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Dépistage et identification des petits peptides ciblant le récepteur du facteur de croissance du fibroblaste2 à l'aide d'une bibliothèque de peptides d'affichage de phage

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DOI :

10.3791/60189

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30 septembre 2019

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedicine & Department of Cell Biology, Jinan University, National Engineering Research Center of Genetic Medicine, Guangdong Provincial Key Laboratory of Bioengineering Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole détaillé pour le dépistage des petits peptides qui se lient à FGFR2 à l'aide d'une bibliothèque de peptides d'affichage de phage. Nous analysons en outre l'affinité des peptides sélectionnés vers FGFR2 in vitro et sa capacité à supprimer la prolifération cellulaire.

Résumé

La famille humaine des récepteurs du facteur de croissance du fibroblaste (FGFR) comprend quatre membres, à savoir FGFR1, FGFR2, FGFR3 et FGFR4, qui sont impliqués dans diverses activités biologiques, y compris la prolifération cellulaire, la survie, la migration et la différenciation. Plusieurs aberrations dans la voie de signalisation FGFR, en raison de mutations ou d'événements d'amplification des gènes, ont été identifiées dans divers types de cancers. Par conséquent, des recherches récentes ont porté sur l'élaboration de stratégies impliquant le ciblage thérapeutique des FGFR. Les inhibiteurs actuels du FGFR à divers stades du développement préclinique et clinique comprennent soit de petits inhibiteurs moléculaires de kinases tyrosines, soit monoclonal, avec seulement quelques inhibiteurs à base de peptides dans le pipeline. Ici, nous fournissons un protocole utilisant la technologie d'affichage de phage pour filtrer de petits peptides comme antagonistes de FGFR2. En bref, une bibliothèque de peptides phage-affichés a été incubée dans une plaque recouverte de FGFR2. Par la suite, le phage non lié a été lavé par tBST (TBS - 0,1 % [v/v] Tween-20), et le phage lié a été évuré avec un tampon de 0,2 M de glycine-HCl (pH 2,2). Le phage éluné a été amplifié et utilisé comme entrée pour la prochaine série de biopanning. Après trois séries de biopanning, les séquences peptidiques des clones individuels de phage ont été identifiées par séquençage d'ADN. Enfin, les peptides examinés ont été synthétisés et analysés pour l'affinité et l'activité biologique.

Introduction

Les récepteurs du facteur de croissance du fibroblaste (FGFRs) jouent un rôle clé dans la prolifération cellulaire, la cicatrisation des plaies et l'angiogenèse in vivo1. L'activation aberrante de la signalisation de FGFR observée dans une série de tumeurs2,3,4,5 inclut l'amplification de gène, les mutations de gène, les aberrations chromosomiques, et la sécrétion excessive de ligand6 . De nombreux inhibiteurs ciblant les FGFR ont montré des effets thérapeutiques prometteurs dans les essais cliniques et sont principalement classés en trois types : (1) les inhibiteurs de la kinase à petites molécules, qui se lient au domaine intracellulaire du FGFR, (2) antagonistes ciblant le segment extracellulaire, et (3) pièges fGF ligand6. Bien que plusieurs des inhibiteurs de kinase petite molécule ont de bons effets thérapeutiques à la fois in vitro et in vivo7, la plupart d'entre eux ont une faible spécificité cible et montrent des effets indésirables tels que l'hypertension8. La majorité des antagonistes sont des anticorps monoclonaux9,10 et des polypeptides11. Les peptides ont des avantages par rapport aux petites molécules en raison de leur spécificité et des effets secondaires inférieurs. Ils conservent également la perméabilité cellulaire et ne s'accumulent pas dans des organes spécifiques par rapport aux médicaments protéiques12. Par conséquent, les petits peptides ciblés sont à la fois des agents thérapeutiques efficaces et potentiels.

La technologie d'affichage de phage est un outil facile mais puissant pour identifier de petits peptides qui peuvent se lier à une molécule donnée13,14,15. Nous avons utilisé une bibliothèque de peptides d'affichage de phage qui est basée sur un phage simple m13 avec plus de 109 séquences de peptides différentes affichées à la queue pour se lier à la molécule cible (voir tableau des matériaux)16. En raison de la forte affinité des phages vers la molécule donnée, les phages non liés peuvent être lavés, et seuls les phages étroitement liés avec les peptides courts désirés sont conservés. Les cibles moléculaires données peuvent être des protéines immobilisées17,18, glucides, cellules cultivées, ou même des matériaux inorganiques19,20. Un cas passionnant a été rapporté où les peptides d'organe-spécifiques ont été choisis in vivo utilisant la technologie d'affichage de phage21. Les avantages de la technologie d'affichage de phage incluent le haut débit, la facilité d'opération, le coût bas et un large éventail d'applications22.

