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Article de méthode

Analyse de l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique dans le mélanogaster Drosophila

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DOI :

10.3791/60233

⸱

18 septembre 2019

 ,  , 
1Department of Biology, Loyola University Chicago

Dans cet article

Résumé

L'intégrité de la barrière hémato-encéphalique est essentielle à la fonction du système nerveux. Dans Drosophila melanogaster, la barrière hémato-encéphalique est formée par les cellules gliales au cours de l'embryogenèse tardive. Ce protocole décrit les méthodes à essayer pour la formation et l'entretien de barrière hémato-encéphalique dans les embryons de D. melanogaster et les larves de troisième instar.

Résumé

Le développement approprié du système nerveux comprend la formation de la barrière hémato-encéphalique, la barrière de diffusion qui régule étroitement l'accès au système nerveux et protège les tissus neuronaux contre les toxines et les agents pathogènes. Des défauts dans la formation de cette barrière ont été corrélés avec des neuropathies, et la panne de cette barrière a été observée dans beaucoup de maladies neurodegenerative. Par conséquent, il est essentiel d'identifier les gènes qui régulent la formation et le maintien de la barrière hémato-encéphalique pour identifier les cibles thérapeutiques potentielles. Afin de comprendre les rôles exacts de ces gènes dans le développement neuronal, il est nécessaire d'essayer les effets de l'expression génique altérée sur l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique. Beaucoup de molécules qui fonctionnent dans l'établissement de la barrière hémato-encéphalique se sont avérées être conservées à travers les espèces eucaryotes, y compris la mouche des fruits, Drosophila melanogaster. Les mouches des fruits se sont avérées être un excellent système modèle pour examiner les mécanismes moléculaires régulant le développement et la fonction du système nerveux. Ce protocole décrit une procédure étape par étape pour essayer l'intégrité de barrière hémato-encéphalique pendant les étapes embryonnaires et larvaires du développement de D. melanogaster.

Introduction

Pendant le développement, la communication et les interactions de cellule-cellule sont critiques pour établir la structure et la fonction de tissu et d'organe. Dans certains cas, ces interactions cellules-cellules scellent les organes de l'environnement environnant pour assurer le bon fonctionnement des organes. C'est le cas du système nerveux, qui est isolé par la barrière hémato-encéphalique (BBB). La dysfonction du BBB chez l'homme a été liée à des troubles neurologiques, y compris l'épilepsie, et la dégradation de la barrière a été observée dans les maladies neurodégénératives, y compris la sclérose en plaques et la sclérose latérale amyotrophique1. Chez les mammifères, le BBB est formé par des jonctions étroites entre les cellules endothéliales2,3. D'autres animaux, y compris la mouche des fruits, Drosophila melanogaster, ont un BBB composé de cellules gliales. Ces cellules gliales forment une barrière sélectivement perméable pour contrôler le mouvement des nutriments, des déchets, des toxines et des grandes molécules dans et hors du système nerveux4. Cela permet le maintien du gradient électrochimique nécessaire pour tirer des potentiels d'action, permettant la mobilité et la coordination4. Dans D. melanogaster, la glie protège le système nerveux de l'hémolymphique riche en potassium et en forme de sang5.

Dans le système nerveux central (SNC) et le système nerveux périphérique (PNS) de D. melanogaster, deux couches gliales externes, la glie subperineuriale et la glie périnévriale, ainsi qu'un réseau externe de matrice extracellulaire, la lamelle neurale, forment le hémolymphe-cerveau et barrière hémolymphe-nerf6, dénommé le BBB tout au long de cet article. Pendant le développement des glissides subperineuriales deviennent polyploïdes et agrandissent pour entourer le système nerveux5,6,7,8,9,10,11 . Les glies subpériineuses forment des jonctions septates, qui fournissent la principale barrière de diffusion entre l'hémolymphe et le système nerveux5,6,12. Ces jonctions sont moléculairement similaires aux jonctions septates trouvées aux paranodes de la glie myélinisante chez les vertébrés, et elles remplissent la même fonction que les jonctions serrées dans le BBB des mammifères13,14, 15 Annonces , 16 Annonces , 17. Les glissides périnéales divisent, grandissent et s'enroulent autour de la glie subperineuriale pour réguler la diffusion des métabolites et des grandes molécules6,10,18,19. La formation de BBB est complète par 18,5 h après la ponte (AEL) à 25 oC5,8. Des études antérieures ont identifié des gènes qui sont des régulateurs critiques de la formation bBB20,21,22. Pour mieux comprendre les rôles exacts de ces gènes, il est important d'examiner l'effet de la mutation de ces régulateurs potentiels sur l'intégrité de BBB. Alors que des études antérieures ont décrit des approches pour l'analyse de l'intégrité BBB chez les embryons et les larves, un protocole complet pour cet essai n'a pas encore été décrit5,7. Ce protocole étape par étape décrit les méthodes d'analyse de l'intégrité bBB pendant les stades embryonnaires d'In. melanogaster et les troisièmes stades larvaires instar.

