Caractérisation des miARN fonctionnellement associés dans le Glioblastoma et leur ingénierie en grappes artificielles pour la thérapie génique

Résumé

Décrit ici est un protocole pour caractériser des modules des miRNAs biologiquement synergiques et de leur assemblage en transgènes courts, qui permet la surexpression simultanée pour des applications de thérapie génique.

Résumé

La pertinence biologique des microARN (miARN) dans la santé et la maladie repose de manière significative sur des combinaisons spécifiques de nombreux miARN simultanément déréglementés plutôt que l'action d'un seul miRNA. La caractérisation de ces modules miRNAs spécifiques est une étape fondamentale dans la maximisation de leur utilisation en thérapie. Ceci est extrêmement pertinent parce que leurs attributs combinatoires peuvent être pratiquement exploités. Décrit ici est une méthode pour définir une signature spécifique de miRNA pertinente au contrôle des répresseurs oncogènes de chromatine dans le glioblastoma. L'approche définit d'abord un groupe général de miARN qui sont déréglementés dans les tumeurs par rapport au tissu normal. L'analyse est encore affinée par des conditions de culture différentielles, soulignant un sous-groupe de miARN qui sont co-exprimés simultanément au cours d'états cellulaires spécifiques. Enfin, les miARN qui satisfont ces filtres sont combinés en un transgène polycistronique artificiel, qui est basé sur un échafaudage de gènes de grappes de miARN naturellement existants, puis utilisés pour la surexpression de ces modules miRNA dans les cellules réceptrices.

Introduction

miRNAs offrent une occasion inégalée pour le développement d'une approche de thérapie génique large à de nombreuses maladies^1,2,3, y compris le cancer^4,5. Ceci est basé sur plusieurs caractéristiques uniques de ces molécules biologiques, y compris leur petite taille⁶, biogenèse simple⁷, et la tendance naturelle à fonctionner en association⁸. Beaucoup de maladies sont caractérisées par des modèles spécifiques d'expression miRNA, qui convergent souvent vers la régulation des fonctions biologiques complexes⁹. Le but de cette méthode est d'abord de définir une stratégie pour identifier les groupes de miARN qui sont synergiquement pertinents pour des fonctions cellulaires spécifiques. Par conséquent, il fournit une stratégie pour le rétablissement de ces combinaisons miRNA dans les études et les applications en aval.

Cette méthode permet l'analyse fonctionnelle de plusieurs miARN à la fois, en s'appuyant sur leur ciblage simultané d'un grand nombre de MARN, récapitulant ainsi les paysages complexes des maladies. Cette approche a été récemment employée pour définir un groupe de trois miRNAs que 1) sont simultanément downregulated dans le cancer du cerveau et 2) montrent un modèle fort de co-expression pendant la différenciation neurale aussi bien qu'en réponse au stress génotoxique par rayonnement ou un Agent alkylating d'ADN. La réexpression combinatoire de ce module de trois miARN par la méthode de regroupement décrite ci-dessous entraîne une interférence profonde avec la biologie des cellules cancéreuses et peut être facilement utilisée comme stratégie de thérapie génique pour les études précliniques¹⁰. Ce protocole peut être particulièrement intéressant pour ceux qui participent à la recherche miRNA et à ses applications translationnelles.

