Normalisation d'une méthode non létale pour caractériser l'état reproducteur et le développement larvaire des moules d'eau douce (Bivalvia: Unionida)

Summary

La conservation des moules d'eau douce dépend de la surveillance des modèles et des processus de reproduction des espèces. Cette étude normalise un protocole non létal pour l'échantillonnage du contenu des branchies, caractérisant le développement larvaire et fournissant un référentiel numérique pour les données recueillies. Ce paquet de base de données de protocolesera un outil important pour les chercheurs de moules dans le rétablissement des espèces menacées.

Abstract

Il est essentiel de surveiller activement le moment, le développement et les modèles de reproduction des espèces en voie de disparition pour gérer le rétablissement de la population. Les moules d'eau douce sont parmi les organismes les plus menacés au monde, mais l'information sur le développement larvaire précoce (glochidial) et les périodes de couvée font encore défaut pour de nombreuses espèces. Des études antérieures ont porté sur l'étape complexe de l'histoire de la vie où les moules femelles sont prêtes à parasiter les poissons hôtes, mais peu d'études ont porté sur la période de couvée et le moment du développement larvaire. Le protocole décrit ici permet aux chercheurs d'évaluer non mortellement l'état de gravité des moules femelles. Les résultats de cette étude montrent que cette méthode n'affecte pas la capacité d'une moule femelle à rester gravid ou à redevenir gravid après l'échantillonnage. L'avantage de cette méthode peut permettre son utilisation sur des espèces menacées ou en voie de disparition au niveau fédéral ou sur d'autres populations à forte préoccupation en matière de conservation. Ce protocole peut être adapté pour une utilisation sur des individus préservés ou vivants et a été testé sur une variété d'espèces de moules. La base de données fournie est un référentiel pour une vaste gamme d'informations sur le calendrier des habitudes de reproduction et facilitera les futurs efforts de recherche, de conservation et de rétablissement des moules d'eau douce.

Introduction

La persistance des populations dans les systèmes d'eau douce dépend du succès de la reproduction et du recrutement. Pour les organismes parasites, l'identification des subtilités du cycle de vie (p. ex., les étapes du développement larvaire et les stratégies d'attraction de l'hôte) peut donner un aperçu des habitudes de reproduction d'un organisme et des processus critiques qui influencent le recrutement. Ces informations deviennent importantes lorsque des espèces sont menacées, et un recrutement efficace est nécessaire pour soutenir les populations restantes, ou si le rétablissement nécessite l'utilisation de la propagation en captivité pour rétablir les populations disparues.

Les moules d'eau douce (Bivalvia: Unionida) sont considérées comme l'un des groupes d'organismes les plus menacés dans le monde et une compilation d'habitudes de reproduction spécifiques aux espèces pourrait contribuer aux efforts de recherche^{1,2,3 ,4,5}. Avec plus de 800 espèces actuellement reconnues réparties à travers le monde, les moules d'eau douce ont des points chauds de la diversité en Amérique du Nord et du Sud, et en Asie du Sud-Est, mais l'information essentielle sur l'histoire de la vie est inconnue pour de nombreuses espèces^{2, 5,6,7}. Les familles de cet ordre se caractérisent par des stades larvaires parasites qui complètent la métamorphose en jeunes en liberté pendant l'attachement à un hôte^7,8. Cette étape unique de l'histoire de la vie contribue à la biodiversité dans les systèmes d'eau douce, qui sont actuellement en crise⁹. Des niveaux élevés d'imperilment peuvent être attribués à de nombreuses menaces anthropiques, y compris la pollution des cours d'eau, l'altération et la destruction de l'habitat, la réduction de l'abondance et de la diversité des poissons hôtes, et l'introduction d'espèces envahissantes^{1, 10}. En tant que filtreurs benthiques, les moules s'enfouissent dans le substrat et sont sensibles aux contaminants et aux polluants qui s'écoulent dans le bassin versant¹¹. Le rétablissement des espèces de moules est pertinent car ils fournissent une grande variété de services écosystémiques, y compris la séquestration du carbone, une source de nourriture et la purification de l'eau par l'alimentation par filtre¹¹. En outre, les moules ont été trouvés pour indiquer la santé de l'écosystème, promouvoir la biodiversité, et à son tour, augmenter la résilience d'un écosystème¹².