Dans cette étude, nous fournissons un protocole détaillé de criblage de petits peptides se liant à la protéine immobilisée (FGFR2) utilisant une bibliothèque d'affichage de phage. L'efficacité de la technologie est également examinée en mesurant l'affinité du peptide obtenu vers FGFR2 par la calorimétrie de titration isothermale (ITC), et l'activité biologique par un essai de prolifération de cellules. La méthode peut être étendue pour le dépistage de petits peptides qui se lient aux glucides, aux cellules cultivées ou même aux matériaux inorganiques.

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Protocole

1. Préparation de réactif

  1. LB (bouillon de lysogénie) moyen : Dissoudre 1 g de tryptone, 0,5 g d'extrait de levure et 0,5 g de NaCl dans 100 ml de H2O. Autoclave et conserver à 4 oC.
  2. Stock de tétracycline : Préparer 20 mg/mL dans 1:1 éthanol:H2O. Magasin à -20 oC, et vortex avant d'utiliser.
  3. Solution IPTG/X-gal : Mélanger 0,5 g d'IPTG (isopropyl -D-1-thiogalactopyranoside) et 0,4 g de X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl- D-galactoside) en 10 mL de DMF (dimethyl formamide). La solution peut être stockée à -20 oC pendant un an dans l'obscurité.
  4. Plaques DE tétracycline (Tet) : Dissove 1 g de bacto-tryptone, 0,5 g d'extrait de levure, 0,5 g de NaCl, et 1,5 g d'agar en 100 ml de H2O. Autoclave et frais à l'ilt; 70 oC. Ajouter 100 l de stock de tétracycline et verser les assiettes. Conserver les assiettes à 4 oC dans l'obscurité.
  5. PLAQUES D'IPTG/X-gal : Dissoudre 1 g de bacto-tryptone, 0,5 g d'extrait de levure, 0,5 g de NaCl et 1,5 g d'agar en 100 mL de H2O. Autoclave et refroidir jusqu'à 70 oC. Ajouter 100 l de la solution IPTG/X-gal et verser les plaques. Conserver les assiettes à 4 oC dans l'obscurité.
  6. Tampon glycine-HCI (0,2 M) : Dissoudre 1,5014 g de glycine et 100 mg de BSA (albumine de sérum bovin) dans 100 ml de H2O et ajuster le pH à 2,2 avec HCl. Filtrer la solution à l'aide d'un filtre de 0,22 m et stocker à 4 oC.
  7. Tampon Tris-HCl (1 M) : Dissoudre 12,11 g de Tris (tris (hydroxyméthyl)aminométhane) dans 100 ml de H2O et ajuster le pH à 9,1 avec HCl. Autoclave et stocker à 4 oC.
  8. Tampon de revêtement (0,1 M) : Dissoudre 1,68 g de NaHCO3 sur 200 ml de H2O et ajuster le pH à 8,6 avec NaOH. Filtrer la solution à l'aide d'un filtre de 0,22 m et conserver à 4 oC.
  9. Tampon de blocage : Préparer 0,1 M NaHCO3 (pH 8,6) avec 5 mg/mL de BSA. Filtrer la solution à l'aide d'un filtre de 0,22 m et conserver à 4 oC.
  10. TBS: Préparer 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) avec 150 mM NaCl. Autoclave et conserver à température ambiante.
  11. 0,05 %, 0,1 % ou 0,5 % TBST : Préparer le SCT avec 0,05 %, 0,1 % ou 0,5 % (v/v) Tween-20. Filtrer à l'aide d'un filtre de 0,22 m et conserver à température ambiante.
  12. PEG/NaCl: Préparer 20% (w/v) polyéthylène glycol-8000 avec 2,5 M NaCl. Autoclave et conserver à température ambiante.
  13. Solution TE : Mélanger 1 ml de 1 M Tris-HCl (pH8.0) et 2 ml de 50 mM EDTA (pH 8,0) et ajuster le volume à 100 ml avec H2O. Autoclave et le stocker à température ambiante.
  14. Tampon d'iodide : Dissoudre 30 g de NaI dans 50 ml de TE, pH 8,0. Conservez la solution à température ambiante dans l'obscurité.
  15. Agar supérieur : Dissoudre 1 g de tryptone, 0,5 g d'extrait de levure, 0,5 g de NaCl et 0,7 g d'agarin en 100 ml de H2O. Autoclave et distribuer en 15 ml d'aliquots. Conserver à température ambiante pour utilisation.

