Un protocole de cryo-pulvérisation pour le traitement des pattes de souris pour évaluer les voies moléculaires de l'inflammation des tissus dans un modèle d'arthrite induite par le collagène

Summary

Une méthode cryogénique de pulvérisation pour traiter les pattes murines à l'aide d'une usine de congélation à azote liquide a été mise au point pour améliorer le rendement et la qualité de l'ARN ou des protéines extraits des tissus et permettre l'analyse des profils moléculaires associés aux Réponses.

Abstract

Le profilage des changements moléculaires dans les tissus locaux est crucial pour comprendre le mécanisme d'action des candidats thérapeutiques in vivo. Dans le domaine de la recherche sur l'arthrite, de nombreuses études sont axées sur les articulations enflammées qui sont composées d'un mélange complexe d'os, de cartilage, de muscle, de cellules stromales et de cellules immunitaires. Ici, nous avons établi une méthode mécanique fiable et robuste pour perturber les pattes de souris enflammées en échantillons pulvérisés homogènes dans un environnement cryogéniquement contrôlé. Des lysates de protéine et d'ARN ont été traités pour permettre des paramètres protéomiques et transcriptionnels et la caractérisation moléculaire des voies pertinentes de la maladie dans les tissus locaux.

Introduction

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie inflammatoire systémique chronique avec une synovite symétrique persistante dans les articulations et une implication articulaire supplémentaire d'organes tels que la peau, le cœur, les poumons et les yeux¹. Bien que les manifestations systémiques de la réponse immunitaire soient évidentes dans les patients humains, une des caractéristiques de la pathologie de RA est l'infiltration des cellules immunitaires dans le tissu synovial et la prolifération des cellules synovials de fibroblaste^2.

Semblable à la RA humaine, le modèle induit par l'arthrite de collagène de souris (CIA) suscite l'inflammation forte de tissu avec des réponses immunitaires actives dans les tissus synovials et les compartiments systémiques. La susceptibilité des différentes souches de souris aux liens de modèle de CIA au complexe d'histocompatibilité majeure (MHC) haplotype et antigène spécifiques interactions de cellules T et b de cellules^3,4. En outre, beaucoup de voies pathogènes dans la RA humaine, y compris la production d'autoantibody, le dépôt complexe immunisé, l'activation de cellules myéloïdes, les manifestations polyarticulaires et la formation pannus avec l'infiltration immunisée synovial, sont également évidentes dans ce modèle ^5,6. Les enquêteurs ont utilisé ce modèle bien établi de la CIA pour étudier les effets des traitements anti-inflammatoires cytokine⁷. Beaucoup de produits biologiques approuvés pour les maladies auto-immunes ou inflammatoires, tels que l'anti-TNF et anti-IL-6, se sont avérés efficaces dans le modèle de la CIA^8,9.

Le profilage des interactions du système immunitaire dans le tissu synovial est crucial pour élucider les mécanismes moléculaires associés à la pathogénie de la polyarthrite rhumatoïde. Dans le cadre clinique humain, une pratique courante est d'effectuer des biopsies synoviales d'aiguille sous la conduite de l'imagerie par ultrasons. Dans les milieux précliniques, la plus petite architecture des articulations murines rend les procédures de biopsie beaucoup plus difficiles, voire impossibles. Récemment, nous avons démontré l'utilisation du modèle de la CIA murine pour évaluer les combinaisons de médicaments pour avoir un impact sur les points finaux disparates et résoudre la maladie dans une approche combinatoire¹⁰. Une méthode cryogénique de pulvérisation à base de moulin de congélation a été employée pour transformer les pattes murine enflammées en poudres fines homogènes et les processus établis en aval pour extraire l'ARN et les protéines. Cette méthode protège l'ARN et les protéines contre les processus de dégrativement enzymatiques et chimiques et nous permet d'appliquer plusieurs méthodes analytiques à une seule source d'échantillon homogénéisée.

Protocol

Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux politiques du Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de Janssen R-D.

