Article de méthode

Établir des co-cultures à base de cellules uniques dans une manière déterministe avec une puce microfluidique

DOI :

10.3791/60202

⸱

27 septembre 2019

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Engineering and Nanomedicine, National Health Research Institutes, 2Ph.D. Program in Tissue Engineering and Regenerative Medicine, National Chung Hsing University, 3National Institute of Cancer Research, National Health Research Institutes

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce rapport décrit une méthode microfluidique basée sur la puce pour mettre en place une expérience de culture cellulaire unique dans laquelle l'appariement à haut rendement et l'analyse microscopique de plusieurs cellules individuelles peuvent être atteints.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les tests de co-culture cellulaire ont été largement utilisés pour étudier les interactions cellules-cellules entre les différents types de cellules afin de mieux comprendre la biologie des maladies, y compris le cancer. Cependant, il est difficile de clarifier le mécanisme complexe des interactions intercellulaires dans les populations cellulaires très hétérogènes en utilisant des systèmes de co-culture conventionnels parce que l'hétérogénéité de la sous-population cellulaire est obscurcie par les valeurs moyennes; les systèmes conventionnels de co-culture ne peuvent être utilisés que pour décrire le signal de la population, mais sont incapables de suivre le comportement des cellules individuelles. En outre, les méthodes expérimentales monocellulaires conventionnelles ont une faible efficacité dans la manipulation cellulaire en raison de la distribution de Poisson. Les dispositifs microfabriqués sont une technologie émergente pour les études unicellulaires, car ils peuvent manipuler avec précision les cellules individuelles à haut débit et peuvent réduire la consommation d'échantillons et de réactifs. Ici, nous décrivons le concept et l'application d'une puce microfluidique pour plusieurs co-cultures unicellulaires. La puce peut capturer efficacement plusieurs types de cellules individuelles dans une chambre de culture (46 %) et dispose d'un espace de culture suffisant utile pour étudier le comportement des cellules (p. ex. migration, prolifération, etc.) sous interaction cellule-cellule au niveau unicellulaire. Des cellules endothéliales lymphatiques et le carcinome squamous oral de cellules ont été employés pour effectuer une expérience de co-culture unicellulaire sur la plate-forme microfluidique pour des études multiples vivantes d'interaction unicellulaire.

Introduction

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La capture efficace de différents types de cellules individuelles et la fourniture d'un espace de culture suffisant sont nécessaires pour les expériences de co-culture à cellule unique de plusieurs types de cellules individuelles1. Limiter la dilution est la méthode la plus couramment utilisée pour préparer les cellules individuelles pour de telles expériences, en raison du faible coût de l'équipement requis. Cependant, en raison de la limitation de distribution de Poisson, la probabilité maximale d'acquisition d'une seule cellule n'est que de 37 %, ce qui rend l'opération expérimentale laborieuse et longue2. En revanche, l'utilisation de la fluorescence activée tri des cellules (FACS) peut surmonter la limitation de distribution Poisson à haute efficacité préparer les cellules uniques3. Toutefois, les FACS peuvent ne pas être accessibles à certains laboratoires en raison des coûts d'instrumentation et d'entretien coûteux. Des dispositifs microfabriqués ont été récemment développés pour le piégeage à cellule unique4, l'appariement à cellule unique5, et les applications de culture monocellulaire. Ces dispositifs sont avantageux en fonction de leur capacité à manipuler avec précision les cellules individuelles6, effectuer des expériences à haut débit, ou de réduire la consommation d'échantillons et de réactifs. Cependant, l'exécution d'expériences de co-culture unicellulaires avec plusieurs types de cellules avec les dispositifs microfluidiques actuels est toujours difficile en raison de la limitation de la distribution Poisson1,7,8, ou l'incapacité de les dispositifs pour capturer plus de deux types de cellules simples4,5,6,9,10.