De nombreuses études sur les moules d'eau douce se sont concentrées sur l'étude des exigences relatives à l'histoire de la vie précoce afin de mieux éclairer les évaluations de l'état des espèces et les stratégies de gestion. Les familles de moules d'eau douce pertinentes à cette étude (p. ex. Hyriidae, Margaritiferidae, Unionidae) ont une stratégie unique d'histoire de la vie où les larves de la couvée femelle (glochidia) dans leurs branchies marsupiales⁸. Grâce à une variété de stratégies, la moule femelle expulse les glochidies matures des branchies marsupiales pour parasiter un hôte vertébré avec glochidia¹³. La recherche sur le développement glochidial dans les branchies a été modifiée à partir d'une technique utilisant des seringues hypodermiques pour échantillonner le fluide gonadique des moules vivantes et évaluer la production de gamètes^14,15,16. Comme les chercheurs ont validé cette méthodologie non létale pour l'échantillonnage des gonades, elle a été adaptée pour l'échantillonnage des branchies marsupiales afin d'évaluer le développement de la couvée^15,16. Le développement de la couvée peut être utilisé pour déchiffrer les relations phylogénétiques, car certaines espèces de moules peuvent couver la glochidie dans seulement les deux branchies extérieures (ectobranchus), seulement les deux branchies intérieures (endobranchus), ou dans les quatre branchies (tétrabranchus), mais cette caractéristique n'est pas connu pour chaque espèce¹⁷. Les modèles de couvée ont déjà été utilisés pour classer les espèces de moules selon que les moules femelles couvent les glochidies pendant l'hiver (bradytique) ou pendant une courte période en été (tachytique)¹⁸. L'hivernage des couvées de moules a été soutenu lorsque le cycle reproducteur d'Anodonta a été étudié¹⁹. Cependant, la biologie de la reproduction de base a été étudiée plus en profondeur au fil des ans et a constaté que cette dichotomie était une généralisation brute et les périodes de couvée de certaines espèces sont beaucoup plus complexes que prévu à l'origine^20,21. Par exemple, des espèces du genre Hyridella (famille Hyriidae), Glebula et Elliptio (famille Unionidae) ont été observées avec plus de trois couvées par saison de reproduction^{22,23, 24}. La complexité des habitudes de reproduction propres à une espèce, et parfois même à la population^{de 20,}a entraîné une lacune dans les connaissances sur le moment et la durée de la couvée, et le nombre de couvées qu'une moule femelle peut produire.

Bien que des seringues hypodermiques aient été utilisées pour extraire le contenu des branchies, la déclaration des résultats est compliquée en raison de l'absence de normalisation pour assurer des résultats comparables dans toutes les études. Auparavant, quatre stades de développement de la glochidie (c.-à-d. ovule, embryon, immature, entièrement développé) ont été identifiés chez Unionidae mais n'ont pas été adoptés dans la procédure standard^16,25,26. D'autres études observant des membres de Margaritiferidae ont substitué la classification de « glochidia immature » à « glochidia en développement », menant à la confusion potentielle^27,28. Le manque de cohérence dans la caractérisation des différents stades de développement larvaire a laissé de nombreux chercheurs pour décrire généralement les femelles couvées comme «gravid», ce qui n'englobe pas les subtilités du développement larvaire. Les études d'histoire de la vie menant des essais d'hôte-poisson ont donné la priorité au besoin pour des femelles gravid avec le glochidia entièrement développé, mais cette information est dispersée par la littérature éditée et non éditée^29,30. À l'heure actuelle, les données font défaut sur les habitudes de reproduction de nombreuses espèces de moules, y compris le moment de la transition entre l'œuf, les glochidies immatures et les glochidies entièrement développées prêtes à être jointes aux hôtes. Pour la plupart des espèces, on ne sait pas combien de temps les femelles couvent la glochidie et à quelle vitesse les œufs fécondés se développent pleinement. Les lacunes en matière de connaissances sont souvent plus importantes pour les espèces préoccupantes pour la conservation, ce qui présente la nécessité d'une méthode normalisée d'extraction du contenu branchial qui a été testée pour des effets non létaux et qui peut être promue à la communauté scientifique pour compléter méthodes de collecte de données, sans constituer une menace pour les populations protégées^24,31,32.

Cette étude avait trois objectifs : 1) formaliser une technique d'échantillonnage branchial et la tester pour les effets mortels et non létaux sur les moules femelles in situ, 2) caractériser les différentes étapes du développement du glochidial et décrire une méthode normalisée d'identification et de signaler les différentes étapes larvaires, et 3) créer un référentiel public pour les données recueillies. Les enquêtes sur le terrain, les projets de surveillance à long terme et les collections muséales représentent tous des possibilités de mise en œuvre du protocole décrit ici et des données supplémentaires à recueillir pour un ensemble plus large d'intérêts. Le protocole formalisé comprend des visuels et des descriptions de caractères pour différencier chaque étape du développement larvaire. En normalisant les catégories, les résultats recueillis peuvent être comparés entre tous les occurrences et toutes les espèces. Une fois les données recueillies, toutes peuvent être soumises à l'Almanach de gravidite de la moule d'eau douce (FMGA), qui est une base de données pour les informations de gravidité recueillies à l'aide de ce protocole. Un produit final pour stocker et compiler toutes les informations de gravidité recueillies fournira un outil de recherche pour faciliter les efforts futurs de recherche, de conservation et de rétablissement. L'intégration de cette méthodologie dans divers projets de moules et la soumission de données à la FMGA élargiraient l'étendue des connaissances sur l'état de gravité des espèces de moules tout au long de l'année. En tant que groupe d'organismes très menacé, ce protocole et la base de données qui en résulte sur les habitudes de reproduction des moules d'eau douce sont essentiels pour comprendre la dynamique des populations et faciliter la conservation de ces espèces.