1. Méthode de pulvérisation cryogénique à base de moulin à congélateur

1. À la fin de l'étude de CIA, sacrifiez des souris avec 1.5% d'isoflurane suivi de la dislocation cervicale.
2. Le jour du traitement des tissus, pré-réfrigérer tous les instruments (spatules, flacons de broyage, etc.) sur de la glace sèche pendant au moins 10 min. Portez des gants thermiques pour éviter les dommages causés par le gel.
3. Couper les pattes postérieures avec un ciseaux à la ligne de fourrure tel qu'il est représenté dans la figure 1A.
4. Transférer chaque patte dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml, congeler immédiatement l'azote liquide et conserver les pattes congelées à -80 oC. Ne conservez pas les échantillons congelés pendant plus d'une semaine.
5. Remplissez l'usine de congélation d'azote liquide comme le montre la figure 1B et laissez-le récalcitrerper pendant au moins 10 min.
6. Conservez l'échantillon non transformé sur la glace sèche et évitez les cycles de gel et de dégel.
7. Transférer une patte postérieure dans une grosse fiole de broyage en polycarbonate préréfrigérée à l'aide d'un bouchon en acier de fond, insérer l'impacteur d'acier préréfrigéré et fermer le flacon de broyage en polycarbonate avec la prise en acier supérieure préréfrigérée (Figure 1C).
8. Transférer de grosses flacons de broyage en polycarbonate avec les échantillons dans le congélateur prérempli de liquide et fermer le couvercle avec le fermoir en caoutchouc trouvé à l'avant de l'instrument.
9. Laisser refroidir les échantillons dans l'azote liquide pendant 1 minute.
10. Placez le congélateur au programme de 1 minute avec 10 cycles par seconde et appuyez sur le bouton de démarrage. Attendez que le congélateur termine son cycle.
    REMARQUE: La machine émet un son de tambour au fur et à mesure que l'impacteur d'acier se déplace d'avant en arrière. Utilisez des bouchons d'oreille pour éviter la perte auditive.
11. Ouvrez le couvercle du congélateur, retirez le gros flacon de broyage en polycarbonate et placez-le dans un extracteur tel qu'il est représenté dans la figure 1D. Retirez le bouchon en acier supérieur en exerçant une pression vers le bas sur la poignée noire jusqu'à ce que la fiche en acier glisse hors du tube de polycarbonate.
12. Transférer le gros flacon de broyage en polycarbonate ouvert sur la glace sèche. Retirez l'impacteur en acier avec des forceps préréfrigérés.
13. Transférer la poudre congelée dans un tube conique préréfrigéré de 50 ml.
14. Poids 30-50 mg de poudre congelée dans un tube de microcentrifuge congelé de 1,5 ml pour l'extraction d'ARN et 100-200 mg de poudre congelée pour l'extraction de protéine.
    REMARQUE: La poudre congelée doit ressembler à du sable fin blanc ou rose clair tel qu'il est représenté dans la figure 1E.
15. Entreposer les échantillons pulvérisés à -80 oC et procéder à l'isolement de l'ARN et des protéines dans un délai de 24 h.

2. Extraction d'ARN

1. Ajouter 10 l'un de mercaptoéthanol par 1 ml de tampon RLT.
2. Calculez le volume de tampon RLT correspondant à un rapport de 23,3 ml/mg de tissu et ajoutez le volume approprié de tampon RLT avec le tube avec de la poudre congelée. Ce rapport a été empiriquement déterminé pour être idéal pour des pattes de souris.
3. Vortex l'échantillon à 3000 tr/min pour 10 s.
4. Bien mélanger en faisant monter et descendre 10 fois vigoureusement avec un pipettor de 1 ml.
5. Vortex l'échantillon à nouveau à 3.000 tr/min pour 20 s.
6. Centrifuger le tube à 13 000 x g pendant 2 min.
7. Transférer 700 l des supernatants dans un tube frais et ajouter 700 l d'éthanol à 70 %.
   REMARQUE: Si le tube est dans le tube, il est acceptable de procéder, en ajoutant tout en même temps un volume équivalent de 70 % d'éthanol.
8. Chargez 700 ll de l'échantillon sur une colonne de purification de l'ARN.
9. Centrifuger le tube à 10 000 x g pour 30 s.
10. Jetez le flux et chargez la partie restante de l'échantillon sur la colonne RNeasy.
11. Centrifuger le tube à 10 000 x g pour 30 s.
12. Jetez le flux à travers et laver la colonne en ajoutant 700 L de tampon RW1 avec centrifugation de 10 000 x g pour 30 s. Si l'option d'exécution de la digestion DNASE, 350 L de RW1 est ajoutée avant le traitement DNASE.  Et 350 L supplémentaires de RW1 sont ajoutés après le traitement DNASE.
13. Facultatif) Effectuer une étape de digestion DNase suivre les instructions du fabricant.
14. Laver le tube deux fois en ajoutant 500 l de tampon RPE suivi d'une centrifugation à 10 000 x g pour 30 s. Jeter le flux à travers chaque fois.
15. Séchez la colonne par centrifugation à 10 000 x g pendant 2 min.
16. L'ARN d'Elute en ajoutant 50 l d'eau avec centrifugation à 10 000 x g pendant 2 min. Recueillir le débit et le transférer dans un nouveau tube de 1,5 ml.
17. Déterminer la quantité d'ARN à l'aide de la méthode de choix du chercheur et les stocker à -80 oC avant d'être analysé plus avant d'être analysé.

