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Article de méthode

Isolement des leucocytes du lait maternel humain pour une utilisation dans une essai de phagocytose cellulaire dépendante des anticorps des cibles de VIH

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DOI :

10.3791/60149

⸱

6 septembre 2019

 , 
1Division of Infectious Diseases, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Dans cet article

Résumé

Le lait maternel transmet le virus de l'immunodéficience humaine (VIH), bien que seulement 15 % des nourrissons allaités par des mères infectées par le VIH soient infectés. Les nourrissons allaités ingèrent 105à 108 leucocytes maternels par jour, bien que ces cellules soient sous-étudiées. Ici nous décrivons l'isolement des leucocytes de lait maternel et une analyse de leur capacité phagocytic.

Résumé

Même en l'absence de médicaments antirétroviraux, seulement 15 % des nourrissons allaités par des mères infectées par le VIH sont infectés, ce qui suggère un fort effet protecteur du lait maternel (BM). À moins que l'accès à de l'eau potable et à des préparations pour nourrissons appropriées ne soit fiable, l'OMS ne recommande pas l'arrêt de l'allaitement maternel pour les mères infectées par le VIH. De nombreux facteurs fonctionnent probablement en tandem pour réduire la transmission de La BM. Les nourrissons allaités ingèrent par jour 105à 108 leucocytes maternels, bien que ce qui reste largement incertain, c'est la contribution de ces cellules aux qualités antivirales de la BM. Actuellement, nous avons cherché à isoler les cellules de la BM humaine afin de mesurer phagocytose cellulaire dépendante des anticorps (ADCP), l'une des réponses immunitaires innées les plus essentielles et les plus répandues, par les phagocytes BM contre les cibles du VIH. Des cellules ont été isolées de 5 échantillons humains de BM obtenus à divers stades de lactation. L'isolement a été effectué par centrifugation douce suivie d'une élimination soigneuse de la graisse de lait et le lavage répété de la pastille cellulaire. Les perles fluorescentes recouvertes d'épitope de l'enveloppe du VIH (Env) ont été utilisées comme cibles pour l'analyse du PCAA. Des cellules ont été souillées avec le marqueur de surface CD45 pour identifier des leucocytes. On a constaté que l'activité de l'ADCP était significative au-dessus des expériences de contrôle et reproductiblement mesurable à l'aide d'un anticorps spécifique au VIH 830A.

Introduction

Le lait maternel humain (BM) est composé de cellules maternelles qui sont viablesà 90% 1 . La composition cellulaire est fortement affectée par le stade de lactation, l'état de santé de la mère et du nourrisson, et la variation individuelle, qui reste mal comprise1,2,3,4. Étant donné que la BM contient 103à 105 leucocytes/mL, on peut estimer que les nourrissons allaités ingèrent 105à 108 leucocytes maternels par jour5. Diverses études in vivo ont démontré que les leucocytes maternels fournissent une immunité critique au nourrisson et sont fonctionnels bien au-delà de ces sites d'ingestion initiale5,6,7,7 ,9,10,11. Toutes les cellules d'origine maternelle ingérées par le nourrisson ont le potentiel d'effectuer des fonctions immunitaires à côté ou de compenser les leucocytes12.

La transmission mère-enfant (TMT) du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) reste une crise dans les pays à ressources limitées. Étant donné que les maladies diarrhéiques et respiratoires sont responsables de taux de mortalité importants chez les nourrissons dans les pays à ressources limitées, et que ces maladies sont considérablement réduites par l'allaitement exclusif, les avantages pour les mères infectées par le VIH l'allaitement maternel l'emporte de loin sur les risques13,14,15. À moins que l'accès à de l'eau potable et à des préparations pour nourrissons appropriées ne soit fiable, l'OMS ne recommande pas l'arrêt de l'allaitement maternel pour les mères infectées par le VIH16. Environ 100 000 MTT par l'intermédiaire de BM se produisent annuellement ; pourtant, seulement 15 % des nourrissons allaités par leur mère infectée par le VIH sont infectés, ce qui suggère un fort effet protecteur de la BM17,18,19,20,21. De nombreux facteurs fonctionnent probablement en tandem pour prévenir la transmission. Fait important, les anticorps spécifiques au VIH (Abs) dans le BM ont été corrélés avec une réduction du MTCT et/ou une réduction de la mortalité infantile par infection par le VIH22,23. Ce qui reste largement flou est la contribution de la fraction cellulaire de BM à ses qualités antivirales.