Protocol

1. Collection féminine Gravid

REMARQUE : Référenceau Protocole³³ de l'Étude sur les moules d'eau douce du Fish and Wildlife Service pour obtenir des conseils sur la façon d'étudier adéquatement un site d'échantillonnage d'espèces menacées ou en voie de disparition. Des permis fédéraux appropriés doivent être obtenus avant la collecte sur le terrain d'espèces protégées et les permis d'État pour toutes les espèces présentes.

1. Recueillir les moules vivantes sur le terrain à l'aide de méthodes tactiles visuelles (étape 1.2) ou utiliser des spécimens conservés d'un musée (étape 1.3).
   REMARQUE : Il est important de garder les moules vivantes fraîches et humides après la collecte afin de prévenir la dessiccation et de réduire le stress, et une manipulation minimale des moules gravid est importante pour éviter que les femelles libèrent prématurément le contenu des branchies³⁴.
2. Évaluer la gravidité féminine soit par inspection visuelle pendant la collecte (p. ex., présence de leurre de manteau, de conglutinates, etc.) ou par inspection visuelle après la collecte (p. ex., indiscrets assez pour regarder à l'intérieur et voir si les branchies sont gonflées, voir Figure 1).
   REMARQUE : Les espèces varient dans la façon dont les glochidies sont couvées dans les branchies marsupiales, car parfois seules les deux branchies extérieures (ectobranchus), seules les deux branchies intérieures (endobranchus) ou les quatre branchies (tétragées) sont marsupiales¹⁷. Le protocole peut être mis en pause ici, et les femelles gravid peuvent être transportées au laboratoire pour l'échantillonnage des branchies.

Figure 1 : Des individus doucement indiscrets s'ouvrent. Pour vérifier la gravidité d'une moule vivante, ouvrez doucement les valves avec les pouces (A) ou utilisez prudemment un spéculum ou des pinces inversées pour ouvrir les vannes (B). Passez en revue l'étape 2.3 du protocole pour les mises en garde associées à cette méthode. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

3. Effectuer une inspection visuelle sur les spécimens conservés en ouvrant les vannes et en inspectant les branchies pour déterminer si l'individu est une femelle gravid (figure 2).

Figure 2 : Comment identifier une femelle gravid. Les branchies marsupiales des moules femelles semblent gonflées lorsque la femelle est gravid et couvée. Les photos A et C montrent les branchies d'un point de vue latéral tandis que les photos B et D offrent une vue ventrale des branchies. Les boîtes rouges décrivent les branchies pour mettre en évidence les différences entre une moule femelle De gravid (A/B) et non gravid (C/D). La longueur totale des individus est de 79 mm (A/B) et de 88 mm (C/D). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

2. Échantillonnage de contenu Gill

REMARQUE : Ce protocole peut être adapté si l'échantillonnage a lieu sur des moules vivantes sur le terrain et en laboratoire, ou sur des spécimens conservés.

