Isolement fiable des micronavires du système nerveux central dans cinq groupes de vertébrés

Notre cerveau est l'organe le plus important de notre corps. Pour cette raison, garder l'homéostasie du cerveau en dépit de facteurs externes qui peuvent déclencher une déviation de la normalité est une priorité. Selon certains chercheurs, il y a environ 400 à 500 millions d'années¹, les animaux vertébrés ont développé ce que nous connaissons aujourd'hui comme la barrière hémato-encéphalique (BBB)^2,3. Cette « clôture » protectrice exerce la plus grande influence sur l'homéostasie et les fonctions du système nerveux central (SNC) en régulant étroitement le transport des ions, des molécules et des cellules entre le sang et le parenchyme du SNC. Lorsque le BBB est perturbé, le cerveau devient sensible à l'exposition toxique, l'infection et l'inflammation. Par conséquent, le dysfonctionnement de BBB est associé à beaucoup, sinon tous, désordres neurologiques et neurodevelopmental^4,5,6.

La fonction sophistiquée du BBB est attribuée à la microvasculature unique du SNC conforme par l'unité neurovasculaire (NVU)^2,3. Les cellules endothéliales hautement spécialisées, les péricytes et les pieds d'extrémité astrocytiques sont les composants cellulaires du NVU^2,3. La matrice extracellulaire générée par ces cellules est également essentielle à la physiologie NVU et BBB^2,3. Bien que les composants cellulaires et moléculaires essentiels de la NVU soient conservés chez les vertébrés, l'hétérogénéité est signalée chez les ordres et les espèces^7,8. Cependant, les limitations techniques entravent notre capacité à considérer pleinement ces différences dans la neurobiologie, la recherche biomédicale ou translationnelle.

Pour cette raison, nous avons élargi une méthode d'isolement micronavire spécifique à la région du SNC pour la rendre applicable à de nombreuses espèces des cinq groupes de vertébrés : poissons, amphibiens, reptiles, oiseaux et mammifères. Le protocole est décrit pour une utilisation sur les vertébrés de petite-lissencéphale et de grande gyrencéphalie, y compris les espèces avec la pertinence translationnelle^9. En outre, nous incluons d'autres régions du SNC non étudiées auparavant dans ce contexte, mais pertinentes à la neurophysiologie et avec des implications cliniques énormes : l'hypothalamus, l'hypotuitaire et la matière blanche. Enfin, nous avons testé la capacité de cette méthode d'isolement comme un outil fiable pour identifier les changements dans l'expression des protéines le long de la NVU et / ou BBB^9,10^,11. Comme preuve de concept, nous avons montré comment déterminer les changements dans l'expression VCAM-1 et JAM-B pendant EAE utilisant la méthode d'isolement suivie de l'immunofluorescence.

Toutes les procédures de la présente étude sont conformes aux lignes directrices fixées par l'Université de Californie (UC), le Davis Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Les soins aux animaux de l'UC Davis sont réglementés par plusieurs ressources indépendantes et sont entièrement accrédités par l'Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) depuis 1966. Les tissus porcins du SNC ont été obtenus auprès du Département des sciences animales de l'UCD, Laboratoire des sciences de la viande. Les tissus de CNS des macaques de rhesus ont été obtenus du département de pathologie de centre national de primate de la Californie (NIH P51OD011107). Aucune anesthésie, euthanasie, ou autopsie n'a été exécutée par le personnel de laboratoire sur des porcs et des macaques. Par conséquent, il n'y a pas de recommandations particulières à ce sujet.

REMARQUE : Cette méthode a été validée pour plusieurs espèces, mais le protocole fourni correspond plus directement aux tissus de souris et de porcin. Les détails relatifs au lobe optique ne s'appliquent pas lors de l'utilisation de spécimens de mammifères. Tous les matériaux biodangereux doivent être manipulés dans une installation de biosécurité appropriée (BSL). Tous les matériaux extrêmement toxiques doivent être manipulés sous une hotte de fumée. Tous les déchets médicaux biodangereux et les déchets extrêmement toxiques doivent être éliminés correctement.

