivons en détail (i) comment l'ARNm immunologiquement réduit au silence pour la transfection peut être généré à partir de constructions d'ADN telles que les plasmides et (ii) la procédure de transfection elle-même.

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Protocole

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L'isolement des macrophages chez les souris a été effectué conformément à la loi allemande sur la protection des animaux, conformément au Comité d'éthique de l'Université de Cologne.

REMARQUE: Effectuez toutes les étapes en portant des gants. Effectuer toutes les étapes de transfection sous une hotte à débit laminaire pour éviter la contamination des cellules. Avant de travailler avec l'ARNm, nettoyez tous les instruments tels que les pipettes et chaque surface avec 70% d'éthanol et/ou un surfactant dégradant RNAse (Tableau des matériaux). Assurez-vous que tous les tubes de réaction sont exempts de RNAse et stériles. Utilisez uniquement de l'eau stérile et exempte de RNAase pour les dilutions. Utilisez exclusivement des pointes de pipette avec des filtres. Changez les conseils de pipette après chaque étape de pipetage.

1. Génération du modèle d'ADN

REMARQUE: Le modèle d'ADN pour la transcription in vitro d'ARNm utilisant ce protocole doit contenir une séquence promotrice de T7 pour permettre l'amarrage de la polymérase d'ARN. Si le plasmide contenant la séquence d'ADN de la protéine d'intérêt contient déjà une séquence promotrice T7 correctement orientée directement en amont de la séquence d'intérêt, la linéarisation du plasmide (voir l'étape 1.1.) doit être effectuée. Sinon, attachez un promoteur T7 à la séquence d'intérêt par réaction en chaîne de polymérase (PCR, voir étape 1.2.).

  1. La linéarisation des plasmides contenant des promoteurs T7
    1. Linéarisez les plasmides contenant déjà une séquence promotrice T7 correctement orientée par digestion avec une enzyme de restriction coupant en aval du codon d'arrêt de la séquence d'intérêt. Dans le cas contraire, la transcription ne se terminera pas correctement après la séquence d'intérêt.
      REMARQUE: Il est préférable d'utiliser des enzymes de restriction laissant des extrémités émoussées ou 5' surplombs.
    2. Confirmer la linéarisation complète du plasmide par l'électrophoresis de gel d'agarose de l'ADN plasmide non digéré contre digéré.
    3. Purifiez l'ADN plasmide linéaire avant d'être utilisé comme modèle d'ADN pour la transcription in vitro de l'ARNm à l'aide d'un kit de purification de l'ADN (Tableau des matériaux).
  2. Pièce jointe du promoteur T7 par PCR
    1. Utiliser une amorce avant contenant les composants suivants (dans l'ordre indiqué de 5' à 3') : environ 5 bp aléatoires en amont du promoteur (p. ex. GAAAT); la séquence promotrice T7 (TAATACGACTCACTATAG); deux G supplémentaires pour une efficacité de transcription accrue (GG); la partie spécifique à la séquence cible qui est homologue à la séquence plasmide entourant le codon de départ.
      REMARQUE: Il devrait être composé de: 3-6 bp en amont de la séquence KOZAK et codon de départ, la séquence KOZAK et codon de départ (généralement GCCACC ATG G), 12-18 bp en aval du codon de départ. Si la séquence d'intérêt ne contient pas déjà une séquence KOZAK ou un codon de démarrage, celles-ci peuvent être jointes à cette étape en les incluant simplement dans la séquence d'amorce.
    2. Calculez le tm de l'amorce avant seulement en tenant compte de la partie homologue de la séquence cible.
    3. Pour évaluer les diététistes/formation d'épingles à cheveux, utilisez toute la séquence d'amorce, qui peut facilement dépasser 50 pb.
    4. Utilisez une amorce inversée située quelque part en aval du codon d'arrêt.
      REMARQUE: Si la séquence d'intérêt ne contient pas déjà un codon d'arrêt, elle peut être jointe à cette étape en l'incluant simplement dans la séquence d'amorce.
    5. Utilisez les amorces avant et inverses pour effectuer un PCR à l'aide d'une polymérase haute fidélité avec relecture (Tableau des matériaux).
    6. Confirmer la génération d'un seul produit et de la taille d'amplicon par électrophorèse de gel d'agarose (par exemple, employer un gel d'agarose de 1% et le courant constant de 100 V).
    7. Purifiez le produit PCR avant d'être utilisé comme modèle d'ADN pour la transcription in vitro de l'ARNm à l'aide d'un kit de purification de l'ADN.