2. Premier cycle de biopanning: Screening phage clones qui se lient au domaine extracellulaire de FGFR2

REMARQUE : Utilisez des pointes de pipette résistantes aux aérosols et portez des gants pour tous les protocoles afin de minimiser la contamination par les bactériophages environnementaux.

  1. Préparer une solution FGFR2 de 10 g/mL (Purity 'gt; 97%; voir Table of Materials)solution dans le tampon de revêtement. Ajouter 1 ml de la solution préparée à un plat de 35 cm2 et tourbillonner à plusieurs reprises jusqu'à ce que la surface soit complètement humide. Incuber toute la nuit à 4 oC en secouant.
    REMARQUE : Pour éviter la sélection des liants cibles de leurre, la protéine cible doit être fortement purifiée.
  2. Inoculer 5 ml de LB et tet medium avec Escherichia coli (E. coli) ER2738 pendant 5 à 10 heures à 37 oC avec secousses. Les cellules ER2738 amplifiées seront utilisées pour la titration à l'étape 3.3.
  3. Verser la solution de revêtement du plat (la solution excédentaire doit être enlevée) et ajouter la solution de blocage. Incuber à 4 oC pendant au moins 1 h.
  4. Jetez la solution de blocage et lavez 6 fois rapidement avec tBST (TBS 0,05% (v/v) Tween-20). Évitez de sécher le plat.
  5. Reconstituer la bibliothèque de phage d'origine en 1 ml de TBST [concentration finale de 1011 unités de formation de plaque (PFU)], ajouter au plat enduit, et la roche doucement pendant 2 h sur un shaker à température ambiante.
  6. Jeter le supernatant et laver le plat 10x avec TBST (TBS - 0,05% (v/v) Tween-20), tel qu'il est effectué à l'étape 2.4.
    REMARQUE : Les phages non liés doivent être éliminés complètement par un lavage vigoureux.
  7. Élirez le phage lié en ajoutant 1 ml de tampon glycine-HCl de 0,2 M (pH 2,2) au plat et en se balançant doucement pendant 10 min à température ambiante.
  8. Transférer l'éluate dans un tube de microfuge stérilisé et le neutraliser avec 100 l de 1 M Tris-HCl, pH 9.1.
    REMARQUE : À l'étape 2.6, retirez le phage non lié autant que possible en lavant le plat 10 fois vigoureusement. Il s'agit d'une étape cruciale. Le phage éluté peut être stocké à 4 oC pendant une semaine. Cependant, il est préférable d'aller de l'avant à l'étape suivante dès que possible.

3. Détermination de titer des phages élupés

  1. Plaques pré-chaudes LB et IPTG/X-gal pendant au moins 1 h à 37 oC avant utilisation.
  2. Préparer 100 L de dilutions en série 10 fois (c.-à-d. 101, 102, 103 et 104) de l'éluate de l'étape 2.8 en LB. Utilisez des conseils avec des cartouches de filtre pour éviter la contamination.
  3. Laissez la culture de l'étape 2.2 atteindre la phase médiane du journal (OD600 - 0,5). Distribuer 200 l de la culture dans des tubes de microfuge stérilisés, un pour chaque dilution d'éluate.
  4. Pour initier l'infection, ajouter 10 L de chaque dilution de l'étape 3.2 aux tubes de microfuge individuels contenant la culture E. coli ER2738 à partir de l'étape 3.3. Vortex rapidement et incuber à température ambiante pendant 5 min.
  5. Enrober 90 'L du mélange à partir de l'étape 3.4 dans les plaques LB 'IPTG/X-gal avec des bâtonnets de revêtement.
  6. En option, faire fondre l'agar supérieur au micro-ondes, distribuer 3 ml dans des tubes de culture stériles, un pour chaque dilution d'éluate, et maintenir les tubes à 45 oC. Transférer le mélange de l'étape 3.4 aux tubes de culture contenant une gélose supérieure de 45 oC. Mélanger rapidement et verser immédiatement la culture sur une plaque LB/IPTG/X-gal préréchauffée. Inclinez doucement et faites pivoter la plaque pour répartir uniformément l'agar supérieure.
  7. Après 5 min, inverser et incuber les assiettes pendant la nuit à 37 oC.
  8. Compter les plaques sur des plaques avec environ 100 plaques. Multipliez chaque nombre par le facteur de dilution pour cette plaque pour obtenir le téter phage dans PFU par 10 L.
  9. Inoculer un autre 5 ml de LB - Tet medium avec E. coli ER2738 à 37 oC pendant la nuit avec des secousses pour l'amplification de phage.
    REMARQUE : Utilisez la culture de l'ER2738 en phase médiane (OD600 - 0,5) pour le téter phage. Si la plupart des plaques sont blanches sur les plaques X-gal/IPTG, cela signifie que la piscine de phage a été contaminée par des bactériophages sauvages. En cas de contamination, il est nécessaire de recommencer avec les étapes panoramiques de la solution de stock de phage non contaminée.