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Protocole

1. Collecte d'échantillons

  1. Collection d'embryons
    1. Dans chaque cage de collecte d'embryons, utiliser un minimum de 50 femelles vierges avec 20 à 25 mâles pour les collections. Incuber ces mouches dans une bouteille avec de la semoule de maïs-agar nourriture (Table of Materials) pendant 1/2 jours avant de commencer les collections23.
      REMARQUE: Plus de mouches peuvent être utilisées, mais le rapport femme-mâle doit être maintenu à 2:1.
    2. Pré-chauffer les assiettes d'agar de jus de pomme(tableau 1) à 25 oC pendant la nuit.
      REMARQUE: Ceci est nécessaire pour la mise en scène appropriée des embryons. Si les assiettes se dessèchent rapidement, ajouter un bol avec de l'eau à l'incubateur pour augmenter l'humidité de la chambre.
    3. Anesthésiez les mouches à partir de l'étape 1.1.1 avec le CO2 et transférez les mouches vers une cage de collecte. Placer une plaque d'agar de jus de pomme pré-chauffée avec un petit frottis de pâte de levure à l'extrémité ouverte et fixer à la cage avec la manche rouge (Table des matériaux). Afin d'éliminer les embryons plus âgés, permettre aux mouches de pondre des embryons/œufs sur une plaque d'agar de jus de pomme pendant 1 h à 25 oC.
    4. Retirer la cage de collecte de l'incubateur. Inverser le côté maille cage vers le bas et robinet vole vers le bas de la cage. Remplacer l'agar de jus de pomme par une nouvelle assiette d'agar de jus de pomme préréchauffée par un petit frottis de pâte de levure. Jeter la première assiette.
    5. Laisser les mouches pondre des embryons/œufs sur la nouvelle plaque d'agar de jus de pomme pendant 1 h à 25 oC. Jetez cette plaque après la collecte de 1 h et passez à l'étape suivante pour recueillir les embryons en cas d'injection.
    6. Pour recueillir les embryons de stade tardif 17 (20 à 21 h AEL), permettre aux mouches du génotype désiré à partir des étapes 1.1-1.1.5 de pondre sur une nouvelle plaque d'agar de jus de pomme préchauffée avec un petit frottis de pâte de levure à 25 oC pour 1 h. Plaque d'âge de 19 h dans un incubateur de 25 oC dans un incubateur de 25 oC , les embryons auront donc entre 20 et 21 h au moment de l'imagerie.
      REMARQUE: Cette étape peut être répétée comme souhaité pour plusieurs tours de collecte d'échantillons, d'injection et d'imagerie.
    7. Recueillir les embryons des plaques dans une passoire cellulaire avec un maillage en nylon de 70 m en ajoutant de la saline tamponnée de phosphate (PBS) avec un surfactant nonionique de 0,1 % (PBTx; Tableau 1) pour couvrir la surface de la plaque et desserrer les embryons de la surface à l'aide d'un pinceau.
    8. Décchorionate embryons recueillis dans la passoire cellulaire dans une solution d'eau de Javel de 50 % (tableau 1) dans un plat Petri de 100 mm pendant 5 min avec agitation occasionnelle à température ambiante. Rincer les embryons 3x en faisant tourbillonner la passoire cellulaire dans PBTx dans un plat Petri, en utilisant un plat frais de PBTx à chaque fois.