1. Préparer un tube de collecte de microcentrifuge en plastique de 1,5 ml avec environ 1 ml d'eau stérile si le contenu des branchies sera évalué dans les 24 h de l'extraction³⁵ ou de l'éthanol (EtOH) si l'évaluation de l'échantillon ne peut pas avoir lieu dans les 24 h suivant la collecte ou si les branchies sont tirés d'un spécimen de musée conservé dans EtOH. Si la glochidie est destinée à l'imagerie au microscope électronique à balayage (SEM), utilisez 70 % et si la glochidia sera utilisée pour des tests génétiques, utilisez 95 % etOH³⁶non dénaturés.
2. Retirer l'emballage en papier pour une aiguille stérile de 20 G à bout de bevel sur une seringue de 10 ml. Dévissez le bouchon pour exposer l'aiguille et préparez un tube en plastique de 1,5 ml pour la collecte de la teneur en branchie. Poussez la poignée de la seringue tout le chemin vers le bas de sorte que le bouchon noir est à la ligne 0 mL/cc.
   REMARQUE : Une seringue stérile doit être utilisée chaque fois que le contenu des branchies est échantillonné. Une seringue usagée peut être stérilisée sur le terrain en trempant la pointe dans une solution d'eau de Javel de 10 %, puis en rinçant la seringue en la remplissant de 1 ml d'eau stérile et en déprimant le piston à 0 mL/cc, puis en séchant la seringue avec un chiffon propre.
3. Ramassez la femelle gravid et ouvrez doucement les deux valves en utilisant le bout des pouces.
   ATTENTION: Veillez à ne pas nuire à l'animal. Ouvrir les valves trop larges ou trop rapides peut surétendre les muscles adducteurs et causer la mortalité. Les spécimens à coquille mince (p. ex., les espèces d'Anodonta,de Leptodea, d'Utterbackia,etc.) et les jeunes individus sont particulièrement vulnérables dans cette étape. La manipulation énergique d'espèces à coquille fragile peut fendre les coquilles et causer la mortalité. Dans certains cas, en serrant les animaux à coquille mince des marges antérieures et postérieures de la coquille, tout en regardant la surface ventrale, fera fléchir et se lamenter légèrement la coquille, ce qui permettra d'observer les branchies ou d'ouvrir les coquilles et d'éviter d'endommager les fragiles marge de coquille.
   REMARQUE : Les outils peuvent être utilisés pour aider à cette étape, mais peuvent aussi causer la mortalité s'ils ne sont pas utilisés avec soin et doivent être évités dans la mesure du possible. Par exemple, un spéculum ou un ensemble modifié de pinces inversées peut être utilisé pour aider à soulever l'individu ouvert et un coin peut être utilisé pour aider à soutenir les vannes ouvertes. Ces instruments peuvent ne pas être nécessaires si une autre personne est disponible pour aider (c.-à-d., une personne tient l'animal ouvert tandis qu'une autre manœuvre la seringue pour l'extraction). Endommager ou séparer le tissu du manteau du péristracum peut causer des malformations de croissance et la mortalité^37; par conséquent, il est essentiel d'éviter de rompre la connexion entre le tissu du manteau et la marge extérieure de la coquille.
4. Utilisez l'extrémité de l'aiguille de la seringue pour pénétrer doucement un seul tube d'eau de la branchie marsupiale gonflée. Ensuite, retirez délicatement le contenu branchial en utilisant la pointe bevée de l'aiguille.
   REMARQUE : Le contenu gill a habituellement une consistance blanc laiteux, qui devrait être visible sur la pointe biseautée de l'aiguille.
   1. Déposez le contenu de la seringue directement dans un plat Petri si un microscope est facilement disponible. Dans le cas contraire, entreposez le contenu dans un tube microcentrifuge en plastique de 1,5 ml avec du liquide désigné (voir l'étape 2.1) pour une évaluation ultérieure.
      REMARQUE : Minimiser la perturbation et la manipulation des échantillons de glochidia pendant le transport afin d'éviter les dommages et la viabilité réduite^32,35.
5. Enregistrer des renseignements sur l'identification du genre-espèce, le statut gravidity, la longueur des femmes (mm), les renseignements sur les collecteurs et les coordonnées, l'état, le comté, le drainage, l'emplacement de collectespécifique, la latitude et la longitude, un identificateur unique pour la branchie un identificateur unique pour le site d'enquête et la date de collecte si le contenu des branchies a été extrait (figure 3). Enregistrez un identifiant unique sur chaque navire de collecte afin d'assurer des enregistrements de données précis pendant le transport.
   1. Photographiez la soupape droite extérieure de la moule pour la validation d'identité et incluez le tube étiqueté avec l'identificateur unique lisible dans l'image. En option, recueillir d'autres paramètres abiotiques et biotiques pour compléter l'information sur l'environnement et la communauté dans laquelle la moule a été trouvée (voir la figure 3 pour obtenir des suggestions).

Figure 3 : Exemple d'une feuille de données de gravidité de champ. Des rapports précis sur les données sont nécessaires si un échantillon de branchie est prélevé pour produire des informations fiables. Il s'agit d'un exemple d'une feuille de données de terrain avec les champs minimums et les paramètres abiotiques supplémentaires à recueillir avec chaque échantillon de branchie. Pour plus d'informations, veuillez consulter l'étape 4.1 du protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

3. Évaluation en laboratoire du contenu des branchies

1. Si le contenu des branchies se trouve dans un tube de 1,5 ml, transférez-les dans un plat Petri et remplissez le fond du plat d'eau. Faites tourbillonner doucement le plat Petri dans un mouvement circulaire pour recueillir le contenu au centre du plat pour une vue plus concentrée de l'échantillon.
   REMARQUE : Le tube de 1,5 ml peut devoir être évacué à l'aide d'une bouteille d'éclaboussure ou transférer des tuyaux remplis d'eau si le contenu des branchies colle aux parois du tube.
2. Placez le plat Petri sous un microscope à disséquer pour évaluer l'échantillon. Si possible, prenez une photographie de l'échantillon branchial sous le microscope et étiquetez-le avec l'identifiant unique pour cet échantillon.
   1. Enregistrer les résultats des stades de développement présents dans chaque échantillon de branchies. Utilisez la figure 4 comme guide pour caractériser chaque étape de développement. Dans certains cas, les femelles peuvent couver des larves à plusieurs stades de développement; par conséquent, signaler chaque stade de développement observé au sein d'un échantillon donné (p. ex., «EGG/DG/IMG/FDG»). Une fois les glochidies conservés évalués, passez à l'article 4. Si des glochidies entièrement développées sont identifiées et que l'EtOH n'a pas été utilisé pour la conservation, passez à l'étape 3.3.
      REMARQUE: EGG, masses d'œufs; DG, développement de la glochidie; IMG, glochidia immature; FDG, glochidia entièrement développé.