2. Génération d'ARNm

  1. Décongeler tous les composants du kit de transcription in vitro de l'ARNm (voir le Tableau des matériaux). Vortex pour 5 s et tourner vers le bas pour 2 s à 2.000 x g. Conserver sur la glace jusqu'à utilisation.
  2. Préparer le mélange de réaction pour la transcription in vitro de l'ARNm dans un tube microcentrifuge de 0,5 ml dans l'ordre suivant (volume total de 40 l) : 20 oL de mélange ARCA/NTP 10x (inclus dans le kit de transcription in vitro de l'ARNm); 0,25 ML de 5-méthyl-CTP (concentration finale (f.c.) est de 1,25 mM; 50 % du Total du CTP); 0,25 l de pseudo-UTP (f.c. est de 1,25 mM; 50 % de l'UTP total); X l de modèle d'ADN; 2 L de mélange de polymérase à ARN T7 (inclus dans le kit de transcription de l'ARNm in vitro); Y l de RNAse-free H2O.
    REMARQUE: X est un volume contenant au moins 1 g d'ADN. Par exemple, 1,6 L à partir d'une solution de stock de 625 ng/L. Y est le volume de rechange pour le volume total de 40 L.
  3. Vortex pour 5 s et tourner vers le bas pour 2 s à 2.000 x g. Incuber à 37 oC pendant 30 min à 400 tr/min sur un batteur thermique pour la transcription in vitro.
  4. Ensuite, ajoutez 2 L de DNase i directement dans le mélange de réaction pour le retrait de l'ADN du modèle. Vortex pour 5 s et tourner vers le bas pour 2 s à 2.000 x g.
  5. Incuber à 37 oC pendant 15 min à 400 tr/min sur un batteur thermique. Prendre un aliquot de 2 l pour le gel de contrôle (étape 3.3) et stocker à -80 oC.
  6. Pour les résidus poly(A), ajouter les composants suivants directement dans le mélange de réaction précédent (à un volume final de 50 L) : 5 L de 10x poly(A) tampon de réaction en polymérase et 5 L de polymérase poly (A) (tous deux inclus dans le kit de transcription de l'ARNm in vitro). Vortex pour 5 s et tourner vers le bas pour 2 s à 2.000 x g.
  7. Incuber le mélange à 37 oC pendant 30 min à 400 tr/min sur un thermomélangeur. Prendre un aliquot de 2 l pour le gel de contrôle (étape 3.3) et stocker à -80 oC.
  8. Pour la déphosphorylation des 5 extrémités de l'ARNm, ajouter les composants suivants directement dans le mélange de réaction précédent (à un volume final de 60 L) : 3 'L de H2O sans RNAse; 6 L de 10x tampon de réaction à la phosphatase antarctique; 3 L de phosphatase antarctique (15 unités pour un volume de réaction de 60 L). Vortex pour 5 s et tourner vers le bas pour 2 s à 2.000 x g.
  9. Incuber le mélange à 37 oC pendant 30 min à 400 tr/min sur un batteur thermique.
  10. Phosphatase antarctique inactive par incubation à 80 oC pendant 2 min.
    REMARQUE: Idéalement, utilisez un mélangeur thermique séparé, n'attendez pas que le premier mélangeur atteigne la température désirée.