    9. Si tous les embryons sont du bon génotype, passez directement à l'étape 1.1.10. Si la génération d'embryons du génotype correct nécessite une croix avec des mouches hétérozygotes, sélectionnez des embryons du génotype correct en utilisant la présence ou l'absence de chromosomes d'équilibreur marqués fluorescents. Utilisez un stéréomicroscope avec des capacités fluorescentes pour la sélection du génotype.
      REMARQUE: Chromosomes d'équilibriste marqués de protéines fluorescentes déformées-jaunes; Kruppel-Gal4, protéine fluorescente vert UAS (GFP); et torsion-Gal4, UAS-GFP fonctionnent bien pour la sélection de génotype dans l'embryogenèse tardive (tableau 2)24,25,26.
    10. À l'aide d'une pipette en verre, transférer les embryons dans PBTx sur une dalle de gel agarose de 2 %(tableau 1). Retirer l'excès de liquide avec du papier filtre. Aligner les embryons de 6 à 8 sur la dalle de gel agarose de 2 % avec le côté postérieur vers la droite et le côté dorsal vers le haut (Figure 1B).
      REMARQUE: Le micropyle, le petit trou par lequel le spermatozoïde pénètre dans l'ovule, est situé à l'extrémité antérieure de l'embryon. L'extrémité postérieure est plus arrondie. La trachée apparaît blanche et est localisée doralement dans l'embryon, permettant la distinction des côtés dorsaux et ventrals de l'embryon (Figure 1B).
    11. Préparer une diapositive avec un morceau de ruban adhésif recto-verso. Appuyez fermement sur la diapositive sur le dessus des embryons pour les transférer sur la bande recto-verso.
    12. Descciquer les embryons par incubation à température ambiante pendant 25 min (aucun dessiccant n'est utilisé). Après la dessiccation, recouvrir les embryons d'huile d'halocarbone.
      REMARQUE: Les périodes de dessiccation peuvent varier en fonction de la température, de l'humidité et de la ventilation dans la pièce. La période d'incubation devrait être utilisée pour mettre en place l'appareil pour l'injection et le microscope confocal pour l'imagerie, tel que décrit dans les sections 2 et 3 de ce protocole.
  2. Collection Larvaire
    1. Mettre en place une croix avec 5 à 10 mouches femelles vierges du génotype désiré et la moitié autant de mâles du génotype désiré dans une fiole avec de la nourriture de semoule de maïs-agar et incuber à 25 oC23.
    2. Après 5 à 7 jours, selon le génotype, recueillir les larves errantes troisième instar de la fiole doucement avec des forceps. Rincer les larves dans 1x PBS pour enlever les aliments collés aux larves. Transférer les larves dans une plaque d'agar de jus de pomme pour le génotypage tel que décrit à l'étape 1.1.9 si nécessaire.
    3. Rouler les larves sur un tissu à l'aide d'un pinceau pour les sécher. Transférer 6 à 8 larves sur une lame préparée à l'aide de ruban adhésif recto-verso à l'aide de forceps.

