Isolement des leucocytes du lait maternel humain pour une utilisation dans une essai de phagocytose cellulaire dépendante des anticorps des cibles de VIH

Résumé

Le lait maternel transmet le virus de l'immunodéficience humaine (VIH), bien que seulement 15 % des nourrissons allaités par des mères infectées par le VIH soient infectés. Les nourrissons allaités ingèrent 10⁵à 10⁸ leucocytes maternels par jour, bien que ces cellules soient sous-étudiées. Ici nous décrivons l'isolement des leucocytes de lait maternel et une analyse de leur capacité phagocytic.

Résumé

Même en l'absence de médicaments antirétroviraux, seulement 15 % des nourrissons allaités par des mères infectées par le VIH sont infectés, ce qui suggère un fort effet protecteur du lait maternel (BM). À moins que l'accès à de l'eau potable et à des préparations pour nourrissons appropriées ne soit fiable, l'OMS ne recommande pas l'arrêt de l'allaitement maternel pour les mères infectées par le VIH. De nombreux facteurs fonctionnent probablement en tandem pour réduire la transmission de La BM. Les nourrissons allaités ingèrent par jour 10⁵à 10⁸ leucocytes maternels, bien que ce qui reste largement incertain, c'est la contribution de ces cellules aux qualités antivirales de la BM. Actuellement, nous avons cherché à isoler les cellules de la BM humaine afin de mesurer phagocytose cellulaire dépendante des anticorps (ADCP), l'une des réponses immunitaires innées les plus essentielles et les plus répandues, par les phagocytes BM contre les cibles du VIH. Des cellules ont été isolées de 5 échantillons humains de BM obtenus à divers stades de lactation. L'isolement a été effectué par centrifugation douce suivie d'une élimination soigneuse de la graisse de lait et le lavage répété de la pastille cellulaire. Les perles fluorescentes recouvertes d'épitope de l'enveloppe du VIH (Env) ont été utilisées comme cibles pour l'analyse du PCAA. Des cellules ont été souillées avec le marqueur de surface CD45 pour identifier des leucocytes. On a constaté que l'activité de l'ADCP était significative au-dessus des expériences de contrôle et reproductiblement mesurable à l'aide d'un anticorps spécifique au VIH 830A.

Introduction

Le lait maternel humain (BM) est composé de cellules maternelles qui sont viables^{à 90}% 1 . La composition cellulaire est fortement affectée par le stade de lactation, l'état de santé de la mère et du nourrisson, et la variation individuelle, qui reste mal comprise^1,2,3^,4. Étant donné que la BM contient 10³à 10⁵ leucocytes/mL, on peut estimer que les nourrissons allaités ingèrent 10⁵à 10⁸ leucocytes maternels par jour⁵. Diverses études in vivo ont démo....

Protocole

Chaque participant à cette étude a été recruté et interviewé en accord avec l'approbation de la Commission d'examen éthique et institutionnel (CISR) avec les directives et l'autorisation du Programme de protection des sujets humains (PPHS) approuvé par le Mont Sinaï à l'aide d'un protocole pour l'obtention d'échantillons de lait maternel.

1. Cibler la préparation de la microsphère

1. Sélectionnez un antigène cible pertinent.
   REMARQUE : Dans cet exemple, la protéine recombinante V1V2-2F5K a été utilisée, qui a été conçue pour imiter l'apex trimérique de l'enveloppe indigène de VIH^....

Résultats

Le lait peut être conservé à température ambiante ou plus frais (mais non congelé); cependant, étant donné que nous avons observé une viabilité réduite lorsque le lait a été gardé très froid (données non montrées), et qu'il est plus simple de recueillir, de stocker brièvement et de transporter à des températures ambiantes, il est recommandé que les échantillons ne soient pas réfrigérés afin de réduire variabilité d'échantillon à échantillon. Dans le lait obtenu 7 à 183 jours après le part.......

Discussion

La technique basée sur la cytométrie du débit pour mesurer l'activité ADCP décrite ci-dessus a été décrite pour la première fois en 2011³⁰ et a depuis fait ses preuves et a été citée dans plus de 80 études. Le protocole décrit ici adapte cette technique pour une utilisation avec des cellules BM primaires pour la première fois. Les études antérieures de la fonctionnalité fc-négociée par les cellules De MB ont été en grande partie limitées à la mesure des éclats oxydatifs ou des essais de phagocytos.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1 et micro ; m FluoSpheres Microsphères marquées aux neutravidines  ;	Thermo Fisher	F8776
BD Pharmingen PE Souris Anti-Humain CD45	BD	560975
Sérum bovin Albumine	MP Biomedicals	8810025
Corning V-bottom polystyrène 96 puits plaque  ;	Corning  ;	3894
Cytochalasine D	Sigma	22144-77-0
EZ-Link NHS-LC-LC-Kit de biotine  ;	Thermo Fisher	21338
Falcon 15 mL Tubes coniques à centrifuger	Corning  ;
Falcon 50 mL Tubes à centrifuger coniques	Corning  ;	352070
Teinture de viabilité fixable 450  ;	BD	562247
Solution de formaldéhyde	Sigma	252549  ;
HBSS sans calcium, magnésium ou phénol Red	Life Technologies	14175-095
Human BD Fc Block	BD	564219
Human Serum Albumin	MP Biomedicals	2191349
Kimtech Science Kimwipes Delicate Task	Wipers Kimberly-Clark Professional  ;	34120
PBS 1x Thermo	Fisher	10010023
Polystyrène 10 mL Pipettes sérologiques	Corning  ;	4488
Concentrateurs de protéines PES, 3K MWCO, 0,5 mL	Pierce	88512

352196 pH 7,4