3. Purification de l'ARNm

  1. Purifier l'ARNm transcrit in vitro à l'aide d'un kit de purification de l'ARN dédié (Tableau des matériaux).
    1. Ajouter X 'L de la solution d'élution au mélange de réaction de l'ARNm à partir de l'étape 2.10. Mélanger en inversant 5 fois. Ajouter 300 l de concentré de solution de liaison. Mélanger par pipetting douce 5 fois.
      REMARQUE: X est le volume de rechange à un volume total de 100 L. Par exemple, ajoutez une solution d'élution de 40 L au mélange de réaction de 60 l à ARNm.
    2. Ajouter 100 l'éthanol sans RNAase. Mélanger par pipetting douce 5 fois.
    3. Placez une colonne de filtre dans l'un des tubes de collecte fournis. Transférer le mélange de réaction de l'ARNm doucement sur le centre du filtre sans toucher le filtre. Centrifugeuse à 15 000 x g pendant 1 min à température ambiante (RT).
    4. Soulevez soigneusement la colonne de filtre et jetez le flux dans le tube de collecte. Placez la colonne de filtre dans le même tube de collecte.
    5. Ajouter 500 l de solution de lavage (n'oubliez pas d'ajouter 20 ml d'éthanol sans RNAase avant d'utiliser la solution de lavage pour la première fois).
    6. Centrifugeuse à 15 000 x g pendant 1 min à RT. Répétez les étapes 3.1.4-3.1.6 pour laver une fois de plus.
    7. Centrifugeuse à pleine vitesse (17 900 x g)pendant 1 min à RT pour enlever tout liquide résiduel de la colonne de filtre. Prenez soigneusement la colonne de filtre du tube de collecte. Placez la colonne de filtre dans un nouveau tube de collecte.
    8. Ajouter 50 ll de tampon d'élution sur le centre du filtre sans toucher le filtre. Incuber à 65 oC pendant 10 min sur un batteur thermique.
    9. Centrifugeuse à 15 000 x g pendant 1 min à RT. Retirez la colonne de filtre et jetez-la.
  2. Mesurer la concentration et la pureté de l'ARNm éluté, par exemple, en utilisant un spectrophotomètre de microvolume pour mesurer l'absorption à 260 et 280 nm.
    REMARQUE: Un rapport A260/A280 de 1,8-2.1 est indicatif de l'ARNm fortement purifié.
  3. Vérifier la présence d'un seul produit, la longueur correcte de la transcription et le résidu poly(A) en analysant les aliquots des étapes 2.5 et 2.7 par électrophorèse de gel d'agarose dans des conditions dénaturantes (par exemple, employer un gel d'agarose de 1,2% contenant 20 mM 3-(N-morpholino) acide propanesulfonic [MOPS], 5 mM d'acétate de sodium, 1 mM EDTA et 20 % de formaldéhyde et fonctionne en 20 mMo MOPS, 5 mM d'acétate de sodium, 1 mM EDTA et 0,74 % de formaldéhyde à 100 V courant constant).
  4. Conserver l'ARNm purifié dans le tube d'élution à -80 oC jusqu'à ce que la transfection. Si vous n'utilisez que de faibles quantités de l'ARNm pour la transfection, puis aliquot l'ARNm pour éviter les cycles répétés de gel-dégel.
    REMARQUE : l'ARNm peut être stocké à -80 oC pendant environ 1 an.