1. Préparation

1. Préparer des solutions (tableau 1) au moins un jour à l'avance.
   REMARQUE: Il est très difficile de dissoudre 70 kDa poids moléculaire (MW) dextran. Il est plus efficace de laisser la solution remuer toute la nuit recouverte d'un film de paraffine ou d'une feuille. Le protocole exige l'utilisation de deux solutions MV-2 différentes selon le spécimen à l'étude. Le dextran de 18% sépare efficacement la myéline de la pastille de microvessel lors de l'exécution du protocole sur de petits spécimens lissencephalic. Cependant, il développe un frottis de myéline dans l'interface des tissus du SNC à partir de grands spécimens gyrencéphaliques, ainsi que l'hypothalamus et l'hypotuitaire de petits spécimens. Ce frottis est empêché en utilisant 20% dextran.
2. Préparer les toboggans bien en chargeant 50 L par puits de poly-Lysine et laisser sécher pendant 2 h à température ambiante (RT), de préférence dans une classe 2 de coffret de sécurité biologique (BSC-2). Ne pas trop sécher. Rincer deux fois à l'alin tamponné par le phosphate (PBS) et conserver au réfrigérateur jusqu'à ce qu'il soit prêt à l'emploi.

2. Dissection tissulaire du SNC à partir d'un petit spécimen de vertébré lissencéphalique

REMARQUE: L'article démontre l'application du protocole sur un C57BL6/J, 10 semaines, 25 g, souris mâle.

1. Préparer deux tubes coniques de 15 ml et un tube microcentrifuge de 1,7 ml avec 5 ml et 1 ml, respectivement, de la solution MV-1 par spécimen. Gardez les tubes sur la glace.
2. Anesthésie
   1. Anesthésiez les souris par injection intrapéritonéale d'une kétamine, de xylazine et d'acépromazine cocktail anesthésique à 100/10/3 mg par kg de poids corporel et vaporisez avec 70 % d'éthanol. Confirmer l'anesthésie en évaluant l'absence de réflexes palpébrals et de pédales en touchant un œil et en pinçant un pied, respectivement.
   2. Anesthésiez les pigeons par inhalation de 5% d'isoflurane à l'aide d'une boîte d'anesthésie par induction.
   3. Anesthésiez les poissons et les grenouilles en 1 % de Tricaine dans un réservoir d'eau de retenue de poisson ou dans la solution de ringer d'amphibiens (Table of Materials), respectivement.
   4. Anesthésiez les lézards en refroidissant à 4 oC avant l'euthanasie.
3. Décapiter l'animal avec des ciseaux chirurgicaux, éplucher la peau avec des forceps pour exposer le crâne, et couper avec des ciseaux LaGrange à travers le magnum foramen (Figure 1A).
4. Disséquer le cerveau avec une spatule et transférer dans un tube conique de 15 ml avec la solution MV-1. Gardez le tube sur la glace.
5. Récupérer l'hypotuitaire de la sella turcica du crâne avec des forceps et transférer dans un tube microcentrifuge de 1,7 ml avec la solution MV-1. Gardez le tube sur la glace.
6. Enlever la peau et le muscle pour exposer la colonne vertébrale. Découper les membres, la cage thoracique et les organes internes (Figure 1B).
7. Disséquer la moelle épinière par l'une des deux méthodes décrites ci-dessous. Ensuite, transférer dans un tube conique de 5 ml avec la solution MV-1. Gardez le tube sur la glace.
   1. Effectuer lalactomie en coupant dans une direction rostrale à caudale avec des ciseaux LaGrange, en commençant par le foramen vertébralcervical, jusqu'à atteindre le cordon lombaire.
   2. Effectuer le rinçage dans une direction caudale à rostral dans tout le foramen vertébral lombaire avec une aiguille de 18 G et une seringue de 10 ml chargée de solution MV-1(figure 1C,D).
      REMARQUE : Cette méthode ne fonctionne qu'avec de très petits spécimens, principalement des rongeurs (100 g).
8. À l'aide d'une lunette de dissection, couper le sac dural de la moelle épinière à l'aide de ciseaux à ressort et enlever les méninges restantes à l'aide d'un pic à double volet(figure 2).
9. Transférer le cerveau dans un plat Petri et, à l'aide d'une portée de dissection, enlever les méninges à l'aide d'un pic à deux volets (Figure 2A-C).
10. Excisez les bulbes olfactifs et le thalamus avec des forceps, des ciseaux d'iris et des ciseaux de ressort. À l'aide de la pioche à double volet, retirer le plexus choroïde de tous les ventricules du cerveau. Assurez-vous d'enlever tous les plexus choroïdes.
    REMARQUE : Le plexus choroïde et les bulbes olfactifs sont une source massive de contamination. Contrairement au BBB, ces capillaires sont fortement fenestrés et les résultats des expériences ultérieures seront compromis s'ils ne sont pas enlevés.
11. À l'aide de forceps, séparez les régions distinctes du SNC : cortex, cervelet, tronc cérébral, lobe optique (pas sur des spécimens de mammifères) et hypothalamus.

