Imagerie et analyse de l’orientation tissulaire et de la dynamique de croissance dans l’épithélie de drosophile en développement pendant les stades pupal

Summary

Ce protocole est conçu pour l’imagerie et l’analyse de la dynamique de l’orientation cellulaire et de la croissance des tissus dans l’épithélie abdominale Drosophila que la mouche des fruits subit une métamorphose. La méthodologie décrite ici peut être appliquée à l’étude de différents stades de développement, tissus et structures subcellulaires dans Drosophila ou d’autres organismes modèles.

Abstract

Dans les organismes multicellulaires, les tissus et les organes matures affichent des degrés élevés d’ordre dans les arrangements spatiaux de leurs cellules constitutives. Un exemple remarquable est donné par l’épithélia sensorielle, où les cellules des mêmes identités ou distinctes sont réunies par l’adhérence cellulaire montrant des modèles planaires très organisés. Les cellules s’alignent les unes sur les autres dans la même direction et affichent une polarité équivalente sur de grandes distances. Cette organisation de l’épithélia mature est établie au cours de la morphogenèse. Pour comprendre comment l’arrangement planaire de l’épithélia mature est atteint, il est crucial de suivre l’orientation cellulaire et la dynamique de croissance avec une fidélité spatiotemporal élevée pendant le développement in vivo. Des outils d’analyse robustes sont également essentiels pour identifier et caractériser les transitions locales à mondiales. La pupe Drosophila est un système idéal pour évaluer les changements orientés de forme cellulaire sous-jacents morphogenèse épithéliale. L’épithélium en développement du pupal constitue la surface externe du corps immobile, permettant l’imagerie à long terme des animaux intacts. Le protocole décrit ici est conçu pour imager et analyser les comportements cellulaires aux niveaux mondial et local dans l’épiderme abdominal pupal à mesure qu’il grandit. La méthodologie décrite peut être facilement adaptée à l’imagerie des comportements cellulaires à d’autres stades de développement, tissus, structures subcellulaires, ou organismes modèles.

Introduction

Pour atteindre leurs rôles, les tissus épithéliaux s’appuient pleinement sur l’organisation spatiale de leurs composants cellulaires. Dans la plupart des épithéliales, les cellules sont non seulement emballées les unes contre les autres pour créer une couche pavée précise, mais elles s’orientent par rapport aux axes du corps.

L’importance fonctionnelle de l’organisation précise des tissus est évidente dans l’épithélia sensorielle, comme l’oreille interne vertébré et la rétine. Dans le premier cas, les cheveux et les cellules de soutien s’alignent dans une direction axial spécifique pour détecter efficacement les entrées mécaniques telles qu....

Protocol

REMARQUE : Ce protocole est divisé en cinq étapes : (1) la mise en scène de la pupe, (2) préparant la pupe pour l’imagerie, (3) l’imagerie en direct de l’épithélia abdominale croissante, (4) génération de mosaïques génétiques, (5) le traitement et l’analyse des données (y compris les sections décrivant comment analyser la dynamique d’orientation cellulaire à partir des contours de jonction cellulaire et la dynamique de croissance des clones cellulaires).

1. Mise en scène de pupes Drosophila avant l’imagerie

1. Mouches de culture du génotype approprié sur le milieu standard dans les flacons en plastique à 25 oC pendant 5 jour....

Results

Le protocole décrit ci-dessus couvre la préparation des pupes de Drosophila pour l’imagerie vivante à long terme et les procédures pour l’analyse de l’orientation cellulaire et de la dynamique de croissance de l’épiderme abdominal. En appliquant cette méthodologie, il est possible de générer des films haute résolution des pupes en développement pour des périodes allant jusqu’à 48 h sans photoblachage significatif ou phototoxicité. Des instantanés représentant l’épiderme abdominal.......

Discussion

L’ordre à longue portée est une caractéristique essentielle de la plupart des unités physiologiques fonctionnelles. Pendant la morphogenèse, l’ordre est atteint grâce à l’intégration d’instructions complexes mises en œuvre avec une grande précision temporelle et spatiale. Les contraintes multiples et multiniveau sont intégrées dans les arrangements tissulaires stéréotypés.

La polarité et la directionnalité sont essentielles à l’arrangement spatial ordonné pendant le développement. La polarité .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
d’analyse-ImageJ	Analyse des données
Drosophila	Atpa ::GFP	-	Souches employées pour la collecte de données
Drosophila	hsflp1.22 ; FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls	-	Souches utilisées pour la collecte de données
Dumont 5 Pince	FST	11251-20	1,5 mm de diamètre pour la dissection
Plaques de fond en verre	Mat	Tek P35G-0.170-14-C	Montage des pupes pour la collecte des données
Huile d’halocarbure 27	Sigma-Aldrich	9002-83-9	Montage des pupes
Microscope confocal inversé	Zeiss	LSM700	Collecte de données
Stéréomicroscope	Leica	DFC365FX	Visualisation des pupes pendant la dissection