4. Préparation macrophage

  1. Euthanasiez les souris C57/BL6 (utiliser des souris du même sexe et de 6 à 24 semaines) par luxation cervicale.
    REMARQUE: Les mêmes souris peuvent être utilisées pour l'isolement des particules (étape 4.2) et de la génération de BMDM (étapes 4.3 et 4.4). Pour l'isolement de PM utiliser au moins deux souris. Si seulement BMDM doivent être générés une souris est généralement suffisant.
  2. L'enrichissement immunomagnétique des macrophages péritonéaux.
    1. Remplir une seringue de 10 ml d'une canule de 0,9 x 40 mm avec 8 ml de saline tamponnée de phosphate à froid (PBS) et 2 ml d'air. Rincer la cavité péritonéale avec du PBS. L'air formera une bulle qui minimise les fuites du PBS.
    2. Recueillir rapidement le lavage péritonéal avec la même seringue et le transférer dans un tube de centrifugation conique de 50 ml. Combinez les cellules péritonéales de plusieurs souris si nécessaire. Maintenir la suspension cellulaire sur la glace.
    3. Suspension de cellules centrifugeuses à 650 x g pendant 5 min à 4 oC. Jeter le supernatant et resuspendre la pastille cellulaire dans 5 ml de 0,2 % NaCl pour 30 s pour lyse les globules rouges.
    4. Ajouter 5 mL de 1,6 % de NaCl à un volume total de 10 ml pour reconstituer des conditions isotoniques. Centrifugeuse à 650 x g pendant 5 min à 4 oC.
    5. Jeter le supernatant et resuspendre le granule cellulaire dans 97,5 l de tampon de tri des cellules magnétiques (MCS) (2 mM d'acide éthylènediaminetetraacetic [EDTA], 5% d'albumine de sérum bovin [BSA] en PBS) par 1 lavage péritonéal (par exemple, si trois souris ont été rincées, resuspend en 292.5 L ).
    6. Ajouter 2,5 L de perles paramagnetiques conjuguées à un anticorps spécifique CD11b par 97,5 l de suspension cellulaire (p. ex., ajouter 7,5 l à 292,5 l).
    7. Incuber sur glace pendant 15 min à 150 tr/min sur un shaker orbital.
    8. Suspension de cellule centrifugeà 650 x g pendant 5 min à 4 oC, jetez le supernatant et suspendez la pastille cellulaire dans 1 ml de tampon MCS.
    9. Ajouter 4 mL de tampon MCS à un volume total de 5 ml et laver les cellules en pipetting doucement de haut en bas trois fois.
    10. Répétez les étapes 4.2.8 et 4.2.9 deux fois de plus pour un total de trois étapes de lavage.
    11. Pendant les étapes de lavage placer une colonne LS dans un séparateur de cellules magnétiques (voir Tableau des matériaux). Rincer la colonne avec 3 ml de tampon MCS.
      REMARQUE: Évitez les bulles car celles-ci peuvent obstruer la colonne.
    12. Resuspendre la pastille cellulaire dans 1 ml de tampon MCS. Ajouter 3 mL de tampon MCS à un volume total de 4 ml, mélanger en pipetting de haut en bas trois fois.
    13. Transférer les 4 ml de suspension cellulaire sur la colonne LS rincée.
      REMARQUE: Encore une fois, éviter les bulles car celles-ci peuvent obstruer la colonne.
    14. Attendez que le réservoir de la colonne soit complètement vide. N'ajoutez pas de liquide supplémentaire jusqu'à ce que la colonne cesse de couler.
    15. Ajouter 3 mL de tampon MCS sur la colonne. Ensuite, attendez que le réservoir de la colonne soit complètement vide. Répétez l'étape 4.2.15 deux fois de plus.
    16. Placer la colonne LS dans un tube de centrifugation conique de 15 ml. Appliquer 5 ml de tampon MCS sur la colonne. Attendez jusqu'à ce que 2 ml de liquide soit passé à travers la colonne, puis utilisez le piston pour pousser doucement la fraction restante dans le tube.
    17. Suspension de cellule centrifugeà 650 x g pendant 5 min à 4 oC et jetez le supernatant.
