Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons Time-

Résumé

Ici, nous décrivons la méthode que nous avons employée pour imager la filodose dendritique fortement motivoir dans une préparation en direct du cerveau larvaire de Drosophila, et le protocole que nous avons développé pour quantifier des ensembles de données d'imagerie 3D de time-lapse pour des évaluations quantitatives du dendrite dynamique dans le développement des neurones.

Résumé

La filodée dendritique très motile est largement présente dans les neurones aux premiers stades de développement. Ces branches dynamiques exploratoires échantillonnent l'environnement environnant et amorceront des contacts avec des partenaires synaptiques potentiels. Bien que le lien entre la dynamique des branches dendritiques et la synaptogénèse soit bien établi, la façon dont les processus développementaux et dépendants de l'activité régulent la dynamique des branches dendritiques n'est pas bien comprise. Cela est dû en partie aux difficultés techniques associées à l'imagerie en direct et aux analyses quantitatives de ces structures fines à l'aide d'un système in vivo. Nous avons établi une méthode pour étudier la dynamique des dendrites à l'aide des neurones larvaires ventrals de Drosophila (LNvs), qui peuvent être étiquetés individuellement à l'aide d'approches génétiques et sont accessibles pour l'imagerie en direct. Profitant de ce système, nous avons développé des protocoles pour capturer la dynamique des branches de toute l'arborescence dendritique d'un seul LNv étiqueté grâce à l'imagerie en direct en accéléré. Nous avons ensuite effectué le post-traitement pour améliorer la qualité de l'image par la correction de la dérive et la déconvolution, puis par l'analyse de la dynamique des branches au niveau d'une seule branche en annoté les positions spatiales de tous les terminaux de branche. Enfin, nous avons développé des scripts R(Fichier supplémentaire) et des paramètres spécifiques pour quantifier la dynamique des branches à l'aide des informations de coordonnées générées par le suivi terminal. Collectivement, ce protocole nous permet d'obtenir une description quantitative détaillée de la dynamique des branches de l'arborescence neuronale dendritique avec une haute résolution temporelle et spatiale. Les méthodes que nous avons développées sont généralement applicables aux neurones peu étiquetés dans des conditions in vitro et in vivo.

Introduction

Les dendrites sont des compartiments neuronaux spécialisés qui reçoivent et traitent l'entrée sensorielle et synaptique. La structure complexe et stéréotypée des arborescences dendritiques fait l'objet d'une intense enquête depuis leur découverte. Un certain nombre de systèmes modèles, y compris les neurones tecattiques optiques Xenopus, les cellules ganglionnaires rétiniennes de poussins et les neurones d'arborescence dendritique (da) dans le système Drosophila, ont été mis en place pour étudier le développement, le remodelage et la plasticité des dendrites neuronales^1,2,3,4. Les neurones latéraux ventral de Drosophila (LNvs) sont un groupe de neurones de projection visuelle initialement identifiés pour leurs fonctions importantes dans la régulation circadienne des comportements de mouche^5. Des études ont également révélé le rôle des LNv larvaires comme cible postsynaptique directe des photorécepteurs larvaires (PR)^6,7. Il est important de noter que la culture de larves en développement dans différents régimes de lumière affecte fortement la taille des arborescences dendritiques de LNvs, démontrant l'adéquation des LNvs en tant que nouveau modèle pour l'étude de la plasticité dendritique⁷. Les travaux récents de notre groupe indiquent en outre que la taille de la dendrite LNv et le comportement dynamique des branches dendritiques affichent l'expérience-dépendance plasticité^8,9. Dans le cadre de ces travaux, nous avons mis au point un nouveau protocole d'imagerie et de quantification en direct pour effectuer des analyses sur la dynamique dendrite des LNv à partir de 2^nd ou 3^rd instar larves.

La nature transparente du cerveau larvaire Drosophila le rend idéal pour l'imagerie en direct. Cependant, les arborescences dendritiques des LNv sont situées dans le neuropil optique larvaire densément innervé (LON) au centre du lobe du cerveau larvaire⁶. Pour capturer des images de branches fines de dendrite et de filopodia dans le tissu cérébral intact, nous utilisons la microscopie à deux photons, qui augmente la profondeur de pénétration de la lumière et réduit la phototoxicité lors d'expériences d'imagerie en direct¹⁰. En utilisant cette configuration, nous avons effectué avec succès des expériences d'imagerie en direct sur les LNv pendant plus de 30 min sans observer la détérioration morphologique évidente du neurone. En outre, les manipulations génétiques utilisant la technique Flip-out nous ont permis d'étiqueter les LNvs individuels avec une membrane marquée GFP, qui est également critique pour surveiller les mouvements des branches individuelles^11,12,13 .