Par exemple, Yoon et coll. ont signalé un dispositif microfluidique pour l'étude d'interaction cellule-cellule11. Ce dispositif utilise la méthode probabiliste pour jumeler les cellules dans une chambre. Cependant, il ne peut atteindre l'appariement de deux types de cellules différents en raison de restrictions géométriques dans la structure de l'appareil. Un autre rapport de Lee et coll. a démontré une méthode déterministe pour capturer et jumeler les cellules individuelles12. Ce dispositif augmente l'efficacité d'appariement par la méthode déterministe mais il est limité par le temps de fonctionnement prolongé requis pour coupler des cellules. Plus précisément, la deuxième capture cellulaire ne peut être effectuée qu'après que la première cellule capturée a été fixée à la surface après 24 h. Zhao et coll. ont signalé un dispositif microfluidique à base de gouttelettes pour capturer deux types d'une seule cellule13. Nous pouvons trouver que le dispositif microfluidique à base de gouttelettes est encore limité à la distribution de Poisson et ne peut être utilisé que sur les cellules non attachées, et il n'est pas possible de changer la solution de culture pendant le processus de culture.

Auparavant, nous avons mis au point une « puce de fermeture hydrodynamique » microfluidique qui utilise des forces hydrodynamiques déterministes pour capturer plusieurs types de cellules individuelles dans la chambre de culture et peut par la suite effectuer une expérience de co-culture cellulaire pour analyser comportement de migration cellulaire individuel dans le cadre des interactions cellule-cellule14. La puce de fermeture hydrodynamique comprend un ensemble d'unités qui contiennent chacune un canal de contournement serpentin, un site de capture et une chambre de culture. En utilisant la différence de résistance au débit entre le canal de contournement serpentin et la chambre de culture, et une procédure d'opération spécialement conçue, différents types de cellules individuelles peuvent être capturés à plusieurs reprises dans la chambre de culture. Notamment, l'espace suffisant de la chambre de culture peut non seulement empêcher la cellule d'être rincée pendant la capture cellulaire, mais aussi fournir suffisamment d'espace pour les cellules de se propager, proliférer et migrer, permettant d'observer les interactions vivantes unicellulaire. Dans cet article, nous nous concentrons sur la production de cet appareil et les étapes détaillées du protocole.

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Protocole

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1. Fabrication d'un moule de gaufrette par lithographie douce

REMARQUE : Les données du modèle de masque sont disponibles dans notre publication précédente14.

  1. Déshydrater une plaquette de silicium de 4 pouces dans un four à 120 oC pendant 15 min.
  2. Spin coat 4 g de SU-8 2 photoresist négatif sur une plaquette de silicium de 4 pouces à 1000 tr/min pour 30 s pour créer une couche de 5 m d'épaisseur (couche #1).
  3. La couche de cuisson douce #1 sur une plaque chauffante de 65 oC pendant 1 min, puis transférer la couche #1 sur une plaque chauffante de 95 oC pendant 3 min.
  4. Refroidir la couche #1 à la température ambiante, la placer sur le support de l'aligneur de masque semi-automatique, et aligner avec la couche #1 photomask chromé (couche de site de capture).
  5. Exposer la couche #1 avec une lumière UV de 365 nm à une dose de 150 mJ/cm2.
  6. Retirer la couche #1 de l'aligneur et la post-cuire sur une plaque chauffante de 65 oC pendant 1 min. Transférer la couche #1 à une plaque chauffante de 95 oC pendant 1 min.
  7. Refroidir la couche #1 à la température ambiante. Plongez dans une solution d'acétate de monométhyle de propylène glycol pour laver le photoresist uncrosslinked pendant 2 min. Doucement sec avec du gaz azoté pour révéler une couche #1 marque d'alignement.
  8. Couvrez la couche #1 marque d'alignement par un ruban adhésif, spin coat 4 g de SU-8 10 photoresist négatif sur la couche #1 à 1 230 tr/min pour 30 s pour créer une couche de 25 m d'épaisseur #2.
  9. Retirer le ruban adhésif, faire cuire doucement la couche #2 sur une plaque chauffante de 65 oC pendant 3 min, puis transférer la couche #2 sur une plaque chauffante de 95 oC pendant 7 min.
  10. Refroidir la couche #2 à la température ambiante, placer la couche #2 sur le support de l'aligneur de masque semi-automatique, et aligner la couche #2 photomasque chromée (couche de canal de dérivation) à la couche #1 marque d'alignement.
  11. Exposer la couche #2 avec une lumière UV de 365 nm à une dose de 200 mJ/cm2.
  12. Retirer la couche #2 de l'aligneur et la post-cuire sur une plaque chauffante de 65 oC pendant 1 min et transférer la couche #2 à une plaque chauffante de 95 oC pendant 3 min.
  13. Refroidir la couche #2 à la température ambiante et couvrir la couche #1 marque d'alignement par du ruban adhésif. Spin coat 4 g de SU-8 2050 photoresist négatif sur la couche #2 à 1.630 tr/min pour 30 s pour créer une couche de 100 m d'épaisseur #3.
  14. Retirer le ruban adhésif, la couche de cuisson douce #3 sur une plaque chauffante de 65 oC pendant 5 min, puis transférer la couche #3 sur une plaque chauffante de 95 oC pendant 20 min.
  15. Refroidir la couche #3 à la température ambiante, placer la couche #3 sur le support de l'aligneur de masque semi-automatique, et aligner la couche #3 photomasque chromé (couche de chambre de culture) à la couche #1 marque d'alignement.
  16. Exposer la couche #3 avec une lumière UV de 365 nm à une dose de 240 mJ/cm2.
  17. Retirer la couche #3 de l'aligneur et la post-cuire sur une plaque chauffante de 65 oC pendant 5 min. Transférer la couche #3 à une plaque chauffante de 95 oC pendant 10 min.
  18. Refroidir la couche #3 à la température ambiante. Plongez dans une solution d'acétate monométhyle de propylène glycol pour lavez le photoresist uncrosslinked pendant 10 min, et séchez doucement avec du gaz azoté.

