Un modèle d'expression ectopique de chemokine pour tester le recrutement de macrophage in Vivo

Résumé

Pour tester l'effet d'une chimiokine sur le recrutement de macrophages in vivo, l'hybridation in situ de montage entière a été employée pour détecter l'expression ectopique de la chimiokine, et l'immunostaining a été employée pour étiqueter des macrophages. L'imagerie en direct a été utilisée pour l'observation en temps réel de la migration des macrophages.

Résumé

Le poisson zèbre est largement utilisé dans la recherche fondamentale et biomédicale. De nombreuses lignées transgéniques de poissons zèbres sont actuellement disponibles pour étiqueter divers types de cellules. En raison du corps embryonnaire transparent du poisson zèbre, il est commode pour nous d'étudier l'effet d'une chimiokine sur le comportement d'un certain type de cellules in vivo. Ici nous avons fourni un workflow pour étudier la fonction d'une chimiokine sur la migration de macrophage in vivo. Nous avons construit un plasmide de surexpression spécifique aux tissus pour surexprimer l'IL-34 et injecté le plasmide dans des embryons de poissons transgéniques à un stade cellulaire dont les macrophages ont été spécifiquement étiquetés par une protéine fluorescente. Nous avons ensuite utilisé l'hybridation in situ fluorescente de montage entier et l'immunostaining pour détecter le modèle de l'expression de chemokine et le nombre ou l'emplacement des macrophages. Les embryons WT injectés ont été élevés pour générer une lignée transgénique stable. Enfin, nous avons utilisé la formation image vivante confocale pour observer directement le comportement de macrophage dans le poisson transgénique stable pour étudier la fonction de l'IL-34 sur des macrophages in vivo.

Introduction

Le poisson zèbre est un petit poisson d'eau douce tropical à os durs originaire de l'Inde. En ce qui concerne la conservation des gènes, le poisson zèbre ont une similitude de 87% à l'homme¹. Il peut nous fournir des informations sur des sujets connexes de l'homme en étudiant la régulation des gènes, la fonction des protéines et le comportement cellulaire tels que la migration, la prolifération et.al chez le poisson zèbre. L'embryon de poisson zèbre peut être utilisé pour observer le développement des embryons précoces à différents stades après avoir inhibé le pigment. Pendant ce temps, il ne faut que trois mois pour que le poisson zèbre se dév....

Protocole

REMARQUE: Tous les échantillons ont été traités par l'eau d'oeuf de phénylthiourea (PTU) pour inhiber le pigment.

1. Génération de Tg (fabp10a:il34) Transgenic Constructs and Fish Injection

1. Clonez le promoteur 2.8 kb fabp10a ⁸ et les régions de codage IL-34 (ENSDART00000126460.3) de poissons zèbres dans le vecteur pTol2 pour générer la construction fabp10a-il34. Injecter les constructions dans un stade à cellule Tg (mpeg1: GFP) et des embryons de poissons WT avec l'ARNm transposase. Élever les embryons WT injectés fabp10a-il34 à l'adulte

Résultats

Les étapes du protocole du poisson zèbre sont illustrées à la figure 2. Tout d'abord, nous avons généré la construction pBLK-fabp10a-il34-sv40 dans laquelle il34 a été conduit par le promoteur fabp10a (Figure 2). La construction a été micro-injectée dans un stade à cellule Tg (mpeg1 : GFP) embryons de poissons zèbres qui peuvent étiqueter les macrophages avec des embryons de GFP et de WT qui on.......

Discussion

Le protocole décrit ici nous permet d'étudier la fonction d'une chimiokine sur le comportement de la macrophagein vivo et la procédure nécessite une certaine expertise technique. En résumé, il y a plusieurs étapes critiques pour éviter des complications dans le protocole : 1) sélectionnez une ligne transgénique appropriée qui montre le signal transgénique spécifique et fort pour étiqueter la cellule d'intérêt ; 2) sélectionner un tissu approprié qui est accessible pour l'imagerie et la surexpression des gènes transgéniqu.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anticorps
Alexa 488-Anticorps anti-chèvre	Invitrogen	A11055
Anti-Digoxigénine-HRP  ;	perkinelmer	NEF832001EA
Goat-Anti-GFP	anticorps Abcam	ab6658
Reagent
CaCl2· ; 2H2O	Sigma	21097
Cyanine 3 Plus Amplification Reagent	perkinelmer	NEL745001KT
E2 solution			15 mM  ; NaCl +0,5 mM KCl +1,0 mM MgSO4+150 & micro ; M  ; KH2PO4 + 50 µ ; M  ; Na2HPO4 +1,0 mM CaCl2 + 0,7 mM NaHCO3  ;
Sérum fœtal bovin (FBS)	Life	10099-133
Formamide	Diamant	A100314
Glycérol  ;	Sigma	V900860
Héparine sodique	Sigma	H3149
Tampon d’hybridation (HB)			50 % formamide+ 5&fois ; SSC+9 mM citrate de sodium+50 &mu ; g/ml d’héparine sodique+ 500 &mu ; g/mL ARNt+ 0,1 % Tween20
KCl	Sigma	P5405
KH2PO4	Sigma	P5655
Agarose à bas point de fusion	Sigma	A9414
Méthanol	GHTECH	1.17112.023
Bleu de méthylène  ;	Sigma	M9140
MgSO4	Sigma	M2643
Na2HPO4	Sigma	S5136
NaCl	Sigma	S5886
NaHCO3  ;	Sigma	S5761
Paraformaldéhyde (PFA)	Sigma	158127	Suspendre 16 g de PFA dans 400 ml de 1x PBS, chauffer à 60 ° ; C  ; dissoudre environ 30 min. Cette solution peut être préparée à l’avance et stockée à -4 °C. Attention. Manipulez avec un masque.
10&fois ; PBS			14,2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2,4 g KH2PO4 en 1L ddH2O
Phénylthiourée (PTU)	Sigma	P7629
1× ; Plus Amplification Diluant	perkinalmer	NEL745001KT
Protéinase K  ;	Fermentas	E00492
20&fois ; Citrate de sodium salin (SSC)			175,3 g NaCl+ 88,2 g de citrate de sodium dans 1 L ddH2O, PH 7,0
Citrate de sodium	Sigma	A5040
Tricaïne	Sigma	E10521
ARNt  ;	Sigma	R6625
Tween20	Sigma	P2287
Plasmide
pBLK-fabp10a-il34-sv40			Pour Tg (fab10a :il34) génération de lignées transgéniques
pBSK-il34			Pour il34 préparation de sonde
Poisson
Tg (mpeg1 : GFP)			Marquer les macrophages avec GFP
Tg (fabp10a : DsRed)			Marquer les cellules hépatiques avec DsRed
Tg (fab10a :il34)			Surexpression de l’IL-34 dans les cellules hépatiques