Pour capturer le comportement dynamique de toutes les branches de l'arborescence dendritique LNv avec une résolution optique optimale, nous avons effectué l'imagerie 3D time-lapse sur des explants de cerveau larvaire fraîchement disséqués avec une haute résolution spatiale à 1 min par cadre pendant 10 à 30 min. Développer LNvv. Les dendrites sont très dynamiques, avec un grand pourcentage des branches affichant des changements observables dans la fenêtre de 10 min. Cela conduit à l'un des principaux défis techniques dans l'étude de la dynamique des dendrites, quantifiant le comportement des branches à partir des ensembles de données d'image 4D. Les méthodes précédemment établies ont diverses limitations, y compris le manque d'exactitude et l'exigence excessive de temps. Par conséquent, nous avons développé une méthode semi-automatique qui combine le post-traitement d'image, le marquage manuel des terminaux de branche, et le traçage 4D automatique de tache utilisant un logiciel d'annotation d'image. Nous calculons les mouvements des terminaux de branche à différents points de temps en fonction des coordonnées 3D des taches. Les données sont ensuite exportées et analysées pour produire des mesures quantitatives de la dynamique des branches. Cette méthode évalue avec précision la durée et l'étendue des événements d'extension et de rétraction des branches existantes, ainsi que la formation de nouvelles branches, ce qui nous permet de surveiller la dynamique des dendrites dans un grand nombre de neurones.

Protocole

MISE EN GARDE: Ce protocole implique l'utilisation de lasers de classe IV et nécessitera une formation appropriée et des directives de sécurité à suivre. Évitez l'exposition des yeux ou de la peau à la lumière laser directe ou dispersée.
REMARQUE: Le protocole comprend six étapes. Le flux de travail est indiqué dans la figure 1A.

1. Étiquetage des neurones individuels à l'aide de la technique Flip-out

REMARQUE: L'étiquetage unique des LNvs est réalisé en exprimant mCD8::GFP en LNvs unique en utilisant l'étiquetage stochastique flippase-mediated. Le génotype de la ligne de mouche est: hs-flp; Pdf-Gal4; UAS-FRT-CD2-stop-FRT-mCD8::GFP^11,12,13. La fréquence d'obtention d'un seul LNv étiqueté est d'environ 10%. Les stocks de mouches sont maintenus dans un milieu standard dans les incubateurs circadiens et à humidité contrôlée de 25 oC.

1. Recueillir 100-200 œufs dans une fenêtre de 2 h après la fécondation sur une assiette de jus de raisin avec supplément de levure. Incuber les embryons à 25 oC pendant 24 h et recueillir les larves nouvellement écloses pour l'étape suivante.
2. Choc thermique, les larves nouvellement éclos, les premières inétoiles, à 37,5 oC pendant 40 min deux fois, avec une période de récupération de 40 min entre les deux.
3. Culture des larves à 25 oC avec des contrôles circadiens et d'humidité jusqu'au stade de développement souhaité.

2. Disséquer et monter des explantations de cerveau larvaire

1. Disséquer les cerveaux larvaires dans la solution saline externe physiologique (120 mM NaCl, 4 mM MgCl₂, 3 mM KCl, 10 mM NaHCO₃, 10 mM Glucose, 10 mM Sucrose, 5 mM TES, 10 mM HEPES, 2 mM Ca^{2 ,}PH 7,2) sous un microscope de dissection (4,5 magxnification puissance) avec deux paires de #5 forceps de dissection de pointe standard (11 cm). Utilisez une paire de forceps pour maintenir le corps larvaire en place et l'autre pour disséquer soigneusement le cerveau. Préserver les disques oculaires, les lobes cérébraux et le cordon nerveux ventral. Enlever les muscles attachés pour minimiser les mouvements de l'échantillon pendant l'imagerie.
2. Préparer un toboggan en verre (25 x 75 x 1,0 mm³) et utiliser une seringue pour dessiner une chambre carrée avec de la graisse sous vide.
3. Ajouter 20 l de solution saline externe à la chambre carrée avec des barrières de graisse.
4. Transférer les cerveaux larvaires disséqués dans la chambre sur la glissière en verre à l'aide de forceps. Ajuster la position des cerveaux sous la portée de dissection pour s'assurer que le côté dorsal fait face vers le haut.
5. Couvrir la chambre d'un bordereau de couvercle en verre (22 x 22 x 0,15 mm³). Le cerveau larvaire est maintenant monté sur la glissière dans une chambre remplie de la solution saline externe (Figure 1B).
   REMARQUE: Appuyer doucement sur la feuille de couverture confine le cerveau et réduit la dérive de l'échantillon dans la séance d'imagerie suivante.

