Isolement des populations neuronales spécifiques de Roundworm Caenorhabditis elegans

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour l'isolement simple des groupes spécifiques des cellules neuronales vivantes exprimant la protéine fluorescente verte des lignes transgéniques de Caenorhabditis elegans. Cette méthode permet une variété d'études ex vivo axées sur des neurones spécifiques et a la capacité d'isoler les cellules pour la culture à court terme.

Abstract

Pendant le processus de vieillissement, beaucoup de cellules accumulent des niveaux élevés de dommages menant au dysfonctionnement cellulaire, qui sous-tend beaucoup de conditions gériatriques et pathologiques. Les neurones post-mitotiques représentent un type de cellule majeur affecté par le vieillissement. Bien que de multiples modèles mammifères du vieillissement neuronal existent, ils sont difficiles et coûteux à établir. Le ver rond Caenorhabditis elegans est un modèle puissant pour étudier le vieillissement neuronal, car ces animaux ont une courte durée de vie, une boîte à outils génétique robuste disponible, et un système nerveux bien catalogué. La méthode présentée ici permet un isolement sans faille de cellules spécifiques basées sur l'expression d'une protéine fluorescente verte transgénique (GFP). Les lignées animales transgéniques exprimant le PFG sous des promoteurs distincts, spécifiques au type cellulaire, sont digérées pour enlever la cuticule externe et délicatement perturbées mécaniquement pour produire de la boue contenant divers types de cellules. Les cellules d'intérêt sont ensuite séparées des cellules non ciblées par le tri des cellules activées par la fluorescence, ou par des perles magnétiques couplées à l'anti-GFP. Les cellules isolées peuvent ensuite être cultivées pour un temps limité ou immédiatement utilisées pour des analyses ex vivo spécifiques à des cellules telles que l'analyse transcriptionnelle par PCR quantitatif en temps réel. Ainsi, ce protocole permet une analyse rapide et robuste des réponses spécifiques aux cellules au sein de différentes populations neuronales chez C. elegans.

Introduction

Au cours des dernières décennies, l'organisme modèle métazoaire Caenorhabditis elegans a été un atout énorme dans l'étude des neurones, des circuits neuronaux et de son rôle dans les réponses physiologiques et comportementales, et les neurodégénératifs associés au vieillissement Maladies. Une caractéristique unique de C. elegans est que les animaux sont transparents, permettant à la lignée de toutes les cellules somatiques adultes d'être cartographié¹. C. elegans abrite également une quantité gérable de neurones, conduisant à la morphologie et la connectivité du système nerveux étant bien compris²

Protocol

1. Préparation et collecte de vers âgés pour l'isolement cellulaire

REMARQUE: Expliqué ci-dessous est l'isolement des neurones cholinergiques de la souche transgénique unc-17::GFP (OH13083) obtenu à partir du Caenorhabditis Genetics Center (CGC) dépôt de souches à l'Université du Minnesota. Il est impératif de maintenir des conditions stériles pour prévenir la contamination par les champignons ou les bactéries.

1. Préparer et synchroniser les vers par la méthode de blanchiment décrite par T. Stiernagle¹⁶. Pour les expériences sur le vieillissement, les vers de plaque sur les plaques du milieu....

Results

Le protocole décrit ici permet l'isolement spécifique des neurones cholinergiques unc-17::GFP-positifs du ver rond C. elegans pour des études ex vivo ultérieures telles que le profilage d'expression génique de type de cellule-spécifique et la culture à court terme pour les mesures d'électrophysiologie de patch-clamp.

La figure 1 montre des neurones cholinergiques non-17: g.......

Discussion

Le ver rond C. elegans est un modèle bien établi et puissant pour étudier la santé neuronale et la maladie². Avec de nombreux outils génétiques pour manipuler ces animaux et une quantité gérable de différents types de neurones, beaucoup de données peuvent être recueillies avec une quantité relativement faible de matériel. Ici, nous dénoncons une méthode optimisée pour isoler les neurones distincts des animaux entiers. En perturbant les protéines cuticules externes du ver, une boue de diff.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plaque à 6 puits	Fisher Scientific	12-556-004
Gélose, biologie moléculaire Grade	VWR	A0930
CaCl2	Sigma	C5670
Chloroform	Sigma	496189
Contess Compteur de cellules automatisé	Invitrogen	Z359629
DTT	USBiologique	D8070
Ethanol	Decon Labs	2701
FBS	Omega Scientific	FB-02
Fluorodésoxyuridine	Sigma	F0503
HEPES	Sigma	H3375
Isopropanol	VWR	BDH1133
KCl	Amresco	O395
KH2PO4	USBiologique	P5110
Kimwipes	Kimberly-Clark Professionals	7552
Leibovitz’s L-15 Medium	Gibco	21083027
MgCl2	Sigma	M8266
MgSO4	USBiologique	M2090
Na2HPO4· ; 7H2O	USBiological	S5199
NaCl	VWR	X190
NaOCl (Bleach)	Clorox
NaOH	Amresco	O583
Penicillin-Streptomicen	Fisher Scientific	15140122
Peptone Y	USBiological	P3306
Pronase E	Sigma	7433	mélange de protéases de Streptomyces griseus
SDS	Amresco	O227
SMT1-FLQC stéréomicroscope à fluorescence	Tritech Research
Sucrose	USBiological	S8010
SuperScript IV Kit de synthèse en une étape	ThermoFisher	12594025
TRIzol	Invitrogen	15596026	solution d’isothiocyanate de phénol et de guanidine
Trypan Blue Stain	Invitrogen	T10Z82
&alpha ;-GFP billes magnétiques	MBL	D153-11