2. Préparation de l'appareil PDMS pour la capture de plusieurs cellules individuelles

  1. Placer le moule à gaufrettes et le plat de pesage contenant 100 l de trichlorosilane dans un dessiccateur (seulement pour la silanisation) et appliquer un aspirateur (-85 kPa) pendant 15 min.
    REMARQUE: Silanize la surface des gaufrettes avec du trichlorosilane pour créer des propriétés de surface hydrophobes avant pDMS castingso qu'il peut sans effort être décollé de la plaquette PDMS moule.
  2. Arrêtez le vide, puis silanisez le moule de gaufrette dans le dessiccateur (seulement pour la silanisation) à 37 oC pendant au moins 1 h.
  3. Mélanger la base PDMS et l'agent de durcissement PDMS dans un rapport de 10:1. Verser un total de 20 g de PDMS mélangé sur le moule à gaufrettes dans un plat de 15 cm.
  4. Placer le plat de 15 cm dans un dessiccateur et appliquer le vide (-85 kPa) pendant 1,5 min. Retirez ensuite le plat de 15 cm du dessiccateur. Conserver 20 min à température ambiante. Enfin, enlever les bulles d'air résiduelles dans le SMD avec du gaz azoté.
  5. Placer le plat de 15 cm dans un four à 65 oC pendant 2 à 4 h pour guérir le SMD.
  6. Retirez la réplique PDMS du moule à gaufrettes, puis frappez une inlet de 1,5 mm et une prise de 0,5 mm sur le PDMS à l'aide d'un diamètre intérieur de 1,5 mm et d'un poinçonneur de diamètre intérieur de 0,5 mm (figure 1C).
  7. Nettoyez la réplique de PDMS et la surface de la glissière avec du ruban adhésif amovible, puis traitez la surface avec du plasma d'oxygène (100 W pour 14 s).
  8. Alignez manuellement les répliques De PDMS avec la diapositive et les mettre en contact les uns avec les autres.
  9. Placez la glissière PDMS dans un four à 65 oC pendant 1 jour.
    REMARQUE : Le lien permanent entre la diapositive et la réplique PDMS est réalisé pour former l'appareil.
  10. Immerger le dispositif PDMS dans un récipient rempli de phosphate tamponné saline et placer dans un dessiccateur. Ensuite, appliquez le vide (-85 kPa) pendant 15 min pour enlever les bulles d'air.
  11. Placez l'appareil PDMS dans une hotte de culture cellulaire et stérilisez l'appareil avec de la lumière UV (longueur d'onde légère : 254 nm) pendant 30 min.
  12. Remplacer le tampon de l'appareil PDMS par un milieu basal moyen (DMEM-F12-F12 contenant 1 % d'antibiotiques et 10 % de sérum bovin fœtal) et incuber le dispositif PDMS à 4 oC pendant 1 jour. Cela empêche les cellules d'adhérer à la surface du PDMS.

3. Préparation d'une suspension à une cellule

REMARQUE : Les types de cellules comprennent les cellules endothéliales lymphatiques humaines (LEC), les cellules humaines OSCC TW2.6 exprimant l'ARSW5B spécifique (WNT5B sh4) et la lutte antivectorielle (pLKO-GFP) qui ont été obtenues à partir de notre étude précédente15. Veuillez consulter notre publication précédente pour des étapes de culture détaillées.

