Un protocole de cryo-pulvérisation pour le traitement des pattes de souris pour évaluer les voies moléculaires de l'inflammation des tissus dans un modèle d'arthrite induite par le collagène

Summary

Une méthode cryogénique de pulvérisation pour traiter les pattes murines à l'aide d'une usine de congélation à azote liquide a été mise au point pour améliorer le rendement et la qualité de l'ARN ou des protéines extraits des tissus et permettre l'analyse des profils moléculaires associés aux Réponses.

Abstract

Le profilage des changements moléculaires dans les tissus locaux est crucial pour comprendre le mécanisme d'action des candidats thérapeutiques in vivo. Dans le domaine de la recherche sur l'arthrite, de nombreuses études sont axées sur les articulations enflammées qui sont composées d'un mélange complexe d'os, de cartilage, de muscle, de cellules stromales et de cellules immunitaires. Ici, nous avons établi une méthode mécanique fiable et robuste pour perturber les pattes de souris enflammées en échantillons pulvérisés homogènes dans un environnement cryogéniquement contrôlé. Des lysates de protéine et d'ARN ont été traités pour permettre des paramètres protéomiques et transcriptionnels et la caractérisation moléculaire des voies pertinentes de la maladie dans les tissus locaux.

Introduction

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie inflammatoire systémique chronique avec une synovite symétrique persistante dans les articulations et une implication articulaire supplémentaire d'organes tels que la peau, le cœur, les poumons et les yeux¹. Bien que les manifestations systémiques de la réponse immunitaire soient évidentes dans les patients humains, une des caractéristiques de la pathologie de RA est l'infiltration des cellules immunitaires dans le tissu synovial et la prolifération des cellules synovials de fibroblaste^2.

Semblable à la RA humaine, le modèle induit par l'arthrite....

Protocol

Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux politiques du Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de Janssen R-D.

1. Méthode de pulvérisation cryogénique à base de moulin à congélateur

1. À la fin de l'étude de CIA, sacrifiez des souris avec 1.5% d'isoflurane suivi de la dislocation cervicale.
2. Le jour du traitement des tissus, pré-réfrigérer tous les instruments (spatules, flacons de broyage, etc.) sur de la glace sèche pendant au moins 10 min. Portez des gants thermiques pour éviter les dommages causés par le gel.
3. Couper les pattes postérieures avec un ciseau....

Results

Ici, nous montrons une visualisation d'image de gel représentatif de l'ARN extrait des pattes avant des souris de CIA dans la figure 2A. Le rRNA 28S et la bande de rRNA 18S indiquent que tous les échantillons ont une quantité suffisante d'ARN intact. Ensuite, nous montrons une parcelle de dispersion représentative des concentrations totales de protéines basées sur l'analyse des protéines BCA à la figure 2.......

Discussion

Bien qu'il existe une forte justification scientifique pour évaluer les voies moléculaires dans les tissus synovials, de nombreux rapports sur le profilage immunitaire du modèle de la CIA maurine ont été axés sur le sang périphérique, tandis que les données d'analyse des protéines et de l'ARN des pattes enflammées sont plutôt limitées. Il y a plusieurs raisons possibles à ce biais : les articulations de la cheville murine ne sont pas plus grandes que 2 cm; les zones touchées sont constituées de tissus cutanés, osseux et .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Perle en acier inoxydable de 5 mm	Qiagen	69989
bêta-mercaptoéthanol	Sigma	M6250	Agent réducteur d’échantillons qui inhibe les enzymes RNASE Kit
bioanalyseur	Agilent	5067-1511	Kit de qualification de l’ARN
b-mercaptoéthanol	Sigma	M6250
Eau de qualité culture cellulaire	Corning	25-055-CI	Eau
Solution mère de lyse cellulaire	Signalisation cellulaire	9803
Tube Eppendorf	Eppendorf	22363204	Tubes microfuges
Boîte de centrifugeuse de tube Eppendorf	Nalgene	5055	Boîte pour maintenir les tubes Eppendorf dans une disposition horizontale des tubes
Everlast 247 Bascule à vitesse variable	Benchmark Scientific	BR5000
Broyeur de congélation	Spex Sample Prep	6875	Congélateur/Broyeur pour le traitement des pattes en poudre pulvérisée
Flacon de broyage	Spex Sample Prep	6801	Flacon en polycarbonate pour le traitement des pattes en poudre pulvérisée
Pierce BCA kit	Pierce	23225	Kit pour la quantification des protéines totales
Inhibiteur de protéase Cocktail set 1	Calbiochem	539131	Inhibiteurs de
protéaseProtein BCA Kit	Pierce	23225
Quantigene Kit	Thermofisher	QP1013	Kit d’analyse de l’ADNb
Microcentrifugeuse réfrigérée	Eppendorf	5417R	Centrifugation
RLT Buffer	Qiagen	79216
Mini kit RNeasy	Qiagen	74104	avec colonne RNeasy, tampon RLT et tampon RW1
Shaker	Benchmark Scientific	BR5000	Rocker/Shaker
Spatule	VWR	10806-412	Spatule pour le transfert de poudre
Perle en acier inoxydable	Qiagen	69989	Perle pour le mélange lors de l’extraction de protéines
Extracteur de tube	Spex Sample Prep	6884	Extracteur pour retirer le haut du flacon de broyage
Vortexer	VWR	10153-838	Mélange d’échantillons