3. Dissection tissulaire du SNC d'un grand spécimen de vertébré gyncéphalique

REMARQUE : Ce protocole utilise des tissus porcins du SNC obtenus d'un abattoir. Par conséquent, aucune anesthésie, euthanasie, ou autopsie n'est décrite ou montrée ici.

1. Transport de tissus CNS porcins dans un conteneur d'histologie de 0,946 L (32 oz) chargé de la solution MV-1 à l'intérieur d'un glacière/seau.
2. À l'aide d'une lunette de dissection, retirez les méninges à l'aide d'un pic à deux volets, de forceps, de ciseaux à iris et de ciseaux de ressort de chaque tissu du SNC. Assurez-vous d'enlever tous les morceaux de plexus choroïde des ventricules du cerveau.

4. Homogénéisation des tissus du SNC

REMARQUE : Il est plus efficace quand deux investigateurs s'engagent dans le processus d'homogénéisation : un disséquant les méninges sous le stéréoscope et l'autre homogénéisant les tissus hachés. De cette façon, les tissus sont rapidement retournés au seau à glace et gardés au froid.

1. Placer chaque région du SNC sur un plat Petri avec une solution MV-1 d'une ml. À l'aide d'une lame à bord unique, hacher le tissu pour obtenir des morceaux d'un 2 mm.
   1. Pour un petit spécimen de vertébrés, utilisez un plat Petri de 100 mm x 20 mm.
   2. Pour un gros spécimen de vertébrés, utilisez un plat Petri de 150 mm x 15 mm.
2. Homogénéisation d'un petit spécimen de vertébré(tableau 2 et tableau 3)
   1. Transférer le cortex, le cervelet, le tronc cérébral, le lobe optique et la moelle épinière à 1 ml de solution MV-1 dans un broyeur de tissu en verre Potter-Elvehjem de 10 ml avec un pilon PTFE à l'aide d'une pipette de transfert. Ajouter 5 ml de solution MV-1 et homogénéiser chaque tissu (10 coups). Transférer sur des tubes coniques individuels de 15 ml. Gardez les tubes sur la glace.
      REMARQUE : Pour un petit vertébré de 5 ou 4 ans, avec ou sans lobe optique, respectivement, des broyeurs Potter-Elvehjem de 10 ml et des tubes coniques de 15 ml sont nécessaires.
   2. Transférer l'hypothalamus et l'hypotuitrie avec des forceps à 100 oL de la solution MV-1 dans un tube individuel de 1,7 ml et homogénéiser soigneusement avec un micropestle en verre. Rincer chaque micropestle avec une solution MV-1 de 1 ml. Gardez le tube sur la glace.
      REMARQUE : Pour un petit vertébré, 2 micropestles en verre et 1,7 ml de tubes sont nécessaires.
3. Homogénéisation d'un grand spécimen de vertébrés (tableau 4 et tableau 5)
   1. À l'aide d'une pipette de transfert, transférer le tissu haché dans un broyeur de tissu en verre Potter-Elvehjem de 55 ml à l'aide d'un pilon PTFE et attacher à l'agitateur supérieur. Ajouter la moitié du volume recommandé de la solution MV-1, selon la partie spécifique du SNC homogénéisée (tableau 5).
   2. Allumez l'agitateur supérieur à très basse vitesse (150 tr/min) et déplacez soigneusement le tube de verre de haut en bas pendant environ 30 s.
   3. Éteignez l'agitateur supérieur, ajoutez plus de solution MV-1 et répétez l'étape 4.3.2 jusqu'à obtenir une boue homogène.
   4. Transférer dans un tube conique de 50 ml. Gardez le tube sur la glace.
   5. Laver le broyeur avec de l'eau déionisée entre chaque homogénéisation des tissus du SNC.
      REMARQUE : Pour un grand vertébré 5 ou 4, avec ou sans matière blanche, respectivement, des tubes coniques de 50 ml sont nécessaires. De même, deux (2) tubes coniques de 15 ml sont nécessaires pour l'hypothalamus et l'hypotuitaire.