Figure 4 : Représentations pour diverses étapes du développement des glochidies dans les branchies marsupiales. (A) Les masses d'œufs (EGG) ont une membrane qui fait les œufs s'agglutinent. Dans chaque membrane d'oeuf il y a une masse sphérique opaque des cellules différenciantes. La masse sphérique opaque peut se diviser en masses sphériques multiples pendant la division cellulaire tôt mais devrait toujours être enregistrée en tant qu'EGG jusqu'à ce qu'une forme bivalve distincte soit observée. (B) Les glochidies immatures (IMG) ont une masse bivalve distincte contenue dans la membrane d'oeuf. (C) Le développement de la glochidie (DG) a une forme bivalve distincte, pas de membrane d'oeuf, et le tissu non organisé à l'intérieur, souvent flou en apparence. Le développement de la glochidie (DG) n'est pas réactif lorsqu'il est exposé à NaCl et classé comme « DG(T) » lorsque les données sont enregistrées. (D) La glochidie entièrement développée (FDG) a la forme bivalve distincte et le tissu musculaire adducteur évident permettant à la glochidie de se fermer. Les glochidia (FDG) entièrement développés sont souvent observés comme deux valves ouvertes après conservation. Deux vannes ouvertes se cassent généralement fermées, ou s'ouvrent et sont fermées, lorsqu'elles sont exposées à NaCl et sont classées comme « FDG(T) ». Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

3. Effectuer un test de chlorure de sodium (NaCl) afin d'évaluer davantage la viabilité de toute glochidie entièrement développée en ajoutant un cristal de NaCl à une gouttelette de sous-ensemble de l'échantillon branchial³⁵. Les glochidies viables répondront à NaCl en fermant leurs vannes à partir d'une position ouverte. Signalez toute glochidie testée au sel avec ' (T) » à la fin de la désignation lorsque les données sont enregistrées.
   REMARQUE : On peut également observer des glochidies entièrement développées s'ouvrir et fermer activement sans exposition au NaCl.

4. Rapport à la base de données

1. Accéder au web FMGA (http://arcg.is/089uee), qui a été développé à l'aide de logiciels en ligne^38,39,40. La page FMGA fournit un lien vers le formulaire d'entrée de données de bureau et un téléchargement d'application pour les appareils mobiles. L'application mobile permet la saisie de données sur le terrain et la géoréférencement automatisé⁴¹.
   REMARQUE : Le calendrier de gravidité et d'autres graphiques associés aux événements de l'histoire de la vie des espèces de moules d'eau douce peuvent également être trouvés sur le tableau de bord de la FMGA.
   1. Utilisez l'application mobile ou le site de bureau pour enregistrer les résultats dans le formulaire d'entrée de données en utilisant des menus déroulants et des champs d'entrée de texte. Pour les grands ensembles de données préexistants, contactez les auteurs pour la feuillede calcul du modèle . Entrez les données enregistrées sous les rubriques de colonne appropriées, en gardant à l'esprit que chaque enregistrement, ou ligne sur la feuille de calcul, représente des observations d'un échantillon de branchie d'un individu gravid.
   2. Soumettez les résultats et ils seront ajoutés à la base de données FMGA après avoir été validés par un administrateur, qui peut contacter le collecteur pour demander plus de détails ou de photos.
      REMARQUE : Une fois que les données sont validées et compilées dans la base de données FMGA, tous les calendriers de gravidité et autres graphiques interactifs affichés sur le tableau de bord FMGA seront mis à jour.

Results

Ce protocole a été appliqué au cours d'une étude de capture-marque-recapture qui a surveillé la communauté des moules d'eau douce dans un tronçon de 750 m² de Bruce Creek (comté de Walton, Floride) de janvier 2015 à décembre 2015. L'échantillonnage sur le terrain devait avoir lieu toutes les quatre semaines; toutefois, en raison d'événements à fort débit, l'échantillonnage n'a pas été effectué en avril ou en septembre 2015. Des organismes fédéraux et d'État, dont le U.S. Geological Survey, le U.S. Fish and Wildlife Service et la Florida Fish and Wildlife Conservation Commission, ont participé à des relevés sur le terrain et à l'échantillonnage des branchies. Chaque femelle gravid rencontrée au cours de l'enquête a été soumise à un échantillonnage de contenu branchial sur le terrain à l'aide du protocole décrit ci-dessus, étiquetée (voir tableau des matériaux)et remise dans le substrat de la rivière. Les échantillons de branchie ont été stockés dans 95 % d'EtOH et transportés au laboratoire du U.S. Geological Survey's Wetland and Aquatic Research Center pour évaluation du contenu des branchies.

En marquant les femelles et en les recapturant à intervalles mensuels tout au long de l'année, nous avons évalué les impacts mortels et non létaux du protocole d'échantillonnage branchial sur un total de 90 individus. Les sept espèces suivantes ont été reprises au cours de cette étude : Elliptio pullata (n ' 5), Fusconaia burkei (n ' 1), Hamiota australis (n ' 19), Obovaria choctawensis (n ' 1), Strophitus williamsi (n ' 1), Villosa lienosa (n ' 60), et Villosa vibex (n ' 3). Notre échantillonnage comprenait des individus de 24 mm à 80 mm de longueur totale et deux espèces(F. burkei et H. australis)protégées par la Endangered Species Act des États-Unis. Toutes les données utilisées dans cette étude sont accessibles au public Nous avons donné accès à notre ensemble de données sur ScienceBase (https://doi.org/10.5066/P90VU8EN)⁴².