    18. Resuspendre la pastille cellulaire dans 1 ml de DMEM complétée par 10% de sérum fœtal de veau inactivé par la chaleur (FCS) (DMEM-FCS).
    19. Déterminez le nombre de cellules viables en comptant dans la solution bleu trypan dans une chambre de comptage Neubauer et les cellules de semencedans dMEM-FCS dans les plaques de culture.
      REMARQUE: Seed PM à une densité de 100 000 cellules/puits dans une plaque de microtimètre à fond plat. N'utilisez pas de plaques traitées à la culture tissulaire, car les particules ne peuvent pas être détachées de celles-ci. Utilisez plutôt des plaques non traitées.
  3. Génération de BMDM
    1. Enlever la peau et les muscles des pattes postérieures à l'aide d'une paire de ciseaux. Laver chaque jambe par une submersion courte à 70 % d'éthanol.
    2. Détachez les jambes et ouvrez les deux extrémités du fémur et du tibia en coupant avec des ciseaux.
    3. Remplissez une seringue de 5 ml remplie d'une canule de 0,6 mm x 30 mm avec 5 ml d'endotoxine très faible (VLE) RPMI 1640 et rincer la moelle osseuse des os ouverts dans un plat de culture.
    4. Combinez la moelle osseuse de plusieurs souris si nécessaire en répétant les étapes 4.3.1-4.3.3.3. Transférer la moelle osseuse dans un tube de centrifugation conique de 50 ml.
    5. Centrifuger la suspension de la moelle osseuse à 650 x g pendant 5 min à 4 oC et jeter le supernatant.
    6. Resuspendre la pastille cellulaire dans 5 ml de tampon de lyse des globules rouges (8,3 % NH4Cl, 0,1 M Tris) et couver pendant 5 min à RT pour lyser les globules rouges.
    7. Centrifuger la suspension cellulaire à 650 x g à 4 oC pendant 5 min et jeter le supernatant.
    8. Resuspendre la pastille cellulaire dans 1 ml de VLE RPMI 1640 moyen complété par 10% FCS, 1% pénicilline / streptomycine, 1% HEPES, 1% de pyruvate de sodium et 10 ng/mL recombinant macrophage macrophage facteur de stimulation de la colonie (M-CSF) (RPMI).
    9. Ajouter 4 ml deRPMI à un volume total de 5 ml.
    10. Préparer 5 plats Petri non traités de 92 mm x 16 mm avec des cames (voir le tableau des matériaux) par souris en pipetting 7 mL de RPMI- milieu dans chaque plat.
    11. Transférer le 1 ml de solution cellulaire aux 5 plats de culture préparés et couver à 37 oC et 5 % de CO2.
    12. Après 4 jours, nourrir les cellules en ajoutant 4 ml deRPMI. Après 6-7 jours, les cellules de moelle sont entièrement différenciées en BMDM.
  4. Récolte de BMDM
    1. Retirez complètement le support des plats de culture. Ajouter 5 ml d'EDTA chaud de 0,2 mM en PBS à chaque plat.
    2. Gratter délicatement toute la plaque avec un grattoir cellulaire pour détacher le BMDM. Mélanger les suspensions cellulaires dans un tube de centrifugation conique de 50 ml.
    3. Rincer à nouveau les 5 plats. Utilisez le même volume de 5 ml d'EDTA chaud de 0,2 mM en PBS pour les 5 plats. Combinez cette suspension cellulaire avec celle de l'étape précédente.
    4. Centrifuger la suspension cellulaire à 650 x g pendant 5 min à 4 oC et jeter le supernatant.
    5. Resuspendre la pastille cellulaire dans 1 ml de VLE RPMI 1640 moyen complété par 10% FCS, 1% HEPES, 1% de pyruvate de sodium et 10 ng/mL recombinant M-CSF, mais pas d'antibiotiques (RPMI.
    6. Déterminez le nombre de cellules viables en comptant dans la solution bleu trypan dans une chambre de comptage Neubauer et les cellules de semences dans RPMI- dans les plaques de culture.
      REMARQUE: Graine BMDM à une densité de 50.000 cellules/puits maximum dans une plaque de microtiter à fond plat. N'utilisez pas de plaques traitées par la culture tissulaire, car le BMDM peut difficilement être détaché de ceux-ci. Utilisez plutôt des plaques non traitées.

