Article de méthode

Détermination des relations d’auto et d’intercompatibilité dans les a abricots combinant la pollinisation manuelle, la microscopie et les analyses génétiques

DOI :

10.3791/60241

⸱

16 juin 2020

 ,  ,  , 
1Unidad de Hortofruticultura, Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), 2Instituto Agroalimentario de Aragón - IA2 (CITA-Universidad de Zaragoza), 3Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea La Mayora (IHSM La Mayora-UMA-CSIC)

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons une méthodologie pour établir les exigences de pollinisation des cultivarsd’abricot (Prunus armeniaca L.) combinant la détermination de l’auto-compatibilité par microscopie de fluorescence avec l’identification du S-génotype par analyse pcr.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’autocompatibilité dans rosaceae est déterminée par un système d’auto-incompatibilité gametophytique (GSI) qui est principalement contrôlé par le locus multiallelique S. Dans l’abricot, la détermination des relations d’auto-compatibilité et d’intercompatibilité est de plus en plus importante, puisque la libération d’un nombre important de nouveaux cultivars a entraîné l’augmentation des cultivars ayant des exigences de pollinisation inconnues. Ici, nous décrivons une méthodologie qui combine la détermination de l’auto-compatibilité par pollinisation manuelle et microscopie avec l’identification du génotype Spar l’analyse pcr. Pour la détermination de l’auto-compatibilité, les fleurs à l’étape du ballon de chaque cultivar ont été recueillies dans le champ, pollinisées à la main en laboratoire, fixes et tachées de bleu aniline pour l’observation du comportement du tube pollin sous la microscopie de fluorescence. Pour l’établissement de relations d’incompatibilité entre les cultivars, Sl’ADN de chaque cultivar a été extrait de jeunes feuilles et S-allèles ont été identifiés par PCR. Cette approche permet d’établir des groupes d’incompatibilité et d’élucider les relations d’incompatibilité entre les cultivars, ce qui fournit une information précieuse pour choisir les pollinisateurs appropriés dans la conception de nouveaux vergers et pour sélectionner les parents appropriés dans les programmes d’élevage.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’autocompatibilité est une stratégie des plantes à fleurs pour prévenir l’autopollinisation et promouvoir la croisement1. Dans rosaceae, ce mécanisme est déterminé par un système d’auto-incompatibilité gametophytique (GSI) qui est principalement contrôlé par le locus multiallelique S2. Dans le style, le gène RNase code le déterminant sylar S-s,un RNase3, tandis qu’une protéine F-box, qui détermine le déterminant du pollen S,est codifiée par le gène4de la SFB . L’interaction d’auto-incompatibilité a lieu par l’inhibition de la croissance du tube pollinique le long du style empêchant la fertilisation de l’ovule5,6.

En abricot, un renouvellement variétal a eu lieu dans le monde entier au cours des deux dernières décennies7,8. Cette introduction d’un nombre important de nouveaux cultivars, provenant de différents programmes d’élevage publics et privés, a entraîné l’augmentation des cultivars d’abricots ayant des besoins inconnus de pollinisation8.

Différentes méthodologies ont été utilisées pour déterminer les exigences de pollinisation dans l’abricot. Sur le terrain, la compatibilité de soi peut être établie par des pollinisations contrôlées dans des arbres en cage ou dans des fleurs émasculées et en enregistrant par la suite le pourcentage de fruits ensemble9,10,11,12. En outre, des pollinisations contrôlées ont été effectuées en laboratoire par culture semi-in vivo des fleurs et l’analyse du comportement du tube pollinique sous microscopie de fluorescence8,13,14,15,16,17. Récemment, les techniques moléculaires, telles que l’analyse et le séquençage du PCR, ont permis la caractérisation des relations d’incompatibilité basées sur l’étude des gènes RNase et SFB 18,19. En abricot, trente-trois S-allèles ont été signalés (S1 à S20, S22 à S30, S52, S53, Sv, Sx), y compris un allèle lié à l’auto-compatibilité (Sc)12,18,20,21,22,23,24. Jusqu’à présent, 26 groupes d’incompatibilité ont été stablis dans cette espèce selon le S-génotype8,9,17,25,26,27. Les cultivars avec les mêmes allèles Ssont inter-incompatibles, tandis que les cultivars avec au moins un S-allèledifférent et, par conséquent, répartis dans différents groupes incompatibles, sont intercompatibles.