5. Purification des micronavires

1. Les homogénéités de tissu centrifugeuses résultant de l'étape 4.2.1, 4.2.2, ou 4.3.4 à 2.000 x g pendant 10 min à 4 oC. Une grande interface blanche de myéline se formera sur le dessus des granulés des micronavires rougeâtres. Jetez les supernatants.
   1. Petit spécimen de vertébré(tableau 2 et tableau 3)
      1. Resuspendre le cortex, le cervelet, le tronc cérébral, le lobe optique et les granulés de moelle épinière dans 5 ml de solution MV-2 glacée avec une pipette sérologique de 5 ml (10 rincés). Ajouter 5 ml de solution MV-2 glacée à chaque suspension et mélanger soigneusement en retournant les tubes.
      2. Resuspendre l'hypothalamus et les granulés pituitaires avec 1 ml de solution MV-2.
   2. Grand spécimen de vertébré(tableau 4 et tableau 5)
      1. Ajoutez 20 ml de solution MV-2 glacée au cortex, au cervelet, au tronc cérébral et aux granulés de microvessel de la moelle épinière. Resuspendre les granulés en mélangeant sur un shaker de revolver de tube, en remuant à 40 tr/min pendant 5 min. Équilibrez les volumes des tubes coniques du cortex, du cervelet, du tronc cérébral, et des suspensions de moelle épinière en ajoutant plus de solution MV-2.
      2. Resuspendre les granulés hypothalamus et pituitaires de microvessel dans 5 ml de solution MV-2 avec une pipette sérologique de 5 ml (10 rinçages). Ajouter 5 ml de solution MV-2 glacée aux suspensions et mélanger soigneusement en retournant le tube.
2. Centrifugeuse à 4 400 x g pendant 15 min à 4 oC.
3. Détachez soigneusement la couche épaisse et dense de myéline sur l'interface liquide des parois de chaque tube en tournant lentement les tubes et en permettant au supernatant de passer le long des murs.
4. Jeter la myéline et l'interface liquide et effacer le mur intérieur de chaque tube avec une spatule enveloppée d'une lingette en papier à faible teneur en papier. Pour les petits spécimens de vertébrés, retirer la couche de myéline de chaque hypothalamus et tube pituitaire en s'assousiant soigneusement à l'aube d'une pipette de transfert.
5. Essuyez l'excès de liquide à l'œil d'une lingette en papier à faible teneur en papier tordue. Resuspendre chaque granule avec 1 ml de solution MV-3 à l'aide de pointes à faible liaison. Gardez les tubes sur la glace.