Beaucoup d'Abs facilitent une variété d'activités antivirales médiées par la région « constante » de la molécule d'immunoglobuline, le fragment cristallin (Fc), par l'intermédiaire de l'interaction avec des récepteurs de Fc (FcRs) trouvés sur pratiquement toutes les cellules immunitaires innées, pratiquement toutes qui se trouvent dans l'humain BM24. La phagocytose cellulaire dépendante des anticorps (ADCP) a été démontrée comme nécessaire pour le dégagement des infections virales et a été sous-étudiée dans le cas de la prévention du MTCT du VIH25,26,27, 28 Annonces , 29. Étant donné le manque de connaissances sur la contribution potentielle de l'activité ADCP par les phagocytes BM à la prévention du TMT du VIH, nous avons cherché à mettre au point une méthode rigoureuse pour isoler les cellules de la BM humaine afin d'entreprendre une étude de l'ADCP BM obtenu à divers stades de lactation.

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Protocole

Chaque participant à cette étude a été recruté et interviewé en accord avec l'approbation de la Commission d'examen éthique et institutionnel (CISR) avec les directives et l'autorisation du Programme de protection des sujets humains (PPHS) approuvé par le Mont Sinaï à l'aide d'un protocole pour l'obtention d'échantillons de lait maternel.

1. Cibler la préparation de la microsphère

  1. Sélectionnez un antigène cible pertinent.
    REMARQUE : Dans cet exemple, la protéine recombinante V1V2-2F5K a été utilisée, qui a été conçue pour imiter l'apex trimérique de l'enveloppe indigène de VIH30.
  2. Effectuer la biotinylation à l'aide d'un kit commercial (Table of Materials) selon le protocole du fabricant.
    1. Calculer la mmol du réactif de biotine pour ajouter à la réaction pour un excès de molaire 5 fois à l'aide de la formule: mmol biotine - mL protéine x (protéine mg/mL protéine) x (protéine de biotine de mmol/mg) x (5 mmol biotine/protéine mmol)30,31. Calculez ensuite le réagent de biotine à ajouter à l'aide de la formule : biotine L et biotine de mmol x (1 000 000 l/L) x (L/10 mmol).
    2. Équilibrez la biotine à température ambiante avant l'ouverture. Dissoudre la protéine dans 0.5-2.0 mL de saline phosphate-tamponné (PBS) selon le calcul fait ci-dessus.
    3. Préparer une solution de 10 mM de réactif de biotine dans le diméthylsulfoxide (DMSO) et ajouter le volume approprié de 10 mM de réactif de biotine à la solution protéique, et incuber la réaction sur la glace pendant 2 h ou à température ambiante pendant 30 min.
  3. Enlever l'excès de biotine à l'aide de concentrateurs de protéines (membranes polyéthersulfone [PES], 3 kDa de poids moléculaire coupé [MWCO], 0,5 mL; Tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant.
    1. Déposez l'échantillon dans la chambre supérieure de la colonne de spin et ajoutez du PBS jusqu'à 400 l. Cap, puis insérez cette chambre d'échantillon dans un tube de collecte. Centrifugeuse à 12 000 x g à température ambiante pendant 30 min.
    2. Jeter le flux à travers et ajouter PBS à 400 l. Répéter la centrifugation. Jetez le flux à travers et ajoutez pbS à 100 l. Mesurer la concentration de protéines par un spectrophotomètre.
      REMARQUE : Les protéines peuvent être aliquoted et congelées à -80 oC jusqu'à ce qu'elles soient utilisées.

2. Phagocytose cellulaire anticorps-dépendante (ADCP) Préparation de plaque d'essai

  1. Conjuguer les protéines biotinylated à 1 m microsphères (« perles »; Tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant.
    1. Par assiette de perles conjuguées, incuber 6 g de protéines avec 12 l de perles de bouillon dans 200 L de 0,1 % d'albumine de sérum bovin (BSA)-PBS à température ambiante pendant 1 h, vortexant doucement toutes les 20 min.
    2. Centrifugeuse à 13 000 x g pendant 5 min. Jeter le supernatant, le vortex doucement et le resuspendre en 1200 'L de 0,1% BSA-PBS. Répétez le spin et lavez l'étape 2x. Resuspendre en 1200 l de 0,1% BSA-PBS.
  2. Aliquot 10 l de solution de perle par puits dans une plaque ronde de 96 puits. Préparer des dilutions d'anticorps ou de sérum immunitaire sédentaire dans 12 'L de 2% HSA HBSS, généralement à partir de 50 'g/mL d'anticorps ou une dilution de sérum 1/100.
    REMARQUE : Dans les données de l'échantillon, l'anticorps monoclonal (mAb) 830A a été utilisé.
  3. Ajouter 10 ldddd d'anticorps/sérum titrés à la plaque de perles et couver pendant 2 h à 37 oC. Ajouter 200 oL de 2 % de HSA HBSS à chaque puits et plaque de centrifugeuse à 2 000 x g pendant 10 min.
  4. Retirez soigneusement le supernatant par un renversement rapide et une décantation du liquide des puits de plaque dans un évier pour éviter de déranger la boulette de perle invisible.