4. Amplification de phage

  1. Diluer (1:100) la culture de nuit à partir de l'étape 3.8 dans 20 mL de LB dans un flacon Erlenmeyer de 250 ml. Ajouter l'éluate non amplifiée et incuber en secouant vigoureusement pendant 4,5 h à 37 oC.
  2. Transférer la culture dans un tube de centrifugeuse et une centrifugeuse pendant 10 min à 12 000 x g à 4 oC. Transférer le supernatant dans un tube frais, centrifugeuse à nouveau, et jeter la boulette.
  3. Transférer le haut 80% du supernatant à un tube frais et ajouter à elle 1/6 volume de 20% PEG/2.5 M NaCl. Laisser le phage se précipiter à 4 oC pendant la nuit.
    REMARQUE: Mélanger le supernatant de la culture avec PEG/2.5 M NaCl bien.
  4. Centrifuger le phage précipité à 12 000 x g pendant 15 min à 4 oC. Jeter le supernatant, centrifugeuse à nouveau, et retirer le supernatant résiduel avec une pipette.
  5. Resuspendre la pastille dans 1 ml de SCT et transférer le supernatant dans un tube de microfuge. Centrifugeuse à 12 000 x g pendant 5 min à 4 oC.
  6. Transférer le supernatant dans un tube de microfuge frais et précipiter à nouveau en ajoutant 1/6 volume de 20% PEG/2.5 M NaCl. Incuber sur glace de 15 à 60 min. Centrifugeuse à 12 000 x g pendant 10 min à 4 oC. Jeter le supernatant, re-tourner, et retirer le supernatant résiduel avec une pipette.
  7. Resuspendre le granule dans 200 L de TBS et centrifugeuse pendant une minute supplémentaire pour éliminer les impuretés. Transférer le supernatant dans un tube microfuge frais pour obtenir l'éluate amplifiée.
  8. Titer le phage amplifié tel que décrit à la section 3.
    REMARQUE : La dilution de l'éluate amplifiée est plus élevée par rapport à l'éluate non amplifiée ; des dilutions en série de 108à 1011 sont généralement suggérées.

5. Deuxième tour de biopanning

  1. Répétez les sections 2 à 4.
  2. Titer le deuxième tour de l'éluate amplifiée sur lb - IPTG / X-gal plaques telles que décrites dans la section 3.
    REMARQUE : Réduire la concentration de la protéine FGFR2 à 5 g/mL. Utilisez le phage amplifié de l'étape 4.7 comme entrée et gardez le titre le même que dans le premier tour (1011 PFU). Réduire le temps d'incubation du phage et du plat enduit de FGFR2 à 1 h et augmenter la concentration d'entre-deux à 0,1 % (v/v) dans les étapes de lavage.

6. Troisième tour de biopanning

  1. Répétez les étapes 2.1-2.6.
  2. Élirez le phage lié en ajoutant 1 ml de 20 m bFGF solution (un ligand pour FGFR2) au plat et en se balançant doucement pendant 60 min à température ambiante.
  3. Répétez les étapes 3.1-3.7.
    REMARQUE : Réduire la concentration de revêtement de la protéine FGFR2 à 2,5 g/mL. Utilisez la deuxième série de phage amplifié de la section 5 comme entrée et gardez le titre le même que dans le premier tour (1011 PFU). Réduire le temps d'incubation du phage et du plat enduit de FGFR2 à 30 min et augmenter la concentration d'entre-deux à 0,5 % (v/v) dans les étapes de lavage.