Protocole

1. Caractérisation des miARN fonctionnellement associés dans le glioblastome

1. Analyse de l'expression de miRNA différentiel large dans le glioblastoma contre le cerveau
   1. Tout d'abord, déterminer les miARN les plus significativement déréglementés dans la tumeur. Cela peut être réalisé en utilisant au moins trois méthodes différentes:
      1. Mine the Cancer Genome Atlas, trouvé à https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga, pour le séquençage des données¹¹.
      2. Effectuer l'analyse de microarray à partir d'un spécimen opératoire frais¹².
      3. Utilisez des ensembles de données publiés précédemment¹³.
         REMARQUE: Quelle que soit la méthode choisie, la sortie fournit un ensemble en vrac de miARN dont l'expression est statistiquement corrélée (directement ou inversement) avec la biologie tumorale. Ce groupe initial constitue le pool de miRNAs qui sont analysés plus en détail pour l'identification d'un sous-ensemble de miRNAs affichant l'association fonctionnelle la plus rigoureuse en effectuant une analyse plus dynamique des changements d'expression, comme discuté ci-dessous.
2. Analyse de l'expression miRNA spécifique à la condition
   1. Induction de la différenciation cellulaire :
      1. Utilisez des plats en plastique pré-enduits de poly-D-lysine (PDL) pour favoriser la formation d'une culture monocouche. Pour le revêtement plat, dissoudre le PDL dans l'eau à une concentration de 100 g/mL. Utiliser 1 ml de solution par surface de 25 cm^2. Rincer 2x avec PBS 6 h après l'application de la solution PDL.
      2. Plaquer les cellules souches neurales humaines en quantités égales (100 000 cellules/5 mL) soit dans le milieu des cellules souches (milieu neurobasal - supplément B27 - 20 ng/mL EGF/FGF), le milieu de différenciation astrocytique (DMEM à 10 % FBS), soit dans le milieu de différenciation neuronale (milieu neurobasal et B27), le milieu de différenciation astrocytique (DMEM à 10 % FBS), ou le milieu de différenciation neuronale (milieu neurobasal et B27) supplément, 2 M acide rétinoïque)¹⁴. Le protocole pour la différenciation d'oligodendrocyte exige l'addition de l'IGF-1 (200 ng/mL) après l'enlèvement d'EGF/FGF^14,15.
      3. Après le placage cellulaire, placer dans l'incubateur pendant 1 semaine à 37 oC, 5 % DE CO_2.
   2. Extraction d'ARN:
      1. Après 7 jours, retirer les cellules de l'incubateur et retirer le milieu.
      2. Laver les cellules avec du PBS (5 ml). Ensuite, ajouter 1 ml de réactif de lyse (voir Tableau des matériaux)pour lyser les cellules et gratter les cellules en tube microfuge de 1,5 ml à l'aide d'un grattoir cellulaire. Gardez les tubes contenant les cellules lysées à température ambiante (RT) pendant 5 min.
      3. Procéder à l'isolement total de l'ARN en suivant les instructions du fabricant.
   3. analyse de l'expression miRNA:
      1. Quantifier l'expression différentielle des miARN spécifiques identifiés à l'étape 1.1 parmi les trois modèles de différenciation par PCR en temps réel, en utilisant les sondes TaqMan et en suivant les protocoles du fabricant pour la transcription inversée et l'amplification du PCR ( Figure 1).
3. Validation des clusters miRNA par des défis spécifiques au stress
   1. Culture G34 glioblastoma cellules souches dans le milieu neurobasal - Supplément B27 20 ng/mL EGF/FGF. Commencez avec 1 x 10⁶ cellules dans 5 ml dans un flacon d'attachement bas de 25 cm^2.
   2. À partir de 48 h après le placage, ajoutez des concentrations de doublement de l'agent alkylating de l'ADN témozolomide (TMZ) tous les 5 jours, comme suit :
      1. Commencez par 5 M pendant 5 jours. Après 5 jours, retirer le milieu et remplacer par un milieu frais sans témozolomide, pour permettre aux cellules survivantes de récupérer. Après 48 h, ajouter 10 M TMZ et couver pendant encore 5 jours.
      2. Répétez l'étape 1.3.2.1, doublant la concentration de TMZ à chaque fois, jusqu'à ce qu'une concentration d'au moins 100 M soit atteinte et que les cellules deviennent résistantes au médicament¹⁰.