2. Préparation des aiguilles et de l'injection de spécimens

  1. Tirez des aiguilles sur un puller micropipette avant le lancement de ce protocole. Fixez les tubes capillaires dans le pulleur d'aiguille et tirez selon la forme et les paramètres standard de l'aiguille pour les injections de D. melanogaster (tableau 3)27. Conserver les aiguilles dans un plat Petri en les ancrant dans l'argile jusqu'à ce qu'elles soient utilisées pour l'injection.
  2. Chargez une aiguille de 5 l de 10 kDa dextran conjuguée à la sulforhodamine 101 chlorure d'acide (Tableau des matériaux) à l'aide d'une tuyauterie à chargement de gel de 20 l pendant la période de dessiccation de 25 minutes pour les embryons (étape 1.1.12), ou immédiatement après le transfert de larves à la glissière (étape 1.2.3).
  3. Chargez l'aiguille dans un support d'aiguille et placez-la dans un micromanipulateur fixé à une base en acier (Tableau des matériaux).
    REMARQUE: L'aiguille doit être presque parallèle au stade du microscope pour l'injection d'embryons et légèrement inclinée vers le bas pour les injections larvaires.
  4. Définir l'appareil d'injection (Table des Matériaux) à 50 psi, 5 à 10 ms avec une gamme de 10.
    REMARQUE: Il peut être nécessaire de modifier ces paramètres pour l'appareil d'injection particulier utilisé.
  5. Placez la glissière sur scène et brossez le bord de l'aiguille contre le bord du ruban à double face à un angle de 45 degrés pour créer une pointe inclinée et brisée.
    REMARQUE: Pour les embryons, il suffit de casser la pointe assez pour permettre l'écoulement de la dextran 10 kDa. Une aiguille parfaite a une pointe légèrement inclinée et seule une petite goutte de colorant sortira à chaque injection. Pour les larves, il est nécessaire de briser la pointe plus, mais avec une pointe inclinée pour pénétrer la paroi du corps larvaire. Une plus grande goutte de colorant sortira.
  6. Pompez la pédale jusqu'à ce que le colorant soit à l'extrémité de l'aiguille.
  7. Alignez l'aiguille de sorte qu'elle soit parallèle à l'embryon ou inclinée légèrement vers le bas vers la larve.
  8. Déplacez l'aiguille pour percer l'extrémité postérieure du spécimen et injectez le spécimen en pompant la pédale. Injecter 2 nL de colorant dans les embryons, et 220 nL de colorant dans les larves.
    REMARQUE: L'embryon ou la larve devrait inonder de colorant si l'injection est réussie.
  9. Notez l'heure de l'injection à des fins d'incubation. Incuber les embryons pendant 10 min à température ambiante. Incuber les larves pendant 30 min à température ambiante.
  10. Continuer sur la diapositive pour injecter d'autres spécimens, en notant l'heure de l'injection pour chaque spécimen.
    REMARQUE: Selon la vitesse à laquelle des étapes ultérieures de dissection et d'imagerie peuvent être effectuées, 4 à 8 spécimens peuvent être injectés à la fois.

3. Préparation d'échantillons pour l'imagerie

  1. Imagerie d'embryons
    1. Après l'injection, préparer les embryons à l'imagerie. Appliquer de la gelée de pétrole avec un applicateur à pointe de coton sur les côtés droit et gauche des échantillons sur la glissière comme espaceur pour éviter les dommages aux embryons lors du placement de la glissière.
    2. Échantillons d'images à l'aide d'un microscope confocal dans toute la profondeur de l'embryon avec un objectif 20x. Calculer le pourcentage d'échantillons totaux avec colorant observé dans le cordon nerveux ventral (VNC) à l'aide de l'équation suivante : % des échantillons avec bBB compromis - Nombre d'échantillons avec accumulation de colorant dans le VNC/nombre total d'échantillons analysés.
  2. Dissection et imagerie des larves
    1. Préparer à l'avance les diapositives pour les échantillons larvaires. Mont deux couvercles espacés d'environ 0,5 cm à la glissière avec du vernis à ongles.
      REMARQUE: Les couvertures fonctionnent comme des espaceurs pour le cerveau, de sorte qu'il n'est pas endommagé pendant le processus de montage.
    2. Après l'incubation de 30 min, disséquer les larves en 1x PBS directement sur la diapositive qui sera utilisée en imagerie. Tout d'abord, utilisez une paire de forceps pour saisir la larve à mi-chemin dans le corps larvaire, et utilisez une deuxième paire de forceps pour séparer les moitiés antérieures et postérieures de la larve.
    3. Ensuite, utilisez une paire de forceps pour saisir la région antérieure aux crochets buccaux, et utilisez une deuxième paire de forceps pour inverser la paroi du corps sur la pointe des forceps saisissant les crochets de la bouche. Le cerveau et le VNC seront exposés.
    4. Séparez le cerveau et le VNC de la paroi du corps en coupant les nerfs, et retirez la paroi du corps de la glissière (Figure 1C,D). Retirer les disques imaginaires si désiré.
    5. Couvrir l'échantillon de 10 là de 80 % de glycérol et placer une feuille de couverture sur l'échantillon pour l'imagerie.
    6. Image à travers la profondeur du tissu du système nerveux à l'aide d'un objectif 20x. Calculer le pourcentage d'échantillons totaux avec colorant observé dans le VNC.