  1. Retirez le milieu de culture lorsque les cellules atteignent la confluence de 70-80%. Ensuite, lavez doucement les cellules avec 5 ml de PBS stérile trois fois.
  2. Ajouter 1 ml de milieu DMEM-F12 contenant 1 colorant fluorescent de 1 M dans les cellules WNT5B sh4 et pLKO-GFP (utiliser le milieu MV2 pour les LEC) puis incuber les cellules pendant 30 min à température ambiante.
    REMARQUE : Les LEC ont été tachées avec le diacétate vert de chloromethylfluorescein (CMFDA) de colorant, les cellules sh4 de WNT5B ont été souillées avec le colorant fluorescent bleu de 7-amino-4-chloromethylcoumarin (CMAC) et les cellules de pLKO-GFP ont été souillées avec le colorant fluorescent rouge de Dil.
  3. Laver délicatement les cellules avec 5 ml de PBS stérile trois fois.
  4. Retirez le PBS et ajoutez 2 ml de 0,25 % trypsin-EDTA (0,05 % Trypsin-EDTA pour les LEC).
  5. Incuber les cellules pendant 4 min à température ambiante, puis tapoter doucement le plat de culture tissulaire pour favoriser le détachement des cellules.
  6. Ajouter 4 mL de milieu DMEM-F12 pour disperser les cellules WNT5B sh4 et pLKO-GFP (Pour les LEC utilisent 3 mL de milieu MV2 et 1 ml de solution neutralisante de trypsine). Ensuite, transférer les cellules dans un tube de 15 ml, et la centrifugeuse à 300 x g pendant 3 min.
  7. Retirez le supernatant et suspendez délicatement la pastille cellulaire dans 1 ml de milieu DMEM-F12. Comptez le nombre de cellules vivantes dans un hémocytomètre en utilisant la méthode standard d'exclusion Trypan Blue16. Préparer 1 mL de suspension cellulaire à 3 x 105 cellules/mL de concentration dans le milieu DMEM-F12, puis garder les cellules sur la glace pour prévenir l'agrégation cellulaire.
    REMARQUE : Afin d'améliorer l'efficacité de capture d'une seule cellule, une préparation soigneuse de la suspension à cellule unique avec bien dissocié est nécessaire.

4. Capture monocellulaire multiple et triple culture monocellulaire

  1. Connectez un tube de polytétrafluoréthylène (PTFE) entre la sortie de l'appareil et la pompe à seringues. Retirez le milieu et ajoutez 1 l de suspension cellulaire à une concentration de 3 x 105 cellules/mL dans l'entrée de l'appareil PDMS.
  2. Chargez la suspension cellulaire dans l'appareil à l'écart à l'eau d'une pompe à seringues à un débit de 0,3 L/min (figure 2A). La direction du débit est de l'entrée à la prise.
    REMARQUE : Chargez immédiatement après l'ajout de la suspension cellulaire dans l'entrée pour prévenir la sédimentation cellulaire.
  3. Ajouter 1 'L de milieu DMEM-F12 dans l'entrée de l'appareil PDMS après l'étape 4.2.Chargez le milieu DMEM-F12 dans l'appareil par une pompe à seringues à un débit de 0,3 l/min (Figure 2B). La direction du débit s'écoulait de l'entrée à la prise.
  4. Chargez 0,3 l de milieu DMEM-F12 dans l'appareil par une pompe à seringues à un débit de 10 l/min (figure 2C). La direction du débit s'écoulait de la prise à l'entrée.
  5. Répétez les étapes 4.1 à 4.4 pour charger d'autres types de cellules dans l'appareil.
  6. Après avoir terminé la capture cellulaire, utilisez un microscope avec objectif 4x pour l'image de chaque chambre de culture.
    REMARQUE : Les émissions de fluorescence des cellules ont été utilisées pour identifier et compter le nombre de cellules individuelles dans chaque chambre de culture.
  7. Retirez le tube PTFE et scellez l'anse et la sortie avec du ruban polyolefin pour créer un système de culture fermé.
  8. Déplacez l'appareil PDMS vers un plat de culture de 10 cm et ajoutez 10 ml de PBS stérile autour de l'appareil PDMS pour éviter l'évaporation du milieu de l'appareil.
  9. Transférer le plat de culture dans un incubateur (37 oC, 5 % d'humidité co2 et 95 % d'humidité) pour une culture triple à cellule unique.
  10. Observez et photographiez microscopiquement la croissance cellulaire tous les 12 h.