   3. Dans une expérience parallèle, irradier les cellules G34 comme suit :
      1. À partir de 48 h après le placage 1 x 10⁶ cellules dans 5 ml dans un flacon d'attachement faible de 25 cm^2, irradier les cellules avec 2 Gy d'énergie (tout irradiateur fournissant l'émission de photon est acceptable). Remettre les cellules à l'incubateur et ne pas déranger. Après 48 h, irradier à nouveau les cellules avec 2 Gy supplémentaires d'énergie.
      2. Répétez l'étape 1.3.3.1 4x jusqu'à ce qu'un total de 10 Gy d'énergie soit administré.
      3. Remettre les cellules à l'incubateur et les laisser récupérer dans un milieu frais pendant au moins 5 jours avant l'analyse en aval.
   4. Après l'induction de la résistance, lysez les cellules à l'aide d'un réactif de lyse et extrayez l'ARN total selon le protocole du fabricant.
   5. Analyser l'expression des miARN spécifiques identifiés dans les sections 1.1-1.2 telles que décrites à l'étape 1.2.1 (figure 2).
4. Caractérisation de la convergence fonctionnelle des miARN groupés
   1. Obtenir le targetome prévu de chaque miARN défini dans les sections 1.2-1.3 obtenues à l'aide d'outils de prévision de ciblage miRNA.
      REMARQUE: Nous avons généralement recours à TargetScan, comme son algorithme est périodiquement mis à jour¹⁶. D'autres outils de prédiction sont miRanda¹⁷, miRDB¹⁸, et DIANA-miRPath¹⁹. Tous ces programmes sont des applications gratuites sur le Web.
      1. À partir de la première page de Targetscan, sélectionnez le miRNA d'intérêt dans le menu déroulant pré-peuplé. Cliquez sur le bouton Soumettre.
      2. Téléchargez la liste des cibles qui en résultent sous forme de feuille de calcul à l'aide du lien de table De téléchargement ( Figure supplémentaire1).
      3. Pour réduire les risques de fausses prédictions positives, n'incluez que des cibles dans la colonne des sites conservés dans les analyses en aval. En outre, une plus grande rigueur peut être obtenue en utilisant des programmes de prédiction miRNA supplémentaires (voir ci-dessus) et en incluant uniquement des cibles communes à tous les algorithmes.
   2. Classez les targetomes résultants selon les catégories d'Ontologie Gene à l'aide de la suite^{ToppGene 20} pour évaluer l'enrichissement des voies communes à chaque miRNA.
      1. Collez la liste des cibles obtenues à partir de l'étape 1.4.1 dans la fenêtre « Ensemble de gènes de formation », en utilisant le symbole HGNC comme type d'entrée. Cliquez sur Soumettre 'gt; Démarrer. Le programme fournira un tableau de sortie montrant les catégories de « Go » les plus importantes pour la liste des gènes saisies(figure supplémentaire 2).
   3. Pour établir enfin la contribution de chaque miRNA à la régulation d'une voie commune ou d'un processus cellulaire (dans ce cas, régulation de la chromatine), vérifiez chaque targetome obtenu à l'étape 1.4.1 par rapport à la liste complète des gènes impliqués dans le processus cellulaire spécifique ( c.-à-d., régulation de la chromatine), en utilisant la fonction de diagramme de Venn fournie dans le site Web de bioinformatique et de génomique évolutive http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn.
      REMARQUE: Ce programme permet l'intersection de plusieurs groupes en même temps (figure 3). Les cibles uniques spécifiques fournies par chaque miRNA sont ensuite annotées et sélectionnées pour des expériences fonctionnelles en aval.
      1. Dans la première page du programme, téléchargez ou copiez/collez la liste si les ARN cibles pour chaque miRNA ou l'intérêt pour les fenêtres respectives. Nommez chaque liste avec un identifiant unique.
      2. Cliquez sur Soumettre. Le programme fournira une sortie visuelle d'un diagramme de Venn avec un nombre de gènes dans chaque secteur, ainsi qu'une liste complète des ARNM pour chaque sous-ensemble et combinaisons d'intersections.