3. Extraction de protéines

1. Diluer la solution de stock de lyse cellulaire 10x dans la solution de stock de lyse de 1x cellules à l'aide de l'eau de qualité de culture cellulaire.
2. Reconstituer le Protease Inhibitor Cocktail Set I avec 1 ml d'eau pour faire un stock d'inhibiteur de protéase 100x.
3. Ajouter 100 l d'inhibiteur de protéase à 9,9 ml de lyse cellulaire 1x pour faire une solution de stock final 1x.
4. Ajouter 4 ll de froid glacé 1x Cell Lysis Buffer par mg de poudre de tissu (par exemple, 800 l de tampon de lyse à 200 mg de poudre de tissu).
5. Ajouter une perle en acier inoxydable de 5 mm au tube.
6. Vortex le tube à 3 000 tr/min pour 60 s. Transférer le tube à la glace humide et continuer à l'échantillon suivant.
7. Placer tous les tubes d'échantillon dans une boîte et secouer la boîte de centrifugeuse sur un rocker à 1 000 tr/min, 4 oC pour 1 h.
   REMARQUE: Les chercheurs peuvent constater que le placement de la boîte verticale peut faciliter un meilleur mélange avec la perle.
8. Centrifuger les tubes à 10 000 x g et 4 oC pendant 15 min.
9. Transférer les supernatants dans un tube frais et éviter la couche de graisse sur le dessus.
10. Déterminer la concentration totale de protéines. Les dilutions de 10 à 30 fois de lysate protéique sont idéales pour un test BCA.
11. Aliquot l'échantillon dans 1,5 mL de tubes microcentrifugeets et stocker à -80 oC avant une analyse plus approfondie.

Results

Ici, nous montrons une visualisation d'image de gel représentatif de l'ARN extrait des pattes avant des souris de CIA dans la figure 2A. Le rRNA 28S et la bande de rRNA 18S indiquent que tous les échantillons ont une quantité suffisante d'ARN intact. Ensuite, nous montrons une parcelle de dispersion représentative des concentrations totales de protéines basées sur l'analyse des protéines BCA à la figure 2...

Discussion

Bien qu'il existe une forte justification scientifique pour évaluer les voies moléculaires dans les tissus synovials, de nombreux rapports sur le profilage immunitaire du modèle de la CIA maurine ont été axés sur le sang périphérique, tandis que les données d'analyse des protéines et de l'ARN des pattes enflammées sont plutôt limitées. Il y a plusieurs raisons possibles à ce biais : les articulations de la cheville murine ne sont pas plus grandes que 2 cm; les zones touchées sont constituées de tissus cutanés, osseux et ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Perle en acier inoxydable de 5 mm	Qiagen	69989
bêta-mercaptoéthanol	Sigma	M6250	Agent réducteur d’échantillons qui inhibe les enzymes RNASE Kit
bioanalyseur	Agilent	5067-1511	Kit de qualification de l’ARN
b-mercaptoéthanol	Sigma	M6250
Eau de qualité culture cellulaire	Corning	25-055-CI	Eau
Solution mère de lyse cellulaire	Signalisation cellulaire	9803
Tube Eppendorf	Eppendorf	22363204	Tubes microfuges
Boîte de centrifugeuse de tube Eppendorf	Nalgene	5055	Boîte pour maintenir les tubes Eppendorf dans une disposition horizontale des tubes
Everlast 247 Bascule à vitesse variable	Benchmark Scientific	BR5000
Broyeur de congélation	Spex Sample Prep	6875	Congélateur/Broyeur pour le traitement des pattes en poudre pulvérisée
Flacon de broyage	Spex Sample Prep	6801	Flacon en polycarbonate pour le traitement des pattes en poudre pulvérisée
Pierce BCA kit	Pierce	23225	Kit pour la quantification des protéines totales
Inhibiteur de protéase Cocktail set 1	Calbiochem	539131	Inhibiteurs de
protéaseProtein BCA Kit	Pierce	23225
Quantigene Kit	Thermofisher	QP1013	Kit d’analyse de l’ADNb
Microcentrifugeuse réfrigérée	Eppendorf	5417R	Centrifugation
RLT Buffer	Qiagen	79216
Mini kit RNeasy	Qiagen	74104	avec colonne RNeasy, tampon RLT et tampon RW1
Shaker	Benchmark Scientific	BR5000	Rocker/Shaker
Spatule	VWR	10806-412	Spatule pour le transfert de poudre
Perle en acier inoxydable	Qiagen	69989	Perle pour le mélange lors de l’extraction de protéines
Extracteur de tube	Spex Sample Prep	6884	Extracteur pour retirer le haut du flacon de broyage
Vortexer	VWR	10153-838	Mélange d’échantillons