3. Imagerie en direct Time-lapse

REMARQUE: Nous effectuons des expériences d'imagerie en accéléré à l'aide d'un microscope confocal équipé d'un laser multiphoton. Les paramètres d'acquisition doivent être ajustés pour d'autres configurations d'imagerie.

1. Identifiez les explants cérébraux contenant des neurones étiquetés individuellement à l'aide d'un objectif d'immersion dans l'eau de 40 X (NA 1.3) et d'une source de lumière épifluorescente. Pour la collecte d'images, utilisez un laser à deux photons réglé sur 920 nm et un détecteur non descanned (NDD).
2. Recueillir des images à 512 x 512 pixels par image et 1 min par z-pile pendant 10 min. Ajuster le zoom optique et numérique pour obtenir une résolution suffisante x-y-z tout en assurant la couverture de l'ensemble de l'arborescence dendritique dans un délai de 1 min (Figure 2,Vidéo supplémentaire 1). Les paramètres génèrent des images avec une résolution typique de x-y-z de 0,11 x 0,11 x 0,25 m³.
3. Recueillir la série d'images time lapse à moins de 30 minutes de la dissection du cerveau. Les données présentant une dérive excessive ou une détérioration morphologique évidente devraient être exclues du post-traitement et de la quantification.

4. Correction de dérive et deconvolution

REMARQUE: Selon la qualité de l'image, les deux étapes sont facultatives mais fortement recommandées.

1. Ouvrez un fichier d'image acquis avec un logiciel de correction de dérive. Modifier les paramètres microscopiques pour correspondre à ceux utilisés pour l'expérience. Pour le logiciel (voir tableau des matériaux),cliquez sur Edit Modifier les paramètres microscopiques. Définiz le type de microscope comme un champ large pour les images à deux photons s'il n'y a pas d'option à deux photons et suivez le flux de travail défini par le logiciel. Par exemple, ouvrez l'onglet Deconvolution Object Stabilizer, et choisissez stabiliser les délais.
2. Ouvrez l'image corrigée par la dérive dans le logiciel de déconvolution et suivez son flux de travail. Pour le logiciel (voir Tableau des matériaux),sélectionnez l'image stabilisée, puis cliquez sur Deconvolution . Deconvolution Express. Pour obtenir un meilleur résultat, affiner les paramètres en utilisant Deconvolution Wizard.
3. Enregistrer l'image déconvolved dans un type de fichier qui est pris en charge par le logiciel d'annotation d'image ultérieure capable d'analyser les données 4D et de signaler les coordonnées spatiales des taches définies dans l'image (voir Tableau des matériaux).

5. Annotation d'image

1. Ouvrez l'image déconvolved dans le logiciel d'annotation d'image. Examinez et marquez les bouts de branche à tout moment en 3D. Le logiciel d'annotation d'image rapporte et stocke les coordonnées spatiales et temporelles des bouts marqués de branche. Exportez les informations de coordonnées en tant que fichier .csv pour les calculs ultérieurs.
   REMARQUE: Les deux étapes suivantes sont spécifiques au logiciel d'annotation que nous avons utilisé (voir Tableau des matériaux). Le flux de travail peut être différent pour d'autres logiciels.
2. Dans le module Spots, cliquez sur "Skip automatic creation, editer manuellement" et cochez le bas "Auto-connect à lacase à cocher Spot " sélectionnée ( Figure3A). Passez en charge les images de la série chronologique et sélectionnez une branche pour l'annotation. Maintenez la touche Shift et cliquez sur la pointe du terminal de branche pour ajouter une place. Cliquez sur tous les points de temps.
   REMARQUE: Le logiciel d'annotation d'image relie les taches entre les images et génère automatiquement une trajectoire. L'information spatiale et temporelle des pointes de branche est maintenant associée à des taches marquées. Répétez ces étapes jusqu'à ce que toutes les pointes de branche soient annotées (Figure 3B).
3. Dans le module Spots, cliquez sur l'onglet Statistiques, sélectionnez Les valeurs détaillées et spécifiques. Position. Les informations de coordonnées spatiales et temporelles enregistrées seront exposées. Cliquez sur le bas Enregistrer pour exporter cette information sous forme de fichier .csv (figure 3C).