2. Assemblage de modules miRNA dans un cluster transgénique polycistronique

1. Préparation de l'échafaudage transgénique à base de locus de cluster miR-17-92
   1. Obtenir la séquence de nucléotide du cluster miR-17-92 à partir du navigateur du génome Ensembl²¹. Sélectionnez la séquence « noyau » de la paire de base de 800 englobant les six épingles à cheveux miRNA codées du locus et au moins 200 nucléotides en amont (5') et en aval (3') de la séquence centrale.
   2. Collez la séquence ci-dessus dans n'importe quel programme d'édition de mots.
   3. Définissez la séquence de chacune des six épingles à cheveux indigènes en les récupérant dans miRBase²². Marquez chacune de ces séquences dans la durée de la séquence « de base » précédemment identifiée. Toutes les séquences entre chaque épingle à cheveux représentent des séquences d'espaceur, qui sont importantes pour le traitement correct du transgène.
   4. Retirez les séquences d'épingles à cheveux indigènes de la séquence « de base », à l'exception des 3-5 nucléotides aux extrémités de 5' et 3' de chaque épingle à cheveux, qui serviront d'accepteur pour les nouvelles épingles à cheveux.
2. Construire un nouveau transgène codant plusieurs miARN de choix
   1. Obtenir des séquences en épingle à cheveux de miRNAs destinés à être surexprimés dans le transgène de miRBase. Notez soigneusement les nucléotides spécifiques qui sont les sites de clivage microprocesseur.
   2. Remplacer les épingles à cheveux enlevées (étape 2.1.4) par les séquences en épingle à cheveux des miARN désirés obtenues à l'étape 2.2.1.
   3. Ajouter les séquences de restriction souhaitées dans les deux régions de flanc du transgène pour faciliter la subclonage dans les vecteurs de livraison de choix. Vérifier que les séquences de restriction choisies ne sont pas présentes dans la séquence elle-même.
   4. Pour les contrôles négatifs, utilisez des séquences brouillées de 20 nucléotides pour remplacer la séquence naturelle de 20 nucléotides de chaque miRNA mature. Générez ces séquences brouillées à l'aide d'un outil en ligne tel que https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequence.
3. Vérification de la structure bidimensionnelle du transgène
   1. Copiez la séquence transgénique complète dans le logiciel de prédiction de la structure de l'ARN RNAweb Fold²³.
   2. En utilisant les paramètres de programme standard, cliquez sur Procéder.
   3. Analyser la sortie graphique, en particulier pour la présence d'épingles à cheveux bien définies et la présence de structures de tige à double brin au moins 11 nucléotides proximal au site de clivage microprocesseur. Aussi, recherchez l'absence de points de ramification dans les séquences d'épingle à cheveux (Figure 4).

3. Obtenir des Transgènes par synthèse d'ADN

1. Après la conception et la validation en silico du cluster miRNA chimérique, obtenir la séquence de travail en utilisant la synthèse de l'ADN des fournisseurs commerciaux²⁴ et procéder au clonage en aval dans les vecteurs et la livraison de transgènes. Nous avons utilisé des vecteurs lentiviraux pour l'accouchement in vitro¹⁰ et des virus adéno-associés (AAV) pour la livraison intracrânienne in vivo²⁵.

Résultats

Cette méthode a permis la caractérisation d'un module de trois miRNAs qui sont uniformément downregulated dans les tumeurs cérébrales, qui sont co-exprimées spécifiquement pendant la différenciation neuronale (figure 1) et impliquées dans la réponse de survie de tumeur après thérapie (Figure 2). Ceci est accompli en régulant une voie répressive oncogène complexe de chromatine. Ce modèle de coexpression suggérait une forte activit...