5. Transfection des macrophages avec ARNm

  1. Calculer le volume requis de tampon de transfection de l'ARNm.
    REMARQUE: Le volume de tampon de transfection d'ARNm requis dépend de la taille du puits : utiliser 200 l pour la transfection dans une plaque de 6 puits, 100 l dans une plaque de 12 puits et ainsi de suite. Toujours ajouter un peu de volume de rechange en raison de la perte de pipetting (mais pas trop, pour éviter la dilution indue de l'ARNm). Par exemple, utilisez 450 L au lieu de 4 x 100 l et 400 l pour transfect dans 4 puits d'une plaque de 12 puits.
  2. Calculer le volume requis de réactif de transfection de l'ARNm. Le réactif de transfection d'ARNm est ajouté à un rapport de 1:50. Par exemple, 9 L de réactif de transfection d'ARNm sont nécessaires pour un volume final de 450 L.
  3. Calculer la quantité totale d'ARNm requise. Au moins 100 ng pour 100 000 macrophages sont nécessaires pour une transfection efficace, 200 ng fonctionne encore mieux (par exemple, 800 ng ARNm pour transfect 400 000 macrophages).
    1. Multipliez la quantité calculée d'ARNm requise avec le nombre total de puits qui doivent être transfectés (p. ex., 4 puits avec 400 000 macrophages chacun : 4 x 800 ng - 3 200 ng ARNm est requis au total pour tous les puits). Par exemple, si votre stock d'ARNm est de 426,8 ng/L, 7,49 L sont nécessaires pour une transfection optimale de 4 puits avec 400 000 macrophages chacun.
  4. Ajoutez le volume calculé de tampon de transfection de l'ARNm (étape 5.1.) moins les volumes pour le réactif de transfection de l'ARNm (étape 5.2) et l'ARNm (étape 5.3) à un tube de réaction. Par exemple, 450 l - 9 l - 7,49 'L ' 433,51 'L.
  5. Décongeler le stock d'ARNm et le mélanger en retournant doucement du tube d'élution. Ajouter le volume calculé de l'ARNm (étape 5,3) au tube de réaction avec tampon de réaction de l'ARNm (dans l'exemple présenté ci-dessus : 7,49 L en 433,51 l).
  6. Vortex pour 5 s et tourner vers le bas pour 2 s à 2.000 x g.
  7. Vortex le réactif de transfection de l'ARNm pour 5 s et tourner vers le bas pour 2 s à 2 000 x g.
  8. Ajouter le volume calculé de réactif de transfection de l'ARNm (étape 5.2) au tube de réaction contenant le tampon de transfection de l'ARNm et l'ARNm (dans l'exemple présenté ci-dessus : 9 L de réactif de transfection de l'ARNm).
  9. Vortex le mélange de transfection pour 5 s et tourner vers le bas pour 2 s à 2.000 x g.
  10. Incuber pendant 15 min à RT.
  11. Pendant ce temps, remplacez le milieu de culture des macrophages par un milieu de culture frais et chaud (voir les étapes 4.2.18. et 4.4.5).
  12. Après l'étape d'incubation 5.10, ajouter le mélange de transfection aux puits contenant les macrophages dans un volume approprié à la taille du puits (voir l'étape 5.1). Ajouter le mélange de transfection dans le sens de la chute dans un cercle de l'extérieur au milieu du puits.
  13. Basculer doucement la plaque, d'abord en verticale, puis dans une direction horizontale pour assurer une distribution uniforme du mélange de transfection dans le puits. Ensuite, incuber à 37 oC et 5 % de CO2. La synthèse de la protéine codée par l'ARNm transfecté commencera peu de temps après la transfection. Pour de meilleurs résultats, incuber pendant au moins 6 h.
  14. Après l'incubation, analyser l'efficacité de la transfection par microscopie (immuno)fluorescence, cytométrie du débit ou immunoblot16, ou utiliser les macrophages transfectés pour l'expérience de choix.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous avons utilisé avec succès ce protocole pour générer un codage de l'ARNm pour les variantes NEMO et IKKMD étiquetées FLAG pour la transfection des macrophages primaires16. Les plasmides codants pour FLAG-tagged wild-type (NEMOWT) et C54/347A mutant NEMO (NEMOC54/374A) (voir le tableau des matériaux) contiennent déjà un promoteur T7 dans la bonne orientation (Figure 1A). Ainsi,...