6. Calcul de la dynamique des branches dendritiques

REMARQUE: À l'aide des informations de coordonnées, le déplacement des pointes de branche en 3D peut être facilement calculé. Dans notre étude, tous les mouvements de branche dendritiques sont classés comme Extension ou Rétraction. Les étapes ci-dessous décrivent comment traiter les fichiers .csv à l'aide de scripts R personnalisés (Fichier supplémentaire) et en ajoutant les informations directionnelles par le biais de l'édition manuelle.

1. Ouvrez le fichier .csv comme feuille de calcul. Sélectionnez la colonne Track ID, cliquez sur la plus petite option Sort à la plus grande et acceptez Élargir la sélection. Après le tri, Track ID identifie chaque branche dendritique unique, et les taches de la même branche partagent le même ID track. La colonne Temps stocke les informations de différents délais.
2. Dans la feuille de calcul, ajouter une colonne Distance. Calculer la distance de chaque deux points adjacents temporellement à l'aide de leurs coordonnées et mettre les valeurs dans la colonne Distance (Figure 4A).
3. Mouvements mineurs au niveau du voxel unique. Sur la base des paramètres d'imagerie, 0,3 m sont généralement des artefacts provenant d'une dérive non corrigée ou d'une annotation d'image imparfaite. Filtrer ces mouvements en réinitialisant toutes les valeurs de distance inférieures à 0,3 m à 0. Traitez plusieurs fichiers .csv manuellement ou utilisez notre filtrage de colonne de script R. R (Fichier supplémentaire).
4. Générer manuellement une nouvelle colonne nommée Déplacement dans la feuille de calcul. Copiez les valeurs de la colonne Distance à la colonne De déplacement. Attribuez manuellement les événements d'extension et de rétraction pour chaque extrémité de branche. S'il s'agit d'une extension, laissez la valeur de déplacement inchangée, ce qui est une valeur positive. S'il s'agit d'une rétractation, modifiez la valeur de déplacement correspondante en valeur négative (p. ex., 0,35 à -0,35) (figure 4B).
5. Générer une nouvelle colonne nommée Event. Dans cette colonne, résumer manuellement les valeurs de déplacement pour les événements individuels d'extension et de rétraction (figure 4B).
6. Traiter la feuille de calcul modifiée et quantifier les événements d'extension et de rétraction en fonction de leurs valeurs de déplacement à l'aide de la somme de la colonne de script R. R (Fichier supplémentaire). Les paramètres de sortie incluent le nombre d'événements d'extension, Nombre d'événements de rétraction, Longueur cumulative prolongée, Longueur cumulative rétractée, Longueur nette modifiée, et longueur totale parcourue .

Résultats

À l'aide du protocole d'imagerie en direct décrit ci-dessus, nous capturons des piles d'images haute résolution pour les analyses et la quantification ultérieures. La vidéo supplémentaire 1 montre la série d'images projetées d'intensité maximale (MIP) recueillies auprès d'un représentant étiqueté individuellement LNv. Figure 2B montre le montage correspondant de huit images de la série d'images. Dans les deux panneaux, les po...

Discussion

Ici, nous décrivons un protocole que nous avons développé pour enregistrer et quantifier le comportement dynamique des branches dendritiques dans les neurones individuellement étiquetés dans les cerveaux larvaires de Drosophila. Notamment, notre protocole d'imagerie en direct contient des paramètres spécifiques qui nous permettent de capturer l'ensemble de l'arborescence dendritique d'un LNv larvaire et de fournir une vue globale de l'état dynamique de ses branches dendrite. Cependant, parce que nos méthodes de ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Chameleon Vision II Laser multiphotonique	Graisse cohérente
sous vide poussé	Dow Corning	79751-30
LSM 780 Microscope confocal à balayage laser à deux photons	Carl Zeiss	Configuration verticale
microscope Verre	Fisher Scientific	12-544-E
Superfrost Plus Lames de microscope	Fisher Scientific	12-550-15
Software
Excel	Microsoft		pour le traitement des fichiers .csv
Huygens Professional	Scientific Volume Imaging	pour la correction de la dérive et la déconvolution
Imaris	Oxford Instruments		pour la visualisation 3D et l’annotation d’images
< strong>Reagents
Glucose
HEPES
KCl
MgCl2
NaCl
NaHCO3
PBS
Saccharose
TES