Pour définir les exigences de pollinisation des cultivars d’abricots, nous décrivons une méthodologie qui combine la détermination de l’auto-compatibilité par microscopie de fluorescence avec l’identification du génotype Spar analyse pcr dans les cultivars d’abricot. Cette approche permet d’établir des groupes d’incompatibilité et d’élucider les relations d’incompatibilité entre les cultivars.

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Protocole

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1. Détermination de la compatibilité autonome

  1. Goûtez les fleurs dans le champ. Il est nécessaire de recueillir les fleurs au stade du ballon ( Figure 1A), correspondant àl’étape58 sur l’échelle BBCH pour l’abricot28, pour éviter la pollinisation préalable non désirée.
  2. Autopollinisations en laboratoire
    1. Retirez les anths des fleurs au stade du ballon et placez-les sur un morceau de papier pour les sécher à température de laboratoire.
    2. Après 24 h, tamiser les grains de pollen à l’aide d’un maillage fin (0,26 mm) (figure 1B).
    3. Émasculer un groupe de 30 fleurs au même stade de ballon pour chaque auto-pollinisation et pollinisation croisée et placer les pistils sur la mousse de fleuriste dans l’eau à température de laboratoire (Figure 1C).
    4. Polliniser les pistils à la main à l’aide d’un pinceau avec du pollen provenant de fleurs du même cultivar 24 h après l’émasculation. En outre, polliniser un autre ensemble de pistils de chaque cultivar avec le pollen des fleurs d’un pollinisateur compatible comme contrôle (Figure 1D).
    5. Après 72 h, fixer les pistils dans une solution fixative d’éthanol/acide acétique (3:1) pendant au moins 24 h à 4 °C29. Ensuite, jetez le fixatif et ajoutez 75% d’éthanol en veillant à ce que les échantillons soient complètement immergés dans la solution. Les échantillons peuvent être conservés dans cette solution à 4 °C jusqu’à l’utilisation8,17,30,31,32.
  3. Évaluation de la viabilité du pollen par germination in vitro de pollen
    1. Pour préparer le milieu de germination, poids 25 g de saccharose, 0,075 g d’acide borique (H3BO3) et 0,075 g de nitrate de calcium (Ca(NO3)2)33.
    2. Ajouter les composants du milieu dans 250 mL d’eau distillée et dissoudre complètement.
    3. Solidifier le milieu en ajoutant 2 g d’agarose et mélanger en tourbillonnant.
    4. Vérifiez le pH du milieu à l’aide d’un pH mètre et réglez la valeur à 7,0 avec la solution NaOH ou HCl.
    5. Autoclaver le mélange pour stériliser le milieu.
    6. Après l’autoclavage, refroidir le milieu et le distribuer dans les plats Petri dans un capot stérile de flux laminaire.
    7. Dispersez les grains de pollen des mêmes cultivars utilisés pour les pollinisations contrôlées dans le milieu de germination du pollen solidifié et observez-les au microscope après 24 h6.
      REMARQUE : Pour stériliser le capot d’écoulement laminaire, nettoyez la surface avec 70 % d’éthanol et allumez la lampe UV pendant 10 min.
    8. Conserver les plats Petri au réfrigérateur à 4 °C jusqu’à l’utilisation.
  4. Observations de microscopie
    1. Laver les pistils trois fois pendant 1 h avec de l’eau distillée et les laisser dans 5% de sulfite de sodium à 4 °C. Après 24 h, autoclavez-les à 1 kg/cm2 pendant 10 min de sulfite de sodium pour adoucir les tissus34.
    2. Placez les pistils autoclaved sur une lame de verre et, à l’aide d’un scalpel, retirez les trichomes autour de l’ovaire pour obtenir une meilleure visualisation des tubes de pollen. Ensuite, écraser les pistils avec un verre à couverture.
    3. Préparer 0,1% (v/v) tache bleue aniline: mélanger 0,1 mL de bleu aniline en 100 mL de 0,1 N phosphate de potassium tribasique (K3PO4). Appliquer une goutte de bleu aniline sur les préparations pour tacher les dépôts d’callose pendant la croissance du tube pollinique.
    4. Observez les tubes de pollen le long du style au microscope avec l’épifluorescence UV à l’aide de 340-380 filtres à bande et 425 filtres longpass.