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Discussion

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Ici nous présentons un protocole pour la transfection très efficace des macrophages primaires habituellement difficiles-à-transfect avec l'ARNm transcrit in vitro. Fait important, la transfection des macrophages utilisant ce protocole n'induit pas la mort cellulaire ou n'active pas la signalisation proinflammatoire indiquant que ni le réactif transfection ni l'ARNm transfecté ne sont reconnus comme non-auto.

La qualité de l'ARNm est d'une importance capitale pour la transfection réussie des ma...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
5-méthyl-CTP (100 mM)Jena BiosienceNU-1138Sstocké à -20 ° ; C
Phosphatase antarctiqueNew England BioLabsM0289stockée à -20 ° ; C
Tampon de réaction de la phosphatase de l’Antarctique (10x)New England BioLabsB0289stocké à -20 ° ; C
anti-NEMO/IKK&gamma ;InvitrogenMA1-41046stocké à -20 ° ; C
anti-&bêta ;-actineSigma-AldrichA2228stocké à -20 ° ; C
Boîtes de Pétri 92,16 mm avec camesSarstedt821,473stockées à RT
CD11b Microbilles souris et humainesMiltenyi Biotec130-049-601stockées à 4 ° ; C
Cre recombinase + T7-Promotorforward primer Sigma-Aldrich5&prime ;-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGGCAGCCGCCACCATGTCC
AATTTACTGACCGTAC-3´ ;, stocké à -20 ° ; C
Cre recombinase + T7-Promotorreverse primer Sigma-Aldrich5&prime ;-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG
C-3&prime ;, stocké à -20 ° ;
Kit de purification de l’ADN C : Kit de purification PCR QIAquickQiagen28104stocké chez RT
eGFP + amorce avant T7-PromotorSigma-Aldrich5´ ;-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGATCCATCGCCACCATG
AGCAAGG-3&aigu ;, stocké à -20 ° ; C
eGFP + T7-Promotor amorce inverseSigma-Aldrich5´ ;-TGGTATGGCTGATTA
TGATCTAGAGTCG-3´ ;, stocké à -20 ° ; C
Tampon Fast Digest (10x)Thermo ScientificB64stocké à -20 ° ; C
FastDigest XbaIThermo ScientificFD0684stocké à -20 ° ; C
Polymérase haute fidélité avec relecture : Q5 High-Fidelity DNA-PolymeraseNew England Biolabs IncM0491Sstockée à -20 ° ; C
IKK&beta ; + T7-Promotorforward primer Sigma-Aldrich5&prime ;-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGTTGATCTACCATGGACTACA
AAGACG-3&prime ;, stocké à -20 ° ; C
IKK&beta ; + T7-Promotorreverse primer Sigma-Aldrich5&prime ;-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3&prime ;, stocké à -20 ° ; C
In vitro kit de transcription d’ARNm : Kit d’ARNm HiScribe T7 ARCA (avec queue polyA)New England BioLabsE2060stocké à -20 ° ; C
LS ColonnesMiltenyi Biotec130-042-401stocké chez RT
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303stocké chez RT
tampon de transfection d’ARNm et réactif : jetMESSENGERPolyplus transfection409-0001DEstocké à 4 ° ; C
Mutant IKK&beta ; Plasmide IKK-2S177/181EAddgene11105stocké à -20 ° ;
Plasmide NEMOC54/347AAddgene27268stocké à -20 ° ; C
plasmide pEGFP-N3Addgene62043stocké à -20 ° ; C
poly(I :C)Calbiochem528906stocké à -20 ° ;
C pPGK-CreF.T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, Nouveaux variants de la recombinase Cre inductible : Un nouveau mutant de la protéine de fusion Cre-PR présente une sensibilité accrue et une gamme élargie d’inductibilité. Acides nucléiques Res. 29, 47e (2001). stocké à -20 ° ; C
pseudo-UTP (100 mM)Biosience d’IénaNU-1139Sstockée à -20 ° ; C
QuadroMACS SéparateurMiltenyi Biotec130-090-976stocké à
Rat-anti-souris Anticorps CD11b, BioLegend conjugué APC101212stocké à 4 ° ; C
Anticorps F4/80 anti-souris, eBioscience12-4801-82conjugué au PE, stocké à 4 ° ; C
M-CSF recombinantPeprotech315-02stocké à -20 ° ;
Kit de purification de l’ARN C : Kit de nettoyage de transcription MEGAclearThermoFisher ScientificAM1908stocké à 4 ° ;
Tensioactif dégradant l’ARNc : RnaseZAPSigma-AldrichR2020stocké à RT
LPS ultra-pur d’E.coli O111 :B4Invivogenstocké à -20 ° ; C
Plasmide IKK&beta ; de type sauvageAddgene11103stocké à -20 ° ; C
Plasmide NEMO de type sauvageAddgene27268stocké à -20 ° ; L
Plasmide RT