7. Acquisition de l'ADN de plaque pour le séquençage

  1. Amplification de plaque
    1. Diluer (1:100) une culture de nuit d'ER2738 en LB. Dispenser 1 mL de culture diluée dans un tube de 2 ml, un pour chaque clone à caractériser.
    2. Utilisez une pointe de pipette pour choisir une plaque bleue bien séparée d'une plaque de tisière de la section 6 et transférez-la dans le tube contenant la culture diluée. Choisissez un total de 15 plaques.
      REMARQUE : Les assiettes doivent être âgées de 1 à 3 jours, entreposées à 4 oC, et avoir 100 plaques.
    3. Incuber les tubes avec des secousses vigoureuses pendant 4,5 h à 37 oC.
    4. Transférer les cultures dans des tubes de centrifugeuse et une centrifugeuse à 12 000 x g pendant 30 s. Transférer à nouveau le supernatant dans un tube frais et une centrifugeuse.
    5. À l'aide d'une pipette, transférer les 80 % supérieurs du supernatant dans un tube frais. Étiquetez ceci comme le stock de phage amplifié.
      REMARQUE : Diluer le phage amplifié avec un volume égal de glycérol stérile à 100 % et conserver à -80 oC pour une utilisation ultérieure.
  2. Extraction de l'ADN de plaque
    1. Transférer 500 l de phage amplifié dans un tube de microfuge frais et ajouter un volume de 1/6 de 20% PEG/2.5 M NaCl. Inverser pour mélanger et laisser reposer pendant 10 à 20 min à température ambiante.
    2. Centrifugeuse à 12 000 x g pendant 10 min à 4 oC, puis verser le supernatant.
      REMARQUE : Les granulés de phage peuvent ne pas être visibles.
    3. Centrifugeuse encore. Retirez soigneusement tout supernatant restant.
    4. Resuspendre complètement la pastille dans 100 l de la mémoire tampon d'iodure en tapant vigoureusement sur le tube.
    5. Ajouter 250 l d'éthanol à 100 % et couver pendant 15 min à température ambiante.
    6. Centrifugeuse à 12 000 x g pendant 10 min à 4 oC et retirer le supernatant. Laver la pastille avec 0,5 ml d'éthanol à 70 %, rapidement centrifuger à nouveau, retirer le supernatant et sécher brièvement le granule.
    7. Resuspendre la pastille dans 30 l de tampon TE et l'utiliser pour le séquençage.
      REMARQUE : Pré-refroidir l'éthanol à 70 % à -20 oC avant l'étape 7.2.6. Le granule de phage doit être complètement resuspendu dans le tampon d'iodure avant l'ajout d'éthanol.

8. Identification de la séquence peptidique

  1. Utilisez l'amorce de séquençage -96 gIII (5'-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG '3') pour le séquençage.
  2. Analyser les séquences de peptides affichées sur le phage en fonction des résultats du séquençage de l'ADN.
  3. Synthétiser les petits peptides et analyser par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) et spectrométrie de masse pour confirmer leur pureté (98 %).

9. Détection de l'affinité du petit peptide obtenu et de la protéine extracellulaire de FGFR2 par ITC

  1. Eau stérile de dégaz à l'aide d'un instrument à ultrasons. Dissoudre le petit peptide et la protéine extracellulaire FGFR2 dans l'eau stérile. Centrifuger ces échantillons pour éliminer le précipité résiduel.
  2. Effectuer les expériences de titration ITC à 25 oC. Titrate 40 m de petit peptide dans la cellule avec 1,5 M de protéines FGFR2 de la seringue, avec une vitesse d'agitation de 750 tr/min. Ajouter la protéine FGFR2 dans 2 aliquots ll (pour un total de 19 injections) à intervalles de 5 min.
  3. Analyser les données de l'ITC à l'aide d'un modèle de liaison à site unique.
    REMARQUE : L'eau stérile doit être dégazée, et tous les échantillons doivent être centrifuges pour éliminer les bulles d'air et les impuretés résiduelles. L'expérience doit être menée à une température constante de 25 oC.