Discussion

Ce protocole est basé sur l'idée que plutôt que de fonctionner isolément, les miARN sont biologiquement pertinents en travaillant en groupes, et ces groupes sont transcriptionnellement déterminés par des contextes cellulaires spécifiques²⁶. Pour justifier cette approche d'un point de vue translationnel, un protocole de suivi qui permet de recréper ce modèle multi-miRNA dans les cellules/tissus est introduit. Ceci est possible en profitant de la biogenèse relativement simple des miRNAs, par qui la ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,4 % d’agarose à basse température de fusion  ;	IBI Scientific	IB70058
0,45 et micro ; Unité de filtration stérile M	Merck Millipore	SLH033RS
1,5 mL Tube microcentrifuge	Eppendorf	22431081
6 puits  ;	Greiner Bio-One	657160
Souris athymiques (FoxN1 nu/nu)	Envigo	069(nu)/070(nu/+)
B-27 Supplément  ;	Thermo Fisher Scientific	12587010
Flacon de culture cellulaire	Greiner Bio-One	660175
Grattoir cellulaire, 16cm	Sarstedt	83.1832
Irradiateur au césium 137  ;	JL Sheperd and Associates	Core Facility (Harvard Medical School)
Chloroforme	Sigma-Aldrich	439142-4L
DMEM, hyperglycémie, pyruvate  ;	Thermo Fisher Scientific	11995040
Dulbecco' s solution saline tamponnée au phosphate  ;	Gibco	14190144
solution d’éosine Y  ;	Sigma-Aldrich	E4009
Sérum de veau fœtal  ;	Sigma-Aldrich	F9665
Solution de formol	Supplément Sigma-Aldrich	HT501128
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEK-293	American Type Culture Collecti	ATCC CRL-1573
Solution d’hématoxyline	Sigma-Aldrich	1051750500
Cellules souches de gliome primaire humain (GBM62)			Fourni par le Dr E. A. Chiocca (Brigham and Women' s Hospital, Boston, MA)
Cellules souches de gliome primaire humain (MGG4)			Fourni par le Dr Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA)
Vecteur lentiviral pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP	System Biosciences	CD511B-1
Lipofectamine 2000  ;	Thermo Fisher Scientific	11668019
Microcentrifugeuse réfrigérée	Eppendorf	modèle n° 5424 R, réf. 5404000138
Milieu de montage  ;	Thermo Fisher Scientific	4112APG
Nalgene Tubes à centrifuger à fond rond en polycarbonate haute vitesse  ;	Thermo Fisher Scientific  ;	3117-0380PK
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	2000c
Cellules progénitrices neurales (NPC)			Fourni par le Dr Jakub Godlewski (Brigham and Women' s Hospital, Boston, MA)
Milieu neurobasal  ;	Thermo Fisher Scientific	21103049
Système de microscope fluorescent motorisé Nikon eclipse Ti	Nikon, Japon	14314
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	31985088
tubes PCR  ;	Sigma-Aldrich	CLS6571-960EA
Pénicilline-Streptomycine  ;	Thermo Fisher Scientific	15140122 Boîtes de
Petri 94/16  ;	Greiner Bio-One	632180
Poly-D-Lysine  ;	Sigma- Aldrich	P4707
EGF humain recombinant  ;	PeproTech  ;	AF-100-15
FGF humain recombinant de base  ;	PeproTech  ;	AF-100-18B
Acide rétinoïque	Gibco	12587-010  ;
RNA Miniprep Kit	Direct-zol	R2050
S1000 Thermocycleur  ;	Bio-Rad	1852196
micro-irradiateur guidé par l’image pour petits animaux  ;	Xstrahal Life Sciences, UK	Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA)
Ultracentrifugeuse Sorvall WX+  ;	Thermo Fisher Scientific  ;
StemPro Accutase  ;	Thermo Fisher Scientific	A1110501
système de PCR en temps réel StepOne	Applied Biosystems  ;
Enceinte de biosécurité SterilGARD	The Baker Company	SG403A-HE
Saccharose	Sigma-Aldrich	S9378
T98-G	Type Culture Collecti	ATCC CRL-1690
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit  ;	Thermo Fisher Scientific	4366596
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4324018
Temozolomide	Tocris Bioscience	2706
Tissue-Tek température de coupe optimale  ;	Fisher Scientific	NC9636948
réactif TRIzol	Thermo Fisher Scientific	15596026	réactif de lyse
U251-MG	American Type Culture Collecti	ATCC HTB-17
U87-MG  ;	American Type Culture Collecti	ATCC HTB-14
ViraPower Lentivector Système d’expression  ;	Eau Thermo Fisher Scientific	K4970-00
, grade HPLC	Fisher	W54
Xylène  ;	Sigma-Aldrich	534056