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Article de méthode

Résoudre l'eau, les protéines et les lipides d'In Vivo Confocal Raman Spectra de Stratum Corneum par une approche chimiométrique

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DOI :

10.3791/60186

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26 septembre 2019

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1Procter and Gamble, Beijing Innovative center, 2Procter and Gamble, Mason Business Center, 3Department of Dermatology, Beijing Children's Hospital, 4Chinese Academy of Inspection and Quarantine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour la collecte des spectres raman confocals des sujets humains dans les études cliniques combinées avec des approches chimiométriques pour l'ablation spectrale et l'extraction ultérieure des dispositifs principaux.

Résumé

Le développement de cette méthode spectroscopique in vivo confocale Raman permet la mesure directe de l'eau, des protéines et des lipides avec une résolution de profondeur chez les sujets humains. Cette information est très importante pour les maladies liées à la peau et la caractérisation des performances des produits de soins de la peau. Ce protocole illustre une méthode de collecte de spectres Raman confocalete et l'analyse ultérieure du jeu de données spectrale tirant parti de la chimiométrie. L'objectif de cette méthode est d'établir un protocole standard pour la collecte de données et de fournir des orientations générales pour l'analyse des données. Le prétraitement (p. ex., suppression des spectres aberrants) est une étape critique dans le traitement de grands ensembles de données provenant d'études cliniques. À titre d'exemple, nous fournissons des conseils basés sur la connaissance préalable d'un ensemble de données pour identifier les types d'valeurs aberrantes et élaborer des stratégies spécifiques pour les supprimer. Une analyse principale des composants est effectuée, et les spectres de chargement sont comparés aux spectres des matériaux de référence pour sélectionner le nombre de composants utilisés dans l'analyse finale de la résolution de la courbe multivariée (MCR). Cette approche est efficace pour extraire des informations significatives à partir d'un large jeu de données spectrales.

Introduction

Dans les études cliniques, la spectroscopie in vivo confocale de Raman a montré sa capacité unique pour déterminer l'épaisseur et la teneur en eau de corneum de strate1,2,3,4, et le suivi de la pénétration de matériaux actifs appliqués topiquement sur la peau5,6. Comme approche non invasive, la spectroscopie raman confocale détecte les signaux moléculaires basés sur les modes vibratoires. Ainsi, l'étiquetage n'est pas nécessaire7. La spectroscopie in vivo confocale de Raman fournit des informations chimiques avec une résolution de profondeur basée sur la nature confocale de la technique. Cette information de profondeur-dépendante est très utile en étudiant les effets des produits de soin de peau4,8, vieillissement9,10, changements saisonniers3, ainsi que les maladies de fonction de barrière de peau, comme la dermatite atopique11,12. Il y a beaucoup d'informations dans la région à haute fréquence de la spectroscopie raman confocale (2 500 à 4 000 cm-1), où l'eau produit des pics distincts dans la région entre 3 250 et 3 550 cm-1. Cependant, les pics Raman de protéines et de lipides, qui sont centrés entre environ 2 800 et 3 000 cm-1, se chevauchent parce que les signaux sont principalement produits à partir de méthylène (-CH2-) et de méthyle (-CH3) groupes13 . Cette information qui se chevauche présente un défi technique lors de l'obtention de quantités relatives d'espèces moléculaires individuelles. Le pic14,15 et la position de pointe sélective12,16 approches ont été utilisées pour résoudre ce défi. Cependant, il est difficile pour ces méthodes basées sur le pic unique d'extraire des informations sur les composants purs parce que plusieurs pics Raman à partir du même composant changent simultanément17. Dans notre publication récente18, une approche MCR a été proposée pour élucider l'information sur les composants purs. Grâce à cette approche, trois composants (eau, protéines et lipides) ont été extraits d'un grand ensemble de données spectroscopiques confocales de Raman in vivo.