10. Vérification de l'activité biologique du petit peptide obtenu à l'aide d'un résultat de prolifération cellulaire

  1. Cellules BALB/c 3T3 de semences (3,0 à 103 cellules/puits, 100 oL) dans une plaque de 96 puits avec le médium d'aigle modifié (DMEM) de Dulbecco avec 10 % de sérum bovin fœtal (SGF) pendant la nuit à 37 oC et 5 % de CO2.
  2. Remplacez le supernatant par du DMEM frais par 0,5 % de FBS et affaissez les cellules pendant 12 h.
  3. Faire des dilutions en série du petit peptide (0, 0,0064, 0,032, 0,16, 0,8, 4, 20 et 100 M) avec dMEM frais complété s'ajouter à 0,5% FBS (6 puits en double / concentration). Retirer le supernatant de la plaque de 96 puits et ajouter 100 l de la petite solution peptide par puits. Incuber pendant 48 h à 37 oC et 5 % de CO2.
  4. Remplacer le supernatant par du DMEM frais contenant 10% de kit de comptage cellulaire (CCK)-8 solution et couver pendant 2 h.
  5. Mesurer l'absorption de chaque puits à 450 nm avec un lecteur de microplaques et analyser la viabilité cellulaire.

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Résultats

Obtention d'une grande affinité petit peptide ciblant FGFR2.

Pour dépister les phages ciblant FGFR2, une bibliothèque de doctorat-7 a été utilisée dans cette étude. Une représentation schématique du flux de travail est indiquée à la figure 1. Dans ce processus, le nombre d'apports de phage (PFU) est resté inchangé, tandis que la concentration de revêtement de la protéine FGFR2 a été réduite progressivement. Les résultats du téter phage suggèrent q...

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Discussion

Une bibliothèque de phages combinatoire est un outil puissant et efficace pour le dépistage à haut débit de nouveaux peptides qui peuvent lier les molécules cibles et réguler leur fonction13. À l'heure actuelle, les bibliothèques de peptides d'affichage de phage ont un large éventail d'applications. Par exemple, ils peuvent être utilisés pour sélectionner les peptides bioactifs liés aux protéines réceptrices23, les cibles non protéiques24,...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts financiers.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le Programme des sciences et de la technologie de Guangzhou (No. 2016201604030039).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,22 &mu ; m FiltreMerck MilliporeMPGP002A1
35 cm2 Petite paraboleThermo150460
70 % ÉthanolUsine de réactifs chimiques de Guangzhou64-17-5-96
Amorce de séquençage gIII Synthèsede Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Plaque à 96 puitsNest701001-2
AgarBeyotimeST004D
Bacto-TryptoneOxoidL0037
BALB/c 3T3 cellulesATCCCRL-­ ; 6587
BSA BiodragonBD-M10110
CCK-8kit DOJINDOCK04
DMEMHyclonesh30243.01
DMFNewprobePB10247
EDTAInvitrogen15576028
FGF2 ProteinSino Biological Inc.10014-HNAEPureté >95 %
GlycineSigmaG8898-1KG
IPTGBeyotimeST097
ITC200 systèmeMicroCal Omega
NaClSigmaS6191
NaHCO3Guangzhou usine de réactifs chimiques144-55-8
NaIBidepharm
NaOHGuangzhou usine de réactifs chimiques1310-73-2
PEG&ndash ; 8000SigmaP2139-250
Ph.D.-7 kit de bibliothèque de peptides d’affichage de phagesNew England BioLabsE8100SContenant la bibliothèque de phages Ph.D.-7, la souche hôte E. coli la souche hôte ER2738 et le phage de contrôle M13KE
Protéines de domaine extracellulaire recombinant FGFR2Sino Biological Inc.10824-H08HPureté > 97 %
Synthèse de petits peptidesde GL Biochem Ltd. (Shanghai, Chine)
TetracyclineSigmaS-SHS-5
TrisSigmaSLF-T1503
Tween-20BeyotimeST825
X-galBeyotimeST912
Extrait de levureOxoidLP0021
BD40879 (en anglais)

Références

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Criblage du FGFR2biblioth que de phage displayantagonistes peptidiquesproc dure de biopanninglution au chlorhydrate de glycineanalyse par ITCessai de prolif ration des fibroblasteskit CCK 8comptage de la formation de plaquesamplification du titre phagique

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