La survie a été évaluée en fonction du nombre d'individus retrouvés vivants après la collecte d'échantillons de branchies. Nous avons observé un taux de survie élevé (97 %) au cours de l'étude avec une certaine mortalité, peut-être contribuant à la prédation, indiquée par des observations sur place. Les résultats ont montré qu'environ 51 % des personnes (46 sur 90) restaient gravid entre les événements d'échantillonnage consécutifs. Un autre 10% des individus (9 sur 90) ont été trouvés gravid, repris pas gravid, et trouvé gravid nouveau. Environ 39 % des personnes (35 sur 90) dans cette étude ont été trouvées gravid, un échantillon de branchie a été pris, mais une fois repris tout au long de l'année, ils n'ont jamais été trouvés gravid une deuxième fois. Les résultats indiquent que le protocole décrit ici n'est ni mortel ni sublétal et ne perturbe pas considérablement la période de couvée actuelle après l'échantillonnage de la branchie.

Bien que la taille des échantillons dans cette étude soit inégale d'une espèce à l'autre, les résultats de cette étude mettent en évidence les applications bénéfiques et pratiques de ce protocole. Le calendrier de gravidité de V. lienosa illustre que les femelles gravids couvées fDG ont été trouvées dans presque tous les mois de l'année, sauf en août, lorsque seules les femelles couvant EGG ont été trouvées (Figure 5A). La femelle H. australis n'a pas été trouvée gravid (NG) en juillet, août, et décembre. Une plus grande proportion de femelles couvées FDG en Janvier et Février, mais ont également été trouvés en Octobre et Novembre (Figure 5B). Aucun individu de E. pullata n'a été trouvé couvant FDG bien que les femelles couvent EGG de mai à juin, et une femelle gravid enregistrée (GFR) en juin (figure 5C). La seule femelle gravid F. burkei a été trouvée GFR en juin et a repris NG en juillet. Le même individu O. choctawensis a été recueilli FDG en Février et repris NG en Juillet. Un seul S. williamsi a été trouvé et a été repris trois fois. Cette femelle a été trouvée FDG en Mars, NG en mai, GFR en Juin, et EGG en août (Figure 5C). Des femelles gravid de V. vibex couvée FDG ont été trouvées entre février et juin (figure 5C).

Figure 5 : Résultats de l'étude à Bruce Creek, FL affichés dans un format de calendrier de gravidité. (A) Calendrier gravinartique pour Villosa lienosa captures/recaptures. (B) Calendrier de gravidité pour Hamiota australis captures/recaptures. (C) Calendriers gravidités pour toutes les espèces de moins de 10 individus échantillonnés. L'axe y comprend des abréviations pour les mois de janvier (Ja), février (F), mars (M.), mai (mon), juin (Jn), juillet (Jl) août (A), octobre (O), novembre (N) et décembre (D). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

signification

La conservation des espèces en péril dépend du recrutement réussi au sein des populations existantes. Dans certains cas, la propagation artificielle peut être nécessaire pour accroître le recrutement de ces populations à risque. Pour ce faire, les chercheurs doivent être informés du moment de la reproduction active de chaque espèce et, éventuellement, appliquer des méthodologies ou des pratiques de gestion différentes pour atténuer l'impact sur le recrutement. En tant que groupe d'organismes en péril, il est primordial d'établir une approche normalisée et non létale pour l'étude des habitudes de reproduction, et de fournir une plate-forme sur laquelle compiler et visualiser des données pour informer la communauté scientifique avec les plus à jour l'information disponible. Cette étude fournit un protocole étape par étape pour s'assurer que des précautions sont prises, et le contenu des branchies peut être échantillonné et évalué de façon adéquate à partir de moules femelles. Ce protocole a été testé pour les effets mortels et non létaux, permettant aux chercheurs et aux gestionnaires de mettre en œuvre de façon responsable cette méthodologie. Nous avons également développé une suite d'outils et d'applications de gestion de base de données pour faciliter la compilation d'informations de gravidité sur un tableau de bord accessible au public et convivial. Les études sur l'épidémiologie, la morphologie de glochidia, l'histoire de la vie, la phylogénétique, la propagation, et les translocations peuvent toutes bénéficier et employer ce repository de l'information temporelle de gravidité pour toutes les espèces des moules d'eau douce.

Cette étude à elle seule a étayé les résultats d'études antérieures sur certaines habitudes de reproduction des espèces, mais a également révélé de nouvelles informations sur d'autres. Bien que V. vibex ait été recueilli en moins de nombres que V. lienosa, des similitudes peuvent être trouvées entre les deux basées sur les données de gravidité. Les deux espèces de Villosa semblent couver glochidia entièrement développé au cours d'une grande partie de l'année, ce qui les caractérise comme un couvain hivernant. Ceci est compatible avec les études précédentes sur d'autres espèces de Villosa ^43,44,45. Les résultats de cette étude suggèrent que H. australis peut être trouvé gravid à partir d'octobre et hivernant jusqu'en juin, sauf qu'aucune capture n'a été trouvée gravid en décembre. Une étude publiée précédemment a identifié le congénéte H. altilis avec une période de gravidité de quatre mois, de mars au⁴⁶juin^,47. Cette conclusion illustre une période de gravidité plus longue qu'on ne le pensait auparavant et regroupe généralement H. australis en tant que couvain hivernant. En tant qu'espèces protégées par le gouvernement fédéral, diverses périodes de couvée pour H. altilis et H. australis pourraient avoir une incidence sur les décisions de gestion visant à mieux protéger les populations pendant les périodes d'activité reproductive. Elliptio pullata ont été trouvés gravid avec EGG en mai et juin qui correspond à leur caractérisation comme une espèce tachytique avec une période de couvée très courte^{24,48,49, 50}. Comme les données sont compilées sur les espèces d'Elliptio à l'aide de ce protocole, des informations détaillées peuvent rendre les efforts sur le terrain plus efficaces lorsque certaines étapes de développement glochidial sont ciblées, puisque les glochidies ne sont trouvées que quelques mois par an. L'inférence des autres espèces dont la taille des échantillons est plus faible est limitée, mais au fur et à mesure que les données sont compilées dans la base de données, des échantillons plus élevés donneront un aperçu des habitudes de reproduction d'autres espèces de moules.