2. Extraction d’ADN

  1. Échantillonner 2-3 feuilles dans le champ au printemps. Il est recommandé d’échantillonner les feuilles à de jeunes stades puisque l’ADN obtenu est de meilleure qualité et des niveaux inférieurs de composés phénoliques par rapport aux vieilles feuilles.
  2. Extraire l’ADN génomique suivant les étapes décrites dans un kit disponible dans le commerce (voir tableau des matériaux).
  3. Analyser la quantité et la qualité des concentrations d’ADN à l’aide du spectrophotomètre UV-vis (260 nm).

3. Identification s-allèle

  1. Configuration des réactions PCR
    1. Préparer une dilution de 50 ng/μL dans l’eau distillée de chaque échantillon d’extraction d’ADN.
    2. Décongeler les réactifs PCR lentement et les garder sur la glace. Laisser la polymérase d’ADN dans le congélateur jusqu’à ce que nécessaire.
    3. Préparer les réactions d’amplification à l’aide des différentes combinaisons d’amorces. Créez le mélange de réactions PCR en combinant les composants du tableau 1. Vortex la réaction PCR mélanger bien et de distribuer le volume indiqué pour les différentes combinaisons d’amorces à chaque puits de la plaque PCR. Ensuite, ajouter 1 μL de la dilution de l’ADN dans chaque puits.
    4. Placez la plaque PCR dans le thermocycleur et exécutez le programme PCR correspondant indiqué dans le tableau 1.
  2. Analyser les fragments amplifiés. Il existe principalement deux façons différentes d’analyser les fragments amplifiés pcr : l’électrophorèse capillaire (CE) avec des amorces fluorescentes ou comme amplisons les amypplicons de l’électrophorèse de gel agarose avec des amorces non étiquetées.
    1. Électrophorèse capillaire
      1. Pour préparer le tampon de chargement, mélanger 35 μL de formamide déionisé avec 0,45 μL de norme de dimensionnement étiquetée. Vortex le réactif pour bien mélanger, puis distribuer 35,5 μL dans le puits de la plaque du lecteur.
      2. Ajouter 1 μL du produit PCR dans le puits. En outre, ajouter une goutte d’huile minérale pour prévenir l’évaporation de l’eau.
      3. Préparer la plaque de séparation en ajoutant un tampon de séparation.
      4. Utilisez le logiciel commercial inclus avec l’analyseur de gènes (voir Tableau des matériaux). Créez une nouvelle plaque d’échantillonnage et enregistrez les noms d’échantillons pour tous les puits de la plaque.
      5. Sélectionnez la méthode d’analyse. Dans ce cas, dénaturer les échantillons à 90 °C pendant 120 s, injecter à 2,0 kV pour 30 s et les séparer à 6,0 kV pendant 35 min.
      6. Insérez les deux plaques dans l’analyseur de gènes. Remplissez le tableau capillaire d’eau distillée.
      7. Chargez le gel breveté de polyacrylamide linéaire (LPA). Enfin, cliquez sur Exécuter.
    2. Gel Électrophorèse
      1. Préparer un gel agarose de 1 % en ajoutant 1,5 g d’agarose de qualité biologie moléculaire dans 150 mL d’électrophorèse TAE (Tris-acétate-EDTA) tampon en cours d’exécution (40 mM Tris, acide acétique de 20 mM et 1 mM EDTA à pH 8,0). Dissoudre l’agarose par chauffage au micro-ondes pendant 2-3 min.
      2. Pour visualiser l’ADN, ajouter 4 μL d’une tache d’acide nucléique (voir tableau des matériaux) et mélanger doucement.
      3. Ajouter un peigne à gel, avec suffisamment de puits pour les échelles, les contrôles et les échantillons, dans un plateau de gel. Ensuite, verser lentement le mélange dans le milieu du plateau de gel et éviter les bulles.
      4. Laisser refroidir le gel pendant 30-45 min à température ambiante jusqu’à ce que le gel se solidifie complètement. Introduire le gel dans la chambre électrophorèse, enlever le peigne à gel et remplir la chambre avec suffisamment de tampon TAE 1x pour couvrir le gel.
        REMARQUE : Vérifiez le placement du gel. Les puits doivent être placés près du poteau négatif puisque l’ADN chargé négativement migre vers la cathode.
      5. Ajouter 5 μL de tampon de chargement (0,1 % (v/v) bleu bromophénol) aux produits PCR et bien mélanger.
      6. Pour estimer la taille des bandes, chargez 5 μL de l’échelle de poids moléculaire de l’ADN(voir tableau des matériaux).
      7. Chargez les échantillons dans les puits supplémentaires du gel.
      8. Une fois que tous les échantillons et l’échelle de poids moléculaire de l’ADN sont chargés, exécutez le gel à 90 V pendant 1-1,5 h, jusqu’à ce que la ligne de colorant bleu soit approximativement à 75% de la longueur du gel.
      9. Visualisez les bandes dans un transilluminateur pour les acides nucléiques.