6. Elution et filtration de micronavires

1. Verser la solution MV-3 glacée dans les béchers individuels pour chaque région du SNC. Conserver à 4 oC.
   1. Pour les petits spécimens de vertébrés, utiliser 10 ml de solution MV-3 par bécher de 50 ml. Un total de 6 à 7 béchers est nécessaire selon que le lobe optique est inclus ou non.
   2. Pour les grands spécimens de vertébrés, utiliser 30 ml de solution MV-3 par bécher de 100 ml. Un total de 6 à 7 béchers est nécessaire selon que la matière blanche est incluse ou non.
2. Placer une passoire cellulaire sur un tube conique de 50 ml. Utilisez-en un par région du SNC. Utilisez une passoire de 100 m pour le cortex, le tronc cérébral, le lobe optique, la moelle épinière et l'hypotuitaire. Utilisez une passoire cellulaire de 70 m pour le cervelet et l'hypothalamus.
3. Mouiller chaque passoire avec 1 ml de solution MV-3 glacée.
4. Ajoutez plus de solution MV-3 aux suspensions préparées à l'étape 5.5 avec une pipette sérologique tout en mélangeant pour éviter les agrégats. Chargez soigneusement les micronavires sur le dessus de la passoire. Rincer à la solution MV-3 glacée.
   1. Pour les petits spécimens de vertébrés(tableau 2 et tableau 3),ajoutez 10 à 15 ml de solution MV-3 avec une pipette sérologique et rincez avec 5 ml de solution MV-3.
   2. Pour les grands spécimens de vertébrés, ajouter 20 ml de solution MV-3 avec une pipette sérologique et rincer avec 10 ml de solution MV-3.
5. Assembler l'unité de filtration en plaçant un filtre à filet en nylon de 20 m sur un porte-filtre modifié (figure 2D), un par région du SNC.
   1. Pour les petits spécimens de vertébrés(tableau 2 et tableau 3),utilisez des supports de filtre modifiés de 25 mm pour le cortex, le cervelet, le tronc cérébral, le lobe optique et la moelle épinière. Utilisez des supports de filtre modifiés de 13 mm pour l'hypothalamus et l'hypotuitaire.
   2. Pour les grands spécimens de vertébrés(tableau 4 et tableau 5),utilisez des supports de filtre modifiés de 47 mm pour le cortex, le cervelet, le tronc cérébral et la moelle épinière. Utiliser 25 mm pour l'hypothalamus et l'hypotuitaire.
6. Placez le filtre sur un tube conique de 50 ml et un filtre humide avec 5 ml de solution MV-3 glacée pour s'assurer que le tampon verse le support du filtre vers le tube conique.
7. Transférer les micronavires éliqués (à partir de l'étape 6.4) sur le dessus du filtre à filet en nylon de 20 m et rincer les micronavires avec une solution MV-3 glacée de 5 à 10 ml.
8. Récupérer le filtre à l'aide de forceps propres et l'immerger dans le bécher contenant la solution MV-3 glacée préparée à l'étape 6.1.
9. Détachez les micro-navires du filtre en le secouant doucement pendant environ 30 s. Pour les petits spécimens de vertébrés, versez la teneur en bécher dans un tube conique de 15 ml. Pour les grands spécimens de vertébrés, versez la teneur en bécher dans un tube conique de 50 ml.
10. Centrifugeuse à 2 000 x g pendant 5 min à 4 oC et suspendez la pastille dans 1 ml de solution MV-3 glacée à l'aide d'une pointe de pipette à faible liaison.
    1. Pour les petits spécimens de vertébrés, transférer la suspension (à partir de l'étape 6.10) dans un tube microcentrifuge de 1,7 ml et une centrifugeuse à 20 000 x g pendant 5 min à 4 oC.
       REMARQUE : Cette rotation est effectuée sur une centrifugeuse de banc à vitesse maximale (20 000 x g)pour assurer un rendement robuste.
    2. Pour les grands spécimens de vertébrés, transférer la suspension de l'étape 6.10 dans un tube microcentrifuge de 5,0 ml, ajouter 4 ml de solution MV-3, et centrifugeuse à 2 000 x g pendant 5 min à 4 oC.

7. Immunostaining

REMARQUE : La coloration de l'hématoxylin et de l'éosine (H et E) a été réalisée sur des spécimens de reptiles, d'amphibiens et de poissons comme preuve de concept de la faisabilité du protocole. Par conséquent, il n'y a aucune recommandation pour l'immunolabeling pour ces spécimens.