L'exécution de grandes études cliniques peut être exigeante sur les individus recueillant des données spectroscopiques in vivo. Dans certains cas, l'acquisition spectrale peut nécessiter de l'équipement d'exploitation pendant de nombreuses heures dans une journée et l'étude peut s'étendre jusqu'à des semaines ou des mois. Dans ces conditions, les données spectroscopiques peuvent être générées par des opérateurs d'équipement qui n'ont pas l'expertise technique nécessaire pour identifier, exclure et corriger toutes les sources d'artefacts spectroscopiques. L'ensemble de données qui en résulte peut contenir une petite fraction des valeurs aberrantes spectroscopiques qui doivent être identifiées et exclues des données avant l'analyse. Cet article illustre en détail un processus d'analyse chimiométrique pour « nettoyer » un jeu de données clinique de Raman avant d'analyser les données avec MCR. Pour réussir à supprimer les valeurs aberrantes, les types de valeurs aberrantes et la cause potentielle de la génération des spectres aberrants doivent être identifiés. Ensuite, une approche spécifique peut être développée pour supprimer les valeurs aberrantes ciblées. Cela nécessite une connaissance préalable de l'ensemble de données, y compris une compréhension détaillée du processus de génération de données et de la conception de l'étude. Dans cet ensemble de données, la majorité des valeurs aberrantes sont des spectres de faible signal au bruit et proviennent principalement de 1) spectres recueillis au-dessus de la surface de la peau (6 208 sur 30 862), et 2) une forte contribution au spectre de la lumière fluorescente de la pièce (67 sur 30 862). Les spectres recueillis au-dessus de la surface de la peau produisent une faible réponse Raman, car le point focal laser s'approche de la surface de la peau et se trouve principalement dans la fenêtre de l'instrument sous la peau. Spectra avec une forte contribution de la lumière de pièce fluorescente sont générés en raison de l'erreur de l'opérateur d'instrument ou le mouvement du sujet, ce qui produit une condition où la fenêtre de collecte raman confocale n'est pas entièrement couverte par le site du corps du sujet. Bien que ces types d'artefacts spectraux aient pu être identifiés et assainis lors de l'acquisition spectrale par un expert spectroscopique au moment de l'acquisition de données, les opérateurs d'instruments formés utilisés dans cette étude ont reçu l'instruction de recueillir toutes les données à moins qu'un une défaillance catastrophique a été observée. La tâche d'identifier et d'exclure les valeurs aberrantes est intégrée au protocole d'analyse des données. Le protocole présenté est élaboré pour résoudre ce défi. Pour s'attaquer aux spectres de faible signal au bruit au-dessus de la surface de la peau, l'emplacement de la surface de la peau doit d'abord être déterminé pour permettre l'élimination des spectres recueillis au-dessus de la surface de la peau. L'emplacement de la surface de la peau est défini comme la profondeur où le point focal laser Raman est la moitié dans la peau et la moitié de la peau comme illustré dans la figure supplémentaire 1. Après avoir supprimé les spectres signal-bruit bas, une analyse principale des composants (PCA) est mise en œuvre pour extraire le facteur dominé par les pics fluorescents de lumière ambiante. Ces valeurs aberrantes sont supprimées en fonction de la valeur de score du facteur correspondant.

Ce protocole fournit des renseignements détaillés sur la façon dont six composantes principales sont déterminées dans le processus de RMC. Cela se fait au moyen d'une analyse PCA suivie d'une comparaison spectrale des formes entre les charges des modèles générés avec un nombre différent de composants principaux. Le processus expérimental de collecte de données de matériaux de référence ainsi que les sujets humains est également expliqué en détail.

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Protocole

Cette étude a été approuvée par le comité d'examen institutionnel de l'Hôpital pour enfants de Beijing conformément aux lignes directrices éthiques de la Déclaration d'Helsinki de 1975. Il a été mené conformément aux lignes directrices du PCI pour les bonnes pratiques cliniques. L'étude a eu lieu de mai à juillet 2015.

