Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Résumé

L'activité phagocytique de Macrophage contre des cellules cancéreuses, spécifiquement les cellules mammaires de carcinome de souris 4T1, a été imaged dans cette étude. Le modèle de coculture des cellules vivantes a été établi et observé à l'aide d'une combinaison de microscopie fluorescente et de contraste d'interférence différentielle. Cette évaluation a été imageà l'aide d'un logiciel d'imagerie pour développer une vidéo en accéléré multipoints.

Résumé

Les macrophages tumeur-associés (TAMs) ont été identifiés comme composant important pour la croissance de tumeur, l'invasion, la métastase, et la résistance aux thérapies de cancer. Cependant, les macrophages tumeur-associés peuvent être nocifs à la tumeur selon le microenvironnement de tumeur et peuvent réversiblement modifier leurs caractéristiques phénotypiques en antagonisant l'activité cytotoxique des cellules immunitaires ou en améliorant la réponse antitumorale. Les actions moléculaires des macrophages et leurs interactions avec les cellules tumorales (p. ex., la phagocytose) n'ont pas fait l'objet d'études approfondies. Par conséquent, l'interaction entre les cellules immunitaires (M1/M2-sous-type TAM) et les cellules cancéreuses dans le microenvironnement tumoral est maintenant au centre de la recherche sur l'immunothérapie contre le cancer. Dans la présente étude, un modèle de coculture de cellules vivantes des macrophages induits de M1 et des cellules de carcinome 4T1 mammaires de souris a été développé pour évaluer l'activité phagocytique des macrophages utilisant une fonction vidéo de time-lapse utilisant la microscopie de contraste de phase-contraste, fluorescent, et différentielde de contraste (DIC). La méthode actuelle peut observer et documenter l'imagerie multipoint de cellules vivantes de la phagocytose. La phagocytose des cellules 4T1 par les macrophages M1 peut être observée à l'aide de la microscopie fluorescente avant de tacher les cellules 4T1 avec l'ester de succinimidyl de carboxyfluorescein (CFSE). La publication actuelle décrit comment coculture macrophages et cellules tumorales dans un seul plat d'imagerie, polariser les macrophages M1, et enregistrer les événements multipoints de macrophages engloutissant les cellules 4T1 pendant 13 h de la coculture.

Introduction

Les macrophages sont la première ligne de défense immunitaire et jouent un rôle dans l'orchestration des réponses immunitaires contre les agents pathogènes et les matériaux étrangers, y compris les cellules cancéreuses. Ils sont un phagocyte spécialisé qui détruit et se débarrasse des particules indésirables dans le corps. Les macrophages fournissent des fonctions défensives telles que le dégagement des cellules apoptotiques et des micro-organismes et le recrutement d'autres cellules immunitaires¹. Les macrophages peuvent se différencier en deux types différents, les macrophages M1 et M2, en réponse aux signaux environnementaux

Protocole

REMARQUE : Les sections 1 à 6 décrivent le modèle de coculture des cellules du carcinome mammaire de la souris 4T1 et des macrophages de souris RAW 264,7. La section 7 décrit l'évaluation en time-lapse des cellules 4T1 phagocytes de M1 de macrophages.

1. Cultiver 4T1 cellules de carcinome mammaire de souris et RAW 264.7 macrophages de souris

1. Décongeler une fiole de 4T1 cryogéniquement préservée et RAW 264,7 passage 6 cellules par agitation douce dans un bain d'eau à 37 oC ou la température de croissance normale pour les lignées cellulaires.
   REMARQUE : Le dégel doit être effectué rapidement, environ dans les 2 minutes. Pour évit....

Résultats

Les images bidimensionnelles en time-lapse (2D) du modèle de coculture des lignées cellulaires mammaires 4T1 de carcinome de souris montrent les cellules 4T1 englouties par des macrophages M1 pendant une période de 13 heures. Il est important d'assurer une polarisation complète des macrophages M1 en effectuant l'immunostaining. Les résultats (figure 1) montrent que la concentration de 100 lipopolysaccharides (LPS) et de 20 ng/mL IFN--polarisé RAW 264,7 macrophages dans l'état M1. L'étiquetag.......

Discussion

Le protocole décrit exige deux étapes : 1) coculture des cellules mammaires de carcinome de souris 4T1 et des macrophages M1-polarisés, et 2) l'évaluation de l'activité phagocytique de macrophage utilisant la microscopie de time-lapse. La coculture cellulaire vivante est largement utilisée dans les tests de phagocytose et de migration. Le modèle de coculture des cellules vivantes ici est une procédure in vitro simple et adaptable (Figure 2) qui utilise un colorant fluorescent, CFSE, qui est .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anticorps anti-INOS conjugué FITC	Miltenyi Biotec	REA982	150 µ ; g dans 1 mL
Ester succinimidylique de carboxyfluorescéine (CFSE)	Invitrogen	C1157	25 mg
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phénylindole, dichlorhydrate)	Invitrogen	D1306	10 mg
DMEM/hyperglucose	HyClone	SH30003.04	670.0 g
Sérum fœtal bovin	Tico Europe	FBSEU500	500 mL
Lipopolysaccharides	Sigma	L4516-1MG	1 mg
Interféron-gamma recombinant de souris	Stemcell Technologies	78021	100 & micro ; g
Pénicilline-streptomycine solution	Cellgro	30-003-CI	100 mL
Solution saline tamponnée au phosphate	Sigma-Aldrich	P5368-10PAK	10 sachet
Trypsine EDTA	Cellgro	25-052-CI	1X, 100 mL
1000 µ ; L pointes de pipette	WhiteBox	WB-301-01-052	5000 pointes/caisse
2 mL pipette sérologique	JET BIOFIL	GSP012002	Non pryogène
200 µ ; Pointes de pipette L	WhiteBox	WB-301-02-302	20 000 tps/caisse
Flacon de culture cellulaire 25 cm2	Corning	CLS430639	Centrifugeuse de paillasse traitée pour culture tissulaire
	Dynamica	FA15C	Modèle : Velocity 14R
Hotte de sécurité biologique	Nuaire	NU-565-400	Modèle : Accueil/ LabGard® ; ES TE NU-565 Classe II, Type B2 Hotte de biosécurité
Mélangeur CO2/air	Chamlide (Live Cell Instrument)	FC-R-20	FC-5 (Mélangeur CO2/Air) avec le débitmètre
Racleur de cellules	NEST	710001	220 mm
Incubateur de cellules CO2	Panasonic	N/A	Modèle : MCO-19M(UV)
Microscope confocal	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon Ti-Eclipse
Plat à fond en verre	Ibidi	81218-200	35 mm
NIS elements software	Nikon Instruments Inc.	Disponible en ligne télécharger
pipette	CappAid	PA-100	Contrôleur de pipette CappController, 0.1-100ml
Thermostat	Shinko	Discontinued	JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm

Contrôleur de