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Résultats

Les méthodes décrites ici permettent de visualiser l'intégrité du BBB dans l'ensemble du SNC chez les embryons et larves de D. melanogaster (Figure 1). À l'achèvement de la formation de BBB en fin d'embryogenèse, le BBB fonctionne pour exclure de grandes molécules du cerveau et VNC5. Ce protocole tire parti de cette fonction pour essayer la formation de BBB. Lorsque des embryons de type sauvage (Oregon R) de type avancé 17 (20 à 21 h) ont été injectés avec 10...

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Discussion

Ce protocole fournit une description complète des étapes nécessaires pour l'analyse de l'intégrité bBB au cours des derniers stades embryonnaires et troisièmes larvaires instar du développement de D. melanogaster. Des approches similaires ont été décrites ailleurs pour mettre en valeur l'intégrité de la BBB pendant le développement, ainsi que dans les stades adultes5,7,29,30. Cependant...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Les auteurs remercient le Dr F. Bryan Pickett et le Dr Rodney Dale pour l'utilisation de l'équipement pour l'injection. Ces travaux ont été financés par le financement de la recherche de l'Université Loyola de Chicago à M.D., D.T., et J.J.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
10 kDa de chlorure d’acide de sulforhodamine 101 (Texas Red) DextranThermoFisher ScientificD1863Le dextran doit être dilué dans du ddH2O autoclavé à une concentration de 25 mg/mL.
20 &mu ; L Pointes de pipette à chargement de gelEppendorf22351656
100 % éthanol (200 proof)Pharmco-Aaper11000200
Levure sèche activeRed Star
AgarFisher ScientificBP1423
AgaroseFisher ScientificBP160-500
Compresseur d’airDeWaltD55140
Jus de pommeJus de pomme
Eau de Javel1-5 % d’hypochlorite
World Precision Instruments1B100F-4
Bouchons de bouteilleFisher ScientificAS-277
Filtres à cellulesBD Falcon352350
Microscope confocalOlympusFV1000Échantillons imagés à l’aide d’un objectif 20x (UPlanSApo 20x/ 0.75)
Applicateur à pointe de cotonPuritan19-062614
Ruban adhésif double face 1/2"Scotch
Dumont Tweezers ; Motif #5 ; .05 x .01 mm PointeRobozRS-5015
Bouteilles de nourriture pour mouchesFisher ScientificAS-355
Flacons de nourriture pour mouchesFisher ScientificAS-515
PédaleTreadlite IIT-91-S
Gel CasterBio-Rad1704422
Plateau de gelBio-Rad1704436
Verre PipetteVWR14673-010
GlycérolFisher ScientificBP229-1
cristalliséAcheté à l’épicerie.
Halocarbon OilLab Scientific, Inc.FLY-7000
Source lumineuseSchottAce I
Manipulator Stand WorldPrecision InstrumentsM10
MicromanipulateurWorld Precision InstrumentsKITE-R
Extracteur de micropipettesSutter Instrument Co.P-97
Porte-aiguilleWorld Precision InstrumentsMPH310
Nightsea Filtres SetsMicroscopie électronique ScienceSFA-LFS-CYPour la visualisation du système d’adaptateur complet YFP
Nightsea avec tête lumineuse de couleur bleu royalMicroscopie électronique ScienceSFA-RBPour la visualisation du pinceau GFP
Simply SimmonsChisel Blender #6
PipetteFisher Scientific13-683C
Pompe pneumatiqueWorld Precision InstrumentsPV830Ceci est également appelé micro-injecteur ou régulateur de pression. Étant donné que le modèle utilisé dans notre étude n’est plus disponible, il s’agit d’une alternative.
Chlorure de potassiumFisher ScientificBP366-500
Phosphate de potassium dibasiqueFisher ScientificBP363-500
Cages de collecte de petits embryonsGenesee Scientific59-100
Chlorure de sodiumFisher ScientificBP358-212
Phosphate de sodium dibasique anhydreFisher ScientificBP332-500
Plaque de base en acierWorld Precision Instruments5052
StéréomicroscopeCarl ZeissStemi 2000Utilisé pour la dissection tissulaire.
Stéréomicroscope avec source de lumière transmiseBaytronixUtilisé pour l’injection.
Tegosept (acide p-hydroxybenzoïque, ester méthylique)Genesee Scientific20-258
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500Tensioactif non ionique
Bouchons de flaconFisher ScientificAS-273
naturel Mott’s domestique Capillaires en verre borosilicaté Sucre

Références

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