1. Collection de spectres raman confocalininin in vivo de sujets humains avec la dermatite atopique

  1. Inclure les sujets en conformité avec les critères suivants.
    1. Inclure les sujets âgés de 4 à 18 ans.
    2. Inclure les sujets présentant une dermatite atopique légère à modérée (score de 2 ou 3 selon l'évaluation globale du médecin) présentant des symptômes de maladie séfoisclée sur 5 à 30 % de la surface du corps, avec au moins deux lésions sur les bras.
    3. Inclure les sujets qui sont en bonne santé, à l'exclusion des symptômes directement liés à la maladie de la MA.
    4. Inclure les sujets qui donnent un consentement éclairé écrit.
    5. Inclure les sujets dont la valeur d'angle de topologie (ITA) est supérieure à 40 à l'emplacement de test.
  2. Exclure les sujets qui répondent à l'un des critères suivants.
    1. Exclure les sujets qui participent actuellement ou qui ont déjà participé à une étude clinique dans n'importe quel établissement d'essai au cours des quatre semaines précédentes.
    2. Exclure les sujets atteints de cancer ou qui ont été diagnostiqués ou traités pour un cancer dans les 5 ans précédant l'étude.
    3. Exclure les sujets diabétiques.
    4. Exclure les sujets qui ont une maladie immunologique ou infectieuse qui pourrait mettre le sujet à risque ou interférer avec l'exactitude des résultats de l'étude (c.-à-d. l'hépatite, la tuberculose, le VIH, le sida, le lupus ou la polyarthrite rhumatoïde).
    5. Exclure les sujets qui ont des conditions cutanées qui pourraient interférer avec les mesures instrumentales ou empêcher l'évaluation claire de la peau que de dermatite atopique. Les exemples incluent la peau extrêmement sèche, la peau endommagée, les coupures, les rayures, les coups de soleil, les taches de naissance, les tatouages, les cicatrices étendues, les éruptions cutanées, la croissance excessive de cheveux, ou l'acné.
    6. Exclure les sujets qui utilisent des médicaments immunosuppresseurs oraux, des antibiotiques ou d'autres thérapies systémiques au cours du dernier mois, à l'exception des tranquillisants mineurs.
    7. Exclure les sujets atteints d'autres affections médicales qui, de l'avis de l'enquêteur, les empêchent d'étudier.
    8. Exclure les sujets ayant une pigmentation plus élevée dans la zone d'essai.
  3. Étiqueter la zone de lésion du participant à l'étude de dermatite atopique et marquer avec une zone de 3 cm x 4 cm sur ou près du site de lésions comme indiqué dans la figure 1A.
  4. Étiqueter la zone de non-lésion avec le même marqueur dans le site du corps homologue (p. ex., avant-bras gauche vs avant-bras droit) comme le montre la figure 1B.
  5. Placez le site du corps marqué en contact étroit avec la fenêtre de l'instrument raman confocal in vivo comme le montre la figure 2A et la figure 2B. Couvrez toute la fenêtre pour éviter l'impact de la lumière de la pièce sur le site du corps.
  6. Effectuer la collecte de données Raman.
    REMARQUE : L'instrument a une résolution spectrale de 2 cm-1 et 50x d'objectif de microscopie (NA - 0,9 immersion d'huile), à l'aide d'un laser de 671 nm d'une puissance de 17 mW. La longueur d'onde est calibrée à l'aide du spectre d'une lampe au néon-argon intégrée. L'étalonnage de l'intensité se fait en mesurant le spectre d'une norme d'étalonnage du verre du NIST (National Institute of Standards).
    1. Déplacez la mise au point jusqu'à ce qu'un spectre tel qu'illustré dans la figure 2C soit observé, puis déplacez-la loin de la surface de la peau de 10 m.
    2. Démarrez la collecte de données pendant 26 étapes avec une taille d'étape de 2 m dans la région de fréquence de 2 510 cm-1à 4 000 cm-1. Utilisez un temps d'exposition de 1 s et mesurez huit répliques pour chaque zone d'une durée totale de 10 à 15 min.

2. Collection de spectres Raman confocals à partir de matériaux de référence

  1. Placez les matériaux de référence, les principaux composants de la strate de peau humaine corneum19, sur la fenêtre de l'instrument raman confocal (voir Tableau des matériaux: Albumine de sérum bovin (BSA), eau déionisée (eau DI), céramide, cholestérol, libre l'acide gras et le squalène).
  2. Recueillir les spectres Raman des matériaux de référence consécutivement de l'extérieur du matériau au centre des matériaux en utilisant les mêmes paramètres de collecte que décrits ci-dessus.
  3. Intégrez la zone sous chaque spectre Raman entre la plage de 2 510 à 4 000 cm-1 et identifiez les trois principaux points de valeur maximale dans ces 26 mesures. Moyenne des spectres Raman à partir de ces trois points pour obtenir les spectres de matériau de référence final.

