L'intégrité de la barrière hémato-encéphalique est essentielle à la fonction du système nerveux. Dans Drosophila melanogaster, la barrière hémato-encéphalique est formée par les cellules gliales au cours de l'embryogenèse tardive. Ce protocole décrit les méthodes à essayer pour la formation et l'entretien de barrière hémato-encéphalique dans les embryons de D. melanogaster et les larves de troisième instar.
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Article de méthode
Analyse de l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique dans le mélanogaster Drosophila
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le développement approprié du système nerveux comprend la formation de la barrière hémato-encéphalique, la barrière de diffusion qui régule étroitement l'accès au système nerveux et protège les tissus neuronaux contre les toxines et les agents pathogènes. Des défauts dans la formation de cette barrière ont été corrélés avec des neuropathies, et la panne de cette barrière a été observée dans beaucoup de maladies neurodegenerative. Par conséquent, il est essentiel d'identifier les gènes qui régulent la formation et le maintien de la barrière hémato-encéphalique pour identifier les cibles thérapeutiques potentielles. Afin de comprendre les rôles exacts de ces gènes dans le développement neuronal, il est nécessaire d'essayer les effets de l'expression génique altérée sur l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique. Beaucoup de molécules qui fonctionnent dans l'établissement de la barrière hémato-encéphalique se sont avérées être conservées à travers les espèces eucaryotes, y compris la mouche des fruits, Drosophila melanogaster. Les mouches des fruits se sont avérées être un excellent système modèle pour examiner les mécanismes moléculaires régulant le développement et la fonction du système nerveux. Ce protocole décrit une procédure étape par étape pour essayer l'intégrité de barrière hémato-encéphalique pendant les étapes embryonnaires et larvaires du développement de D. melanogaster.
Introduction
Pendant le développement, la communication et les interactions de cellule-cellule sont critiques pour établir la structure et la fonction de tissu et d'organe. Dans certains cas, ces interactions cellules-cellules scellent les organes de l'environnement environnant pour assurer le bon fonctionnement des organes. C'est le cas du système nerveux, qui est isolé par la barrière hémato-encéphalique (BBB). La dysfonction du BBB chez l'homme a été liée à des troubles neurologiques, y compris l'épilepsie, et la dégradation de la barrière a été observée dans les maladies neurodégénératives, y compris la sclérose en plaques et la sclérose latérale amyotrophique
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Protocole
1. Collecte d'échantillons
- Collection d'embryons
- Dans chaque cage de collecte d'embryons, utiliser un minimum de 50 femelles vierges avec 20 à 25 mâles pour les collections. Incuber ces mouches dans une bouteille avec de la semoule de maïs-agar nourriture (Table of Materials) pendant 1/2 jours avant de commencer les collections23.
REMARQUE: Plus de mouches peuvent être utilisées, mais le rapport femme-mâle doit être maintenu à 2:1. - Pré-chauffer les assiettes d'agar de jus de pomme(tableau 1) à 25 oC pendant la nuit.
REMARQUE:....
- Dans chaque cage de collecte d'embryons, utiliser un minimum de 50 femelles vierges avec 20 à 25 mâles pour les collections. Incuber ces mouches dans une bouteille avec de la semoule de maïs-agar nourriture (Table of Materials) pendant 1/2 jours avant de commencer les collections23.
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Résultats
Les méthodes décrites ici permettent de visualiser l'intégrité du BBB dans l'ensemble du SNC chez les embryons et larves de D. melanogaster (Figure 1). À l'achèvement de la formation de BBB en fin d'embryogenèse, le BBB fonctionne pour exclure de grandes molécules du cerveau et VNC5. Ce protocole tire parti de cette fonction pour essayer la formation de BBB. Lorsque des embryons de type sauvage (Oregon R) de type avancé 17 (20 à 21 h) ont été injectés avec 10.......