Commentaires procéduraux

Les moules d'eau douce et leurs glochidia sont connues pour être sensibles aux facteurs de stress anthropiques^10,35. Lors de l'inspection de la gravidité, les valves de moules peuvent ne pas être faciles à ouvrir, et forcer négligemment les valves ouvertes peut causer des dommages involontaires et entraîner un stress ou une mortalité. Certaines espèces à coquille fragile (p. ex., les espèces d'Anodonta,de Leptodea, d'Utterbackia,etc.) et les individus de plus petite taille peuvent avoir des coquilles très fragiles et de faibles muscles adducteurs qui peuvent se briser et se déchirer facilement. L'échantillonnage par Gill pourrait être considéré comme un facteur de stress si la manipulation n'est pas effectuée de façon responsable et prudente. Une étude précédente a révélé que la manipulation et l'exposition aérienne des moules pendant les périodes d'activité reproductive peuvent causer divers stress physiologiques, y compris la libération prématurée du contenu branchial³⁴. Cependant, une étude utilisant une méthodologie similaire telle que décrite ici, a trouvé la manipulation des moules femelles gravid pendant l'échantillonnage branchial n'a pas interrompu la couvée actuelle ou causer la libération prématurée dans les espèces de couvée à court et à long terme¹⁶. En outre, une seringue stérile doit être utilisée au cours de ce protocole pour prévenir toute infection involontaire ou contamination croisée lors de la perforation des branchies de plusieurs personnes. En outre, les glochidies sont fragiles et les couvées peuvent être mûris et stressées, mais pas expulsées. Glochidia mature en mauvaise santé peut entraîner moins d'individus de réagir aux tests de sel³⁵. Lors de la distinction entre DG(T) et FDG(T) il est important de tester le sel avec une grande taille d'échantillon, prendre des notes sur les observations pour identifier soigneusement les distinctions entre DG et FDG glochidia en utilisant les descriptions fournies dans cette étude. Lorsque des précautions appropriées sont prises, le stress minimal induit par cette procédure peut permettre aux moules femelles de continuer à couver la glochidie naturellement et de réduire les impacts sur le recrutement dans la population.

Des données supplémentaires peuvent être enregistrées pour compléter la base de données et fournir un contexte général pour les habitudes de reproduction des moules d'eau douce. Certaines espèces (par exemple, les espèces de Fusconaia), ont été observées pour avoir des branchies de différentes couleurs basées sur le stade de développement de la glochidie⁵¹. Lors d'une première vérification de la gravidité de la femelle, une description de la couleur branchiale peut être incluse dans les données rapportées pour permettre une enquête future. En outre, à ce stade du protocole, les chercheurs peuvent noter si la femelle couvée a été trouvé glochidia couvée dans les deux branchies extérieures (ectobranchus), deux branchies intérieures (endobranchus), ou les quatre branchies (tétragenous)¹⁷. Ces informations peuvent être ajoutées à la FMGA et aider à combler les lacunes de données concernant la couvée pour chaque espèce étudiée. Les conditions environnementales, en particulier la température de l'eau, peuvent être recueillies et enregistrées sur le terrain pour une observation plus complète de l'état de gravité et du moment des espèces à diverses gammes latitudinales. La recherche montre que les paramètres environnementaux, tels que la température, la photopériode, le débit et la disponibilité alimentaire, peuvent induire des événements reproducteurs dans les moules d'eau douce^{52,53,54,55 ,56}. D'autres champs peuvent être ajoutés à la base de données au fur et à mesure qu'ils sont soumis pour promouvoir la recherche future sur les facteurs abiotiques influençant la gravidité. Une modification capture-marque-recapture calquée sur notre étude peut également être ajoutée à ce protocole, ce qui permettrait aux chercheurs de surveiller les habitudes de reproduction d'une moule spécifique et de révéler des informations sur plusieurs couvées par an.