Références

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  1. Ley, K., Pramod, A. B., Croft, M., Ravichandran, K. S., Ting, J. P. How Mouse Macrophages Sense What Is Going On. Frontiers in Immunology. 7 (204), (2016).
  2. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biolology. 531, 123-143 (2009).
  3. Guo, X., et al. Transfection reagent Lipofectamine triggers type I interferon signaling activation in macrophages. Immunology and cell biology. 97 (1), 92-96 (2019).
  4. Kariko, K., Weissman, D. Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 10 (5), 523-532 (2007).
  5. Van De Parre, T. J., Martinet, W., Schrijvers, D. M., Herman, A. G., De Meyer, G. R. mRNA but not plasmid DNA is efficiently transfected in murine J774A.1 macrophages. Biochemical and biophysical research communications. 327 (1), 356-360 (2005).
  6. Uchida, S., Kataoka, K., Itaka, K. Screening of mRNA Chemical Modification to Maximize Protein Expression with Reduced Immunogenicity. Pharmaceutics. 7 (3), 137-151 (2015).
  7. Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
  8. Khantakova, J. N., et al. Transfection of bone marrow derived cells with immunoregulatory proteins. Cytokine. 108, 82-88 (2018).
  9. Franz, K. M., Kagan, J. C. Innate Immune Receptors as Competitive Determinants of Cell Fate. Molecular Cell. 66 (6), 750-760 (2017).
  10. Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 25 (6), 1171-1176 (2015).
  11. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  12. Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
  13. Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).
  14. Hornung, V., et al. 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. Science. 314 (5801), 994-997 (2006).
  15. Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates. Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).
  16. Herb, M., et al. Mitochondrial reactive oxygen species enable proinflammatory signaling through disulfide linkage of NEMO. Science Signaling. 12 (568), (2019).
  17. Schmidt-Supprian, M., et al. NEMO/IKK gamma-deficient mice model incontinentia pigmenti. Molecular Cell. 5 (6), 981-992 (2000).
  18. Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).
  19. Oh, S., Kessler, J. A. Design, Assembly, Production, and Transfection of Synthetic Modified mRNA. Methods. 133, San Diego, CA. 29-43 (2018).

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Mots-clés

Transfection de macrophages primairesmacrophages d riv s de la moelle osseusemacrophages p riton auxprotocole de transfection d ARNmajout de queue polyAcytom trie en fluxmicroscopie fluorescencelectrophor se sur gel d agaroseanalyse de l expression prot ique

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