3. Isolement des cellules du lait maternel

  1. Obtenir du lait maternel humain auprès de femmes allaitantes en bonne santé, exprimé à l'aide de pompes électroniques ou manuelles doubles. Isoler les cellules à moins de 4 h de l'expression, en gardant le lait à température ambiante.
  2. À l'aide de tubes de 50 ml, centrifuger 50 ml de lait à 800 x g pendant 15 min. Verser soigneusement le lait écrémé et la graisse tout en laissant le granule cellulaire intact. Essuyez l'intérieur du tube avec une lingette sans papier pour enlever toute la graisse de la paroi du tube.
  3. Ajoutez 10 ml d'albumen de sérum humain de 2 % dans la solution de sel équilibrée de Hank (2 % HSA HBSS [sans Ca2 ou Mg)). Resuspendre le granule par pipetage doux pour éviter l'activation cellulaire et l'apoptose. Transférer dans un tube de 15 ml et une centrifugeuse à 450 x g pendant 10 min.
  4. Verser le supernatant et répéter l'étape 1.3. Ensuite, resuspend doucement les cellules dans 1/2 ml de 2% HSA HBSS en fonction du nombre de cellules prévu, et compter les cellules par un hémocytomètre ou un compteur cellulaire automatisé, notant également la viabilité cellulaire.

4. ADCP d'astoique

REMARQUE : Les méthodes décrites ici sont adaptées d'Ackerman et coll.32.

  1. Ajoutez 50 000 cellules BM fraîchement isolées à chaque plaque d'adpode aDCP dans 200 L de 2 % De HSA-HBSS. Incuber pendant 2 h à 37 oC.
    1. Pour les expériences de contrôle, les cellules pré-incubées à 37 oC avec un inhibiteur de l'actine de 10 g/mL (cytochalasin-D), un agent de blocage De50 g/mL FcR (FcBlock) ou une combinaison des deux avant leur ajout aux plaques.
  2. Plaque centrifugeuse à 930 x g pendant 10 min. Ajouter 200 l de 2 % HSA HBSS et répéter la centrifugation. Retirez soigneusement le supernatant comme à l'étape 2.7 et répétez le lavage.
  3. Enlever soigneusement les supernatants et les cellules tachées pour la viabilité en utilisant 0,5 g/mL (concentration finale) tache de viabilité fixable 450 par puits dans 50 'L de 2% HSA HBSS. Incuber 20 min à température ambiante dans l'obscurité. Plaque centrifugeuse à 930 x g pendant 10 min et retirer le supernatant comme à l'étape 2.7. Ajouter 200 L de 2% HSA HBSS et plaque de centrifugeuse à nouveau suivie par l'enlèvement du supernatant comme à l'étape 2.7.
  4. Après coloration de viabilité, les cellules de tache pour les marqueurs de leucocyte d'intérêt, y compris un minimum d'une tache CD45-spécifique telle que PE-souris anti-humain CD45 (clone HI30) à une concentration optimisée (1 'g/L dans 50 'L de 1% BSA HBSS dans les données d'exemple).
    REMARQUE : Tous les marqueurs d'intérêt spécifiques à la lignée peuvent être inclus.
  5. Incuber 20 min à température ambiante dans l'obscurité. Plaque centrifugeuse à 930 x g pendant 10 min et retirer le supernatant comme à l'étape 2.7. Ajouter 200 l de 1 % de BSA HBSS et répéter la centrifugation. Enlever le supernatant. Fixer les cellules dans 200 oL de 0,5 % de formaldéhyde dans l'obscurité à température ambiante pendant 30 min ou pendant la nuit à 4 oC. Réfrigérer dans l'obscurité jusqu'à l'analyse.