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Résultats

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L'appareil a une structure à trois couches comme le montre la photographie transversale d'un dispositif PDMS coupé (figure 1A). La première couche contient un site de capture (6,0 m de largeur et 4,6 m de hauteur) qui relie la chambre de culture et le canal de contournement. La différence de résistance au débit entre la chambre de culture et le canal de contournement fait en quoi les cellules s'écoulent dans la position de capture et rempliss...

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Discussion

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Les interactions intercellulaires de diverses cellules dans le microenvironnement de tumeur jouent un rôle important dans la progression de la tumeur17. Afin de comprendre le mécanisme des interactions cellules-cellules, les systèmes de co-culture sont utilisés comme méthode d'analyse commune. Cependant, plusieurs types de cellules et l'hétérogénéité des cellules elles-mêmes ont conduit à la complexité expérimentale et des difficultés analytiques.

La puce de fermeture h...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.

Remerciements

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Ces travaux ont été appuyés par une subvention du ministère des Sciences et de la Technologie (105-2628-E-400-001-MY2), et du Programme de doctorat en génie tissulaire et en médecine régénérative, de l'Université nationale Chung Hsing et des Instituts nationaux de recherche en santé.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
3M Advanced Polyolefine Diagnostic Microfluidic Medical Tape3M Company9795R
AntibiotiquesBiowestL0014-100Glutamine-Pénicilline-Streptomycine
Logiciel AutoCAD AutoCAD AutoCADLT 2011Numéro de pièce 057C1-74A111-1001
CellTracke Bleu Colorant CMACInvitrogenC2110
CellTracker Vert Colorant CMFDAInvitrogenC7025
Four conventionnelYEONG-SHIN companyovp45
DessiccateurBel-Art ProductsF42020-0000Dessiccateur sous vide peu encombrant 190 mm base blanche
DiIC12(3) colorant à membrane cellulaireBD Biosciences354218Utilisé comme traqueur de cellules
DMEM-F12 moyenGibco11320-082
Milieu de croissance cellulaire endothéliale MV 2PromoCellC-22022
Sérum fœtal bovin HycloneThermoSH30071.03HI
Hamilton série 700 Seringue en verre ( 0,1 ml )Hamilton80630100 µ ; L, modèle 710 RN SYR, petit NDL amovible, 22s ga, 2 in, point style 2
Harris Uni-Core puncherTed Pella Inc.15075de 1,5 mm de diamètre intérieur
Ted Pella Inc.15071de 0,5 mm de diamètre intérieur
YOTEC companyYS-300S
aligneur MsakDeya Optronic CO.A1K-5-MDA Plasma d’oxygène
NORDSON MARCHAP-300
Nettoyeur plasmaNordsonAP-300Système de traitement au plasma de paillasse
Kit polydiméthylsiloxane (PDMS)Dow corningSylgard 184
Poly-tétrafluoroéthylène (PTFE)Ever Sharp Technology, Inc.TFT-23TDiamètre intérieur, 0,51 mm ; diamètre extérieur, 0,82 mm
Ruban amovible3M CompanyScotch Removable Tape 811
Plaquette de siliciumEltech corperationSPE0039
Spin coaterSynrex Co., Ltd.SC-HMI 2 » ~ 6
StéréomicroscopeLeica MicrosystemsLeica E24
SU-8 10 photorésine négativeMicroChemY131259
SU-8 2 photorésine négativeMicroChemY131240
SU-8 2050 photorésine négativeMicroChemY111072
SU-8 développeurGrand Chemical CompaniesGP5002-000000-72GCAcétate de propylène glycol monométhyle éther
, pompe à seringueHarvardApparatus 703007
TrichlorosilaneGelest, IncSIT8174.0Tridecafluoro-1,1,2,2-tétrahydrooctyle. Hasardeux. Corrosif pour les voies respiratoires, réagit violemment avec l’eau.
Solution neutralisante de trypsineGibcoR-002-100
avec perforateur Harris Uni-Core avec plaque chauffante ",

Références

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Mots-clés

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