1. Retirer le supernatant des tubes de microcentrifuge.
2. Resuspendre la pastille en 1x PBS stérile à l'aide d'une pointe de pipette à faible liaison (Tableau des matériaux). Empêchez les micronavires de former des agrégats en tapotage plusieurs fois. Pour les petits spécimens de vertébrés(tableau 3),utilisez 100 l à 2 000 l selon la taille des granulés. Pour les grands spécimens de vertébrés(tableau 5),utilisez 1 000 l 4 000 l selon la taille des granulés.
3. À l'aide d'une pointe de pipette à faible liaison, transférer les micronavires sur des toboggans bien, en prenant soin de les ajouter au centre de chaque puits, en évitant les parois latérales.
4. Mettre les toboggans de puits, à découvert, à l'intérieur d'un BSC-2, et laisser sécher pendant 20 à 30 min à RT.
   REMARQUE : Un volume relativement élevé de 1x PBS est utilisé pour éviter la formation d'agrégats. Pour cette raison, il est nécessaire de laisser sécher les glissières avant la fixation pour s'assurer que les micronavires sont détenus par le revêtement poly-D-lysine.
5. Enlever les résidus de 1x PBS en pipeting à l'extérieur avec une pipette de transfert, ajouter 200 'L de paraformaldehyde (PFA) et incuber pendant 30 min à RT.
6. Pipette sur la solution fixative et laver 3x avec 200 L de 1x PBS pendant 5 min à RT.
   REMARQUE : Des taches de H et E sur des micronavires de poissons, d'amphibiens et de reptiles du SNC ont été réalisées à ce stade.
7. Ajouter 200 l de tampon de blocage à la glissière du puits et incuber pendant 60 min à 37 oC.
8. Retirez le tampon de blocage à l'arme de transfert et ajoutez 200 l du cocktail d'anticorps primaire dans le diluant d'anticorps(Tableau des matériaux). Incuber à 4 oC pendant la nuit.
9. Pipette sur le cocktail d'anticorps primaire et laver 3x avec 200 L de 1x PBS pendant 5 min à RT.
10. Chargez le cocktail d'anticorps secondaire (Table of Materials) dilué en 1x PBS et incuber pendant 2 h à RT, à l'abri de la lumière.
11. Pipette sur le cocktail d'anticorps secondaire et laver 3x avec 200 L de 1x PBS pendant 5 min à RT, protégé de la lumière. Après le dernier lavage détacher le cadre du puits et sécher à l'air libre tout excès de 1x PBS avec une lingette en papier à faible charpente.
12. Ajoutez un couvercle, un milieu de moninature antifade liquide et un support antifade liquide et un support antifade liquide de 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) pour la coloration nucléaire. Laisser sécher toute la nuit à RT protégé de la lumière.
13. Une fois au sec, restez à l'abri de la lumière sur une boîte à glissière à 4 oC jusqu'à ce qu'il soit prêt pour la microscopie confocale et l'acquisition de données.

Les microvessels isolés du SNC murine ont montré tous les composants cellulaires intrinsèques de l'unité neurovasculaire2,3. Utilisation de la molécule d'adhérence des cellules endothéliales plaquettaires-1 (PECAM, également connue sous le nom de CD31) ou de l'isolectin IB4 (une glycoprotéine qui lie la cellule endothéliale glycocalyx) pour les cellules endothéliales, Le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFTRD) ou antigène neuronal-glial 2 (NG2) pour les péritéytes et l'aquaporine-4 (AQP4) pour les pieds d'extrémité astrocytiques(figure 3A,B) démontre que ces composants intrinsèques sont présents dans les micronavires isolés. Les régions du SNC visibles comprennent les microvaisseaux corticaux (figure 3B),le cervelet (figure 3C), l'hypotuitaire (figure 3D),l'hypothalamus (figure 3E),le tronc cérébral (figure 3F), et la moelle épinière (figure 3G). Tous ont montré l'expression de ces marqueurs canoniques.

De même, les micronavires ont montré l'expression de la protéine de jonction adhérente VE-cadherin (Figure 4A,C), protéines de jonction serrées claudin-5 et zonula occludens-1 (CLDN5 et ZO-1, Figure 4A,D), protéine de jonction tricellulaire angulin-1 (Figure 4A,E) et marqueurs apicobasal C-X-C motif chemokine ligand 12 et gamma-glutamyltransferase 1 (CXCL12 et GGT1, Figure 4A,F). Ces résultats sont pertinents parce que ces protéines sont des indicateurs des propriétés pivots BBB-spécifiques9,12,13,14. Une présence limitée d'astrocytes, d'oligodendrocytes et de neurones exprimant des protéines acide fibrillaires gliales (GFAP, Figure 4B,C,G),des protéines spécifiques à l'oligodendrocyte (OSP, Figure 4B,G),et neurofilament-moyen (NFM, Figure 4B,H),respectivement, démontre que les micronavires isolés présentaient des traces négligeables de cellules non neurovasculaires non neurovasculaires non neurovasculaires non indésirables. De plus, la majorité des micronavires étaient dépourvus de l'expression de l'actine musculaire lisse (SMA, Figure 5B,C). Ceci est pertinent parce que l'AMS est un marqueur pour les cellules musculaires lisses associées aux artérioles et aux œilles(figure 5A),ce qui indique que ce protocole d'isolement cible sélectivement les micronavires de petit calibre15.