5. Analyse par cytométrie de flux

  1. Effectuer le gating initial pour éliminer les doublets sur une dispersion vers l'avant (FSC) par rapport à la dispersion latérale (SSC) parcelle et les débris (matériel plus petit que FSC 5000) (voir Figure 1). Utilisez une tache SSC vs viabilité (V450 dans ce cas) parcelle pour éliminer les cellules mortes (ceux qui sont positifs pour la tache de viabilité).
  2. Utilisez une parcelle SSC vs CD45 pour différencier les principales classes de leucocytes (granulocytes, monocytes, lymphocytes) comme décrit sazèle 33,34.
    REMARQUE : Cette classification n'est que suggestive et des marqueurs spécifiques à la lignée sont nécessaires pour confirmer le type de cellule.
  3. Pour toutes les cellules CD45MD, ou pour chaque sous-ensemble d'intérêt des leucocytes, mesurez l'activité aDCP en gatingant avec un marqueur sur les cellules perlées-positives dans un histogramme du canal isothiocyanate de fluorescéine (FITC), où les perles fluorescentes sont détectées.
    REMARQUE : Les puits de contrôle négatifs dans lesquels les perles n'ont pas été ajoutées indiqueront où les cellules perlées-positives sont apparentes dans l'histogramme et donc où placer le marqueur de gating.
  4. Calculer les scores ADCP comme (intensité médiane de fluorescence [IMF] des cellules perlées-positives) x (% du Total CD45 - cellules dans la population positive). Utilisez un logiciel graphique pour tracer les scores à chaque concentration Ab/sérum et effectuer une analyse de zone sous la courbe (AUC).
    REMARQUE : L'ADCP est considéré comme positif si l'AUC est supérieur à 3 x 3 fois l'écart-type de l'AUC de score ADCP d'un mAb négatif non spécifique de contrôle (dans ce cas, 3865).

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Résultats

Le lait peut être conservé à température ambiante ou plus frais (mais non congelé); cependant, étant donné que nous avons observé une viabilité réduite lorsque le lait a été gardé très froid (données non montrées), et qu'il est plus simple de recueillir, de stocker brièvement et de transporter à des températures ambiantes, il est recommandé que les échantillons ne soient pas réfrigérés afin de réduire variabilité d'échantillon à échantillon. Dans le lait obtenu 7 à 183 jours après le part...

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Discussion

La technique basée sur la cytométrie du débit pour mesurer l'activité ADCP décrite ci-dessus a été décrite pour la première fois en 201130 et a depuis fait ses preuves et a été citée dans plus de 80 études. Le protocole décrit ici adapte cette technique pour une utilisation avec des cellules BM primaires pour la première fois. Les études antérieures de la fonctionnalité fc-négociée par les cellules De MB ont été en grande partie limitées à la mesure des éclats oxydatifs ou des essais de phagocytos...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Nous remercions la Dre Susan Zolla-Pazner, du Département de médecine et de microbiologie de l'École de médecine Icahn du Mont Sinaï, pour son examen des manuscrits. Le NIH/NICHD a fourni du financement pour ce projet sous le numéro de subvention R21 HD095772-01A1. En outre, R. Powell a été soutenu par des fonds du Département de médecine, Division des maladies infectieuses, Icahn School of Medicine à Mount Sinai.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1 et micro ; m FluoSpheres Microsphères marquées aux neutravidines  ;Thermo FisherF8776
BD Pharmingen PE Souris Anti-Humain CD45BD560975
Sérum bovin AlbumineMP Biomedicals8810025
Corning V-bottom polystyrène 96 puits plaque  ;Corning  ;3894
Cytochalasine DSigma22144-77-0
EZ-Link NHS-LC-LC-Kit de biotine  ;Thermo Fisher21338
Falcon 15 mL Tubes coniques à centrifugerCorning  ;
Falcon 50 mL Tubes à centrifuger coniquesCorning  ;352070
Teinture de viabilité fixable 450  ;BD562247
Solution de formaldéhydeSigma252549  ;
HBSS sans calcium, magnésium ou phénol RedLife Technologies14175-095
Human BD Fc BlockBD564219
Human Serum AlbuminMP Biomedicals2191349
Kimtech Science Kimwipes Delicate TaskWipers Kimberly-Clark Professional  ;34120
PBS 1x ThermoFisher10010023
Polystyrène 10 mL Pipettes sérologiquesCorning  ;4488
Concentrateurs de protéines PES, 3K MWCO, 0,5 mLPierce88512
352196 pH 7,4

Références

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