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Résultats

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Les études de pollinisation de l’abricot nécessitent l’utilisation de fleurs au stade avancé du ballon un jour avant l’anthèse (Figure 1A). Cette étape est considérée comme la plus favorable à la fois pour la collection de pollen et de pistil, puisque les structures florales sont presque matures, mais la déhiscence anther n’a pas encore eu lieu. Cela empêche l’interférence du pollen indésirable, non seulement du pollen de la même fleur, mais aussi d’autres fleurs, puisque le...

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Discussion

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Traditionnellement, la plupart des cultivars européens d’abricots commerciaux étaient auto-compatibles36. Néanmoins, l’utilisation de cultivars auto-incompatibles nord-américains comme parents dans les programmes d’élevage au cours des dernières décennies a entraîné la libération d’un nombre croissant de nouveaux cultivars auto-incompatibles ayant des exigences de pollinisation inconnues7,8,37. Ainsi, la ...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Cette recherche a été financée par Ministerio de Ciencia, Innovacion y Universidades-European Regional Development Fund, Union européenne (AGL2016-77267-R, et AGL2015-74071-JIN); Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (DFP2015-00015-00, RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón-European Social Fund, Union européenne (Grupo Consolidado A12_17R), Fundación Biodiversidad et Agroseguro S.A.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Agarose D1 Low EEOConda8010.22
BIOTAQ Kit ADN polyméraseBiolineBIO-21060
Microscope à champ clairLeica MicrosystemsDM2500
CEQ System SoftwareBeckman Coulter
DNeasy Plant Mini KitQIAGEN69106
dNTP Set, 4 x 25 µ ; molBiolineBIO-39025
GenomeLab Kit standard de taille d’ADN - 400Beckman Coulter608098
Système d’analyse génétique GenomeLab GeXPBeckman Coulter
GenomeLab Tampon de séparationBeckman Coulter608012
GenomeLab Gel de séparation LPA-1Beckman Coulter391438
HyperLadder 100bpBiolineBIO-33029
HyperLadder 1kbBiolineBIO-33025
Système d’analyse d’imagesLeica Microsystems
Imageur moléculaire VersaDoc MP 4000 system  ;Bio-Rad170-8640
NanoDrop One SpectrophotomètreThermo Fisher Scientific13-400-518
pH-Mètre BASIC 20Crison
Phusion  ; Kit PCR haute fidélitéThermo Fisher ScientificF553S Bloc d’alimentation
P 25 TBiometra
Primer ForwardIsogen Life Science
Primer ReverseIsogen Life Science
Quantité One SoftwareBio-Rad
Microscope stéréoscopiqueLeica MicrosystemsMZ-16
Sous-cellule GTBio-Rad
SYBR Gel d’ADN sûrColoration Thermo Fisher ScientificS33102
T100 ThermocycleurBio-Rad1861096
Taq DNA polyméraseQIAGEN201203
Vertical Stand AutoclaveJP Selecta

Références

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Auto incompatibilitMicroscopie fluorescenceAnalyse par PCRIdentification de l all le Slectrophor se capillaireColoration au bleu d anilineCroissance du tube polliniqueGroupes d incompatibilitCultivars d abricotier

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