3. Enlèvement des spectres aberrants par l'analyse chimiométrique

  1. Déterminez la surface de la peau et enlevez les spectres hors de la peau.
    1. Modifiez l'extension de fichier de '.ric' à '.mat' et chargez le fichier .mat vers la plate-forme logicielle MATLAB.
    2. Corriger la ligne de base à l'aide de Baseline (Automatic Weighted Least Squares) en cliquant à droite sur l'ensemble de données importés sous Analyse . Autres outils (fr) Prétraitement dans le logiciel PLS-Toolbox avec paramètre par défaut.
    3. Résumez les valeurs entre 2 910 et 2 965 cm-1 pour obtenir les valeurs d'intensité sous chaque spectre Raman à partir des 26 étapes consécutives de mesure comme indiqué à la figure 3A via la fonction de somme dans MATLAB.
    4. Interpoler la valeur de compensation de l'instrument (valeur de l'axe X dans la figure 3B) de 26 à 260 en utilisant la fonction linspace dans MATLAB.
    5. Interpoler la valeur d'intensité de 26 à 260 en utilisant la méthode spline dans MATLAB, en tirant parti des 260 valeurs de position nouvellement générées.
    6. Utilisez les fonctions polyfit et polyval de MATLAB pour obtenir le nouvel ensemble de valeurs d'intensité avec 260 points. Tout d'abord, utilisez les 260 valeurs de position et d'intensité comme entrées X et Y pour la fonction polyfit, respectivement. Définir la valeur de degré à 20. Ensuite, utilisez les coefficients de sortie et les 260 valeurs de position étendues comme entrée pour polyval pour obtenir les valeurs finales d'intensité de 260.
    7. Utilisez les fonctions max et min de MATLAB pour identifier les points maximum et minimum des valeurs d'intensité nouvellement interpolées de 260.
    8. Calculez la valeur moyenne de l'intensité en divisant la somme de la valeur d'intensité maximale et minimale par deux.
    9. Identifiez la valeur d'intensité des 260 valeurs d'intensité (calculées à partir de l'étape 3.1.6) qui est la plus proche de la valeur d'intensité moyenne et fixez sa valeur de position correspondante en tant que surface de la peau. Définir cette valeur de position comme point zéro dans l'axe X comme l'illustre la figure 3B.
    10. Modifier toutes les autres valeurs de position en fonction du point zéro et de la taille d'étape connue de 2 m.
    11. Enlevez tous les spectres recueillis au-dessus de la surface de la peau en fonction de leur valeur de position.
    12. Importer le reste des données sur PLS-Toolbox pour créer un jeu de données et le renommer "RamanData.mat".
  2. Retirez les spectres aberrants avec l'effet de lumière de la pièce.
    1. Chargez le jeu de données spectre Raman (RamanData.mat) après l'élimination des spectres hors de peau et implémenter l'analyse PCA.
    2. Chargez le jeu de données dans le logiciel PLS-Toolbox sous la plate-forme MATLAB et cliquez à droite sur le jeu de données pour choisir Analyze. PCA.
    3. Sélectionnez Normaliser comme approche de prétraitement et choisissez None pour la validation croisée.
    4. Utiliser les trois composants pour l'analyse de décomposition de l'APC, comme le montre la figure 2 supplémentaire.
    5. Retirez le couvercle de la fenêtre de collecte de l'instrument Raman in vivo et collectez les spectres lumineux de la pièce dans la région à haute fréquence en utilisant les mêmes paramètres utilisés pour la collecte de données sur les matériaux de référence.
    6. Identifiez le facteur d'effet de lumière de la pièce par comparaison avec les spectres de fond lumineux de la pièce, comme le montre la figure supplémentaire 3.
    7. Supprimer les spectres avec une valeur de score correspondante significativement plus élevée que la normale (plus de 99,8% des valeurs de score de l'ensemble des données, soit 0,16 dans cette étude).