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Discussion
Ce protocole fournit une description complète des étapes nécessaires pour l'analyse de l'intégrité bBB au cours des derniers stades embryonnaires et troisièmes larvaires instar du développement de D. melanogaster. Des approches similaires ont été décrites ailleurs pour mettre en valeur l'intégrité de la BBB pendant le développement, ainsi que dans les stades adultes5,7,29,30. Cependant.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Les auteurs remercient le Dr F. Bryan Pickett et le Dr Rodney Dale pour l'utilisation de l'équipement pour l'injection. Ces travaux ont été financés par le financement de la recherche de l'Université Loyola de Chicago à M.D., D.T., et J.J.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 10 kDa de chlorure d’acide de sulforhodamine 101 (Texas Red) Dextran | ThermoFisher Scientific | D1863 | Le dextran doit être dilué dans du ddH2O autoclavé à une concentration de 25 mg/mL. |
| 20 &mu ; L Pointes de pipette à chargement de gel | Eppendorf | 22351656 | |
| 100 % éthanol (200 proof) | Pharmco-Aaper | 11000200 | |
| Levure sèche active | Red Star | ||
| Agar | Fisher Scientific | BP1423 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Compresseur d’air | DeWalt | D55140 | |
| Jus de pomme | Jus de pomme | ||
| Eau de Javel | 1-5 % d’hypochlorite | ||
| World Precision Instruments | 1B100F-4 | ||
| Bouchons de bouteille | Fisher Scientific | AS-277 | |
| Filtres à cellules | BD Falcon | 352350 | |
| Microscope confocal | Olympus | FV1000 | Échantillons imagés à l’aide d’un objectif 20x (UPlanSApo 20x/ 0.75) |
| Applicateur à pointe de coton | Puritan | 19-062614 | |
| Ruban adhésif double face 1/2" | Scotch | ||
| Dumont Tweezers ; Motif #5 ; .05 x .01 mm Pointe | Roboz | RS-5015 | |
| Bouteilles de nourriture pour mouches | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Flacons de nourriture pour mouches | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Pédale | Treadlite II | T-91-S | |
| Gel Caster | Bio-Rad | 1704422 | |
| Plateau de gel | Bio-Rad | 1704436 | |
| Verre Pipette | VWR | 14673-010 | |
| Glycérol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| cristallisé | Acheté à l’épicerie. | ||
| Halocarbon Oil | Lab Scientific, Inc. | FLY-7000 | |
| Source lumineuse | Schott | Ace I | |
| Manipulator Stand World | Precision Instruments | M10 | |
| Micromanipulateur | World Precision Instruments | KITE-R | |
| Extracteur de micropipettes | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Porte-aiguille | World Precision Instruments | MPH310 | |
| Nightsea Filtres Sets | Microscopie électronique Science | SFA-LFS-CY | Pour la visualisation du système d’adaptateur complet YFP |
| Nightsea avec tête lumineuse de couleur bleu royal | Microscopie électronique Science | SFA-RB | Pour la visualisation du pinceau GFP |
| Simply Simmons | Chisel Blender #6 | ||
| Pipette | Fisher Scientific | 13-683C | |
| Pompe pneumatique | World Precision Instruments | PV830 | Ceci est également appelé micro-injecteur ou régulateur de pression. Étant donné que le modèle utilisé dans notre étude n’est plus disponible, il s’agit d’une alternative. |
| Chlorure de potassium | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Phosphate de potassium dibasique | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Cages de collecte de petits embryons | Genesee Scientific | 59-100 | |
| Chlorure de sodium | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Phosphate de sodium dibasique anhydre | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Plaque de base en acier | World Precision Instruments | 5052 | |
| Stéréomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | Utilisé pour la dissection tissulaire. |
| Stéréomicroscope avec source de lumière transmise | Baytronix | Utilisé pour l’injection. | |
| Tegosept (acide p-hydroxybenzoïque, ester méthylique) | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | Tensioactif non ionique |
| Bouchons de flacon | Fisher Scientific | AS-273 |
Références
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate br....
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Réimpressions et autorisations