L'exactitude de l'information contenue dans la FMGA dépend de la source. Par exemple, une mauvaise identification des moules d'eau douce est courante en raison du fait que de nombreuses espèces ont des caractéristiques externes similaires qui rendent difficile la distinction entre les espèces^57. Un échantillon de branchie d'une personne mal identifiée pourrait créer de la confusion et de fausses informations pour la période de couvée d'une espèce. Si un échantillon de branchie est prélevé, des photographies doivent être prises à l'intérieur des deux valves (si l'individu n'est pas en vie), à l'extérieur de la soupape droite, et l'umbo (charnière où deux valves se connectent) et soumis avec des données de gravidité par le site de bureau ou l'application mobile. Nous accueillons également des photos du contenu branchial. Dans les formulaires de soumission, il y a un menu déroulant permettant au collecteur d'indiquer son niveau de confiance en ce qui concerne l'identification des espèces. Avant la validation du dossier, ces informations seront prises en considération lors de la vérification de l'identification du collectionneur contre une distribution plausible, etc. En raison du degré élevé de variation morphologique intraspécifique chez les espèces d'Unionidae, la soumission d'échantillons de tissus est encouragée et peut être nécessaire pour faciliter l'identification moléculaire.

Conséquences futures

En tant que méthode non létale, ce protocole peut être appliqué à la fois aux espèces communes et en péril. Les calendriers de gravidité des espèces en péril peuvent aider les gestionnaires de la conservation impliqués dans la législation sur les espèces en voie de disparition et la planification du rétablissement en fournissant des informations sur les périodes où les espèces sont actives sur le plan de la reproduction. Les organismes d'État et fédéraux qui gèrent les espèces en péril peuvent mieux conseiller l'attribution des permis pour les périodes où l'espèce n'est pas vulnérable et se reproduit, et même limiter la récolte des poissons hôtes pendant les périodes où les moules couvent glochidia entièrement développé. De plus, les relevés sur le terrain peuvent cibler les espèces pendant les périodes non reproductrices afin de minimiser l'impact sur les processus de recrutement. La base de données accessible au public, FMGA, fournit aux chercheurs et aux gestionnaires un outil pour obtenir des renseignements importants sur la reproduction de toute espèce de moule d'eau douce cible. La base de données mettra également en évidence les lacunes en matière de données, ce qui encouragera la poursuite des recherches sur les modèles de couvée propres aux espèces. Étant donné que la compréhension d'un modèle de reproduction des espèces permet de mettre en œuvre des décisions de gestion adéquates, nous espérons que notre protocole et notre base de données faciliteront la recherche, la conservation et le rétablissement futurs des moules d'eau douce.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubes à centrifuger à bouchon à pression de 1,5 ml	USA Scientific	1615-5510	tubes à bouchon à pression sont importants sur le terrain afin que le bouchon à vis desserré ne soit pas perdu.
Aiguille de 20 g sur seringue jetable de 10 mL	Exelint International	26255	seringue jetable stérile de 10 mL avec aiguille Modèle : 10 ml Luer Lock Tip W/20G X 1 1/2"
Microscope de dissection	n’importe	quel
stylo de marquage	Fisher Scientific	13-379-4	C’est ce que nous avons utilisé, mais n’importe quel marqueur capable d’écrire sur de petits tubes en plastique fera l’affaire. Celui-ci est assez résistant à l’éthanol et à l’eau.
Éthanol de qualité moléculaire	n’importe quel		nécessaire si la conservation du contenu des branchies. Non dénaturé 95 % est nécessaire pour le travail génétique, 70 % est nécessaire pour le travail d’imagerie MEB.
Papier	tout	ce qui	est nécessaire pour consigner les informations sur les échantillons recueillis.
Si			vous êtes sur le terrain, il est préférable d’écrire sur du papier imperméable avec un crayon pour qu’il ne coule pas. Si vous êtes au musée/laboratoire, n’importe quel ustensile d’écriture convient.
Boîte de Pétri	DWK Life Sciences (Kimble)	23000-9050	C’est ce que nous avons utilisé, mais n’importe quelle boîte de Pétri disponible convient. Il est plus agréable d’avoir les murs les plus hauts au cas où trop d’eau serait utilisée.
Chlorure de sodium	tout		nécessaire pour le test NaCl pour les glochidies réactives. Les échantillons conservés n’en ont pas besoin.
Spéculum	n’importe quel		Seulement nécessaire si vous voulez de l’aide pour ouvrir les vannes d’une moule vivante.
Eau stérile	toute		eau ajoutée aux échantillons branchiaux à évaluer pour la réactivité dans les 24 heures suivant le prélèvement.
Super colle	Gorilla Gorilla	super glue gel	Utilisé pour appliquer des étiquettes et uniquement nécessaire si vous effectuez une étude de capture-marquage-recapture.
Mots-clés	Hallprint	FPN 8x4	Uniquement nécessaire si vous réalisez une étude de capture-marquage-recapture.
Pipette de transfert	Thermo Scientific Samco	225	C’est ce que nous utilisons, mais n’importe quelle pipette de transfert ou bouteille à jet d’eau est applicable.
Pince à épiler	n’importe laquelle		nécessaire pour déplacer les cristaux de NaCl pour le test de sel. Les échantillons conservés n’en ont pas besoin.
Papier imperméable	RainWriter	n’importe quel	Nécessaire uniquement si vous effectuez des travaux sur le terrain. Cela vous permet d’enregistrer des informations sur chaque contenu branchial individuel dont vous êtes extrait.
Pioche en bois	n’importe quel	Seulement	nécessaire si vous voulez de l’aide pour ouvrir les vannes d’une moule vivante.