4. Sélection du nombre des composants dans l'analyse de décomposition MCR

  1. Corriger la ligne de base des spectres Raman à l'aide de la même approche décrite ci-dessus (section 3.1.2).
  2. Effectuer l'analyse PCA sur le jeu de données prétraité tel que décrit ci-dessus (section 3.2) sauf pour sélectionner "PQN" - "Mean Center" plutôt que "Normaliser", et tracer les valeurs eigengiques à l'échelle logarithmique avec le nombre de composants (20) comme numéro par défaut dans l'analyse de décomposition en cliquant sur le bouton Sélectionner les composants et sélectionner le journal (eigenvalues) comme valeur Y. Choisissez trois à huit comme nombre de composants utilisés pour l'analyse MCR.
  3. Effectuer l'analyse MCR.
    1. Chargez le jeu de données dans le logiciel MCR-main20 via le bouton De sélection de données.
    2. Choisissez le nombre de composants (trois à huit) en cliquant sur la détermination du bouton nombre de composants.
    3. Cliquez sur le bouton Pure sous l'onglet Estimation initiale, sélectionnez Concentration sous la direction de l'onglet sélection variable et cliquez sur le bouton Faire.
    4. Cliquez sur le bouton OK, puis le bouton Continuer à la page suivante.
    5. Cliquez sur Continuer dans la page suivante, puis sélectionnez fnnls et 6 sous la mise en œuvre et Nr. des espèces avec des onglets de profils de non-négativité, respectivement. Cliquez sur le bouton Continuer.
    6. Choisissez les mêmes paramètres que la section 4.3.5 pour cette page et cliquez sur Continuer.

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Résultats

Dans cette étude clinique, les spectres confocals in vivo de Raman ont été rassemblés de 28 sujets de 4-18 ans. Un total de 30 862 spectres Raman ont été recueillis avec le protocole de collecte de données mentionné ci-dessus. Ce grand jeu de données spectrales contient 20% d'aberrations spectrales comme le montre la figure 4A. Les spectres aberrants signal-bruit bas ont été enlevés après avoir déterminé la surface de la peau, suivis par le PCA pour identifier les spectres avec des dispo...

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Discussion

Au cours de la collecte de données, telle que décrite dans les sections 2 et 3 du protocole, chaque profil de profondeur a été recueilli dans une zone avec contact entre la fenêtre de l'instrument et la peau en trouvant les zones les plus sombres des images microscopiques mises en évidence dans les cercles rouges dans Figure 2C. Une fois que ces zones ont été localisées, il était essentiel de commencer le profil de profondeur au-dessus de la surface de la peau pour détermin...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Les auteurs reconnaissent grandement le soutien financier du service d'analyse de la fonction corporative et du service de nettoyage personnel. Nous tenons à exprimer notre gratitude aux directeurs associés analytiques Mme Jasmine Wang et Dr Robb Gardner pour leurs conseils et leur soutien et à Mme Li Yang pour son aide sur la collecte de données.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Albumine sérique bovineSigma-Aldrich
Cholestérol 3-sulfate sodiqueSigma-Aldrich
D-Erythro-DihydrosphingosineSigma-Aldrich
DI eaupurifiée au milipore (18.2M&Omega ;)
Analyseur de peau Gen2-SCARiver Diagnostics, Rotterdam, Pays-BasGen2
Matlab 2018bMathwork2018b
N-behenoyl-D-erythro-sphingosineAvanti Polar Lipids, Inc.
N-Lignoceroyl-D-érythro-sphinganine (céramide)Avanti Polar Lipids, Inc.
Acide oléiqueSigma-Aldrich
Acide palmitiqueSigma-Aldrich
Acide palmitoléiqueSigma-Aldrich
PLS_Toolbox version 8.2Eigenvector Research Inc.8.2
RiverIConRiver Diagnostics, Rotterdam, Pays-Basversion 3.2
SqualèneSigma-Aldrich
Acide stéariqueSigma-Aldrich
Cholestérol Sigma-Aldrich

Références

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