Ce protocole décrit un test pour la caractérisation de la formation de gouttelettes lipidiques (LD) dans les organoïdes intestinaux humains lors de la stimulation avec des acides gras. Nous discutons de la façon dont cet analyse est utilisé pour la quantification de la formation de LD, et comment il peut être utilisé pour le dépistage à haut débit pour les médicaments qui affectent la formation de LD.
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Article de méthode
Un test basé sur la fluorescence pour la caractérisation et la quantification de la formation de gouttelettes lipidiques chez les organoïdes intestinaux humains
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les lipides alimentaires sont pris comme acides gras libres (AF) par l'épithélium intestinal. Ces FUR sont intracellulairement convertis en molécules de triglycérides (TG), avant d'être emballés dans des chylomicrons pour le transport vers la lymphe ou en gouttelettes lipidiques cytosoliques (LD) pour le stockage intracellulaire. Une étape cruciale pour la formation des LDest l'activité catalytique des acyltransferases de diacylglycérol (DGAT) dans l'étape finale de la synthèse de TG. Les LD sont importants pour amortir les espèces lipidiques toxiques et réguler le métabolisme cellulaire dans différents types de cellules. Puisque l'épithélium intestinal humain est régulièrement confronté à des concentrations élevées de lipides, la formation de LD est d'une grande importance pour réguler l'homéostasie. Ici nous décrivons un test simple pour la caractérisation et la quantification de la formation de LD (LDF) sur la stimulation avec l'acide gras insaturé le plus commun, l'acide oliétique, dans les organoïdes intestinaux humains. L'analyse LDF est basée sur le colorant fluorescent LD540 spécifique à LD, qui permet la quantification des LD par microscopie confocale, lecteur de plaque fluorescente, ou cytométrie de flux. L'analyse de LDF peut être employée pour caractériser la formation de LD dans les cellules épithéliales intestinales humaines, ou pour étudier les désordres humains (génétiques) qui affectent le métabolisme de LD, tels que l'insuffisance de DGAT1. En outre, cet essai peut également être employé dans un pipeline à haut débit pour tester de nouveaux composés thérapeutiques, qui restaurent des défauts dans la formation de LD dans l'intestin ou d'autres types d'organoïdes.
Introduction
Les lipides sont un élément crucial de l'alimentation humaine et jouent un rôle important dans le stockage et le métabolisme de l'énergie systémique. Lorsqu'ils sont ingérés, les lipides alimentaires sont dégradés en acides gras libres (AFF) et en monoglycérides (GM) par des lipases pancréatiques. Ces substrats sont ensuite repris par les entéroocytes de l'épithélium intestinal, où ils sont d'abord réestérifiés aux diglycérorides (DG) par des enzymes d'acyltransferases monoglycérides (MGAT) et par la suite aux triglycérides (TG) par le diacylglycérol par le diacylglycérol acyltransferase 1 (DGAT1)1. Enfin, ces TG sont intégrés soit dans les chy....
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Protocole
Toutes les expérimentations utilisant des tissus humains décrits ci-dessous ont été approuvées par le comité d'éthique du Centre Médical Universitaire d'Utrecht (UMCU). Le consentement éclairé pour la collecte, la génération, le stockage, et l'utilisation des organoïdes a été obtenu des patients à l'hôpital pour enfants de Wilhelmina (WKZ)-UMCU.
1. Préparation des médias culturels
REMARQUE: Ce protocole doit être exécuté à l'intérieur d'une armoire de biosécurité. Les organoïdes doivent être manipulés selon les directives standard de culture cellulaire.
- Préparer le milieu de cul....
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Résultats
Pour l'analyse appropriée de la formation de LD, les organoïdes ne devraient pas être ensemencés trop densément avant la stimulation avec l'arthrose et la coloration suivante. Ceci est particulièrement important pour la lecture confocale et de lecteur de plaque, puisque les organoïdes qui se chevauchent pourraient interférer avec la fluorescence. Un exemple de densité d'ensemencement organoïde appropriée (Figure 1A) et une culture avec des or.......
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Discussion
Ici, nous fournissons un protocole pour déterminer la formation de LD dans les organoïdes intestinaux humains lors de l'incubation avec l'acide oleique. Cette méthode est basée sur le colorant fluorescent LD54018, qui permet de caractériser et de quantifier le volume total de gouttelettes lipidiques dans une culture organoïde. Les procédures d'établissement et de maintien des cultures d'organoïdes intestinaux humains ont été publiées avant13, et un guide visuel de ce protoc.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Nous remercions B. Spee d'avoir généreusement fourni LD540. Ce travail a été soutenu par une subvention de l'Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) à S.M.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Supplément Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-028 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Matrice de membrane basale (matrigel) | BD Biosciences | 356231 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | |
| Inhibiteur de DGAT1 (AZD 3988) | Tocris Bioscience | 4837/10 | |
| Sans acides gras BSA | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Formaldéhyde | Klinipath | 4078-9001 | |
| Glutamin (GlutaMAX, 100x) | Gibco | 15630-056 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
| Microscope confocal à balayage laser | Leica | SP8X | |
| LD540 | aimablement fourni par Dr. B. Spee, Utrecht University | ||
| mEGF | Peprotech | 315-09_500ug | |
| N-acétyl cystéine | Sigma-Aldrich | A9165-100G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500G | |
| Cellules productrices de Noggin (cellules HEK293-mNoggin-Fc) | MTA avec J. den Hertog, Institut Hubrecht | ||
| Acide oléique | Sigma-Aldrich | O1008-5G | |
| inhibiteur de p38 MAPK (p38i) (SB202190) | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| PBS sans Ca2+/Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Pénicilline-Streptomycine (5 000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | |
| Cellules productrices de R-spondine (Cellules Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T) | R& D systems | 3710-001-01 | |
| Plaques à 24 puits traitées TC | Greiner-One | 662160 | |
| Plaques à fond transparent noir à fond transparent traitées TC à 96 puits | Corning Life Sciences | 353219 | |
| inhibiteur du récepteur TGFb de type I (A83-01) ; | Tocris Bioscience | 2939/10 | |
| Trypsine (TrypLE Express) | Life Technologies | 12604021 | |
| cellules productrices de WNT-3A (cellules L-Wnt-3A) | MTA avec J. den Hertog, Institut Hubrecht | ||
| Y-27632 dichlorhydrate (inhibiteur de Rho kinase) | Abcam | ab120129-10 |
Références
- Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism. Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).
- Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V.
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Réimpressions et autorisations