Les micronavires obtenus à partir d'autres petits vertébrés lissencéphaliques partagent certaines caractéristiques morphologiques, comme on le voit chez les poissons (grenouille et lézard non montré) et les micronavires aviaires. Cela donne à penser que cette méthode est utile pour caractériser davantage les différences dans les VUN entre les espèces (figure 6). De plus, les micronavires aviaires du SNC(figure 6H-N)présentaient une réactivité croisée avec bon nombre des anticorps développés pour l'homme et la souris. Cela encourage l'étude plus approfondie des spécimens aviaires pour des études biologiques et biomédicales de BBB. Nous avons observé des résultats similaires lorsque nous avons isolé des micronavires de porcs et de macaques, deux espèces gyncéphaliques (figure 7). Seuls les marqueurs canoniques NVU dans les micronavires porcins sont montrés. En plus des régions susmentionnées du SNC, nous avons pu isoler les micronavires de la matière blanche périventriculaire(figure 7B). Ceci est pertinent parce que la matière blanche est impliquée dans des conditions neuroinflammatoires (par exemple, la sclérose en plaques16,17,18).

Nous voulions savoir si cette méthode pouvait être utilisée comme un outil fiable pour déterminer les changements dans l'expression des protéines. Sachant que VCAM-1 et JAM-B ont été impliqués dans le processus neuro-inflammatoire à la moelle épinière pendant EAE, nous avons décidé de quantifier l'expression de ces protéines aux stades de pointe et chroniques des souris EAE et faux-témoins (10 souris C57BL/6J de la semaine)9,10,11. Pour ce faire, nous avons mesuré l'unité arbitraire d'intensité (AUI) le long du diamètre des micronavires. Ensuite, à l'aide d'un seuil de 20 AUI pour le DAPI, nous avons calculé la zone sous la courbe (AUC) pour VE-cadherin, VCAM-1 et JAM-B pour 50 micronavires par région du SNC(figure 8A,B). Enfin, nous avons effectué l'ANOVA bidirectionnel suivi de l'essai post-hoc de Sidak pour déterminer la signification statistique des changements dans l'expression des protéines.

Comme prévu, nous avons observé une augmentation du VCAM-1 et du JAM-B le long des micronavires de la moelle épinière au plus fort de l'EAE(figure 8D,E). Cependant, nous avons observé des changements dans d'autres régions du SNC qui n'avaient pas été signalés auparavant pour l'EAE. Le VCAM-1 a augmenté de manière significative dans les microvessels pituitaires et a diminué dans les microvessels d'hypothalamus et de tronc cérébral. Il y a eu des changements au cours de l'EAE chronique dans tous les tissus du SNC (figure 8D). LE JAM-B a augmenté de façon significative dans les micronavires hypothalamus et pituitaires pendant l'EAE chronique (figure 8E). Fait intéressant, nous avons observé des changements dans ve-cadherin le long des micronavires isolés de l'hypothalamus et du tronc cérébral pendant le pic de l'EAE, le cervelet pendant l'EAE chronique(figure 8C), et une diminution de la largeur des micronavires pituitaires pendant le pic et l'EAE chronique. Dans l'ensemble, ces données suggèrent que cette méthode d'isolement des micronavires est un outil utile pour caractériser les changements dans les modèles régionaux d'expression des protéines pendant la santé et la maladie.

Figure 1 : Dissection efficace de moelle épinière sans laminectomy. La dissection de la moelle épinière à partir de petits spécimens de vertébrés (jusqu'à 100 g) est effectuée plus rapidement et plus efficacement en rinçant le cordon dans une direction caudale à rostrale dans tout le foramen vertébral. À l'aide de ciseaux disséquants, la tête est enlevée par l'articulation de l'atlas et la colonne vertébrale est découpée par la hanche (A). Tous les organes de remaing sont enlevés, ne laissant que la colonne vertébrale (B). La moelle épinière dans le foramen vertébral lombaire apparaît comme un très petit cercle blanc (diamètre de 1 mm) par rapport à la largeur du cordon cervical (B, flèches jaunes). Garder une ouverture étroite au foramen vertébral lombaire facilite un gradient de pression de la colonne lombaire à la colonne cervicale lors de la rinçage avec une aiguille de 18 G et 10 cc seringue chargée de 1x PBS (C et D). Une fois rincée, la moelle épinière(D, flèche jaune) est presque totalement dépourvue du sac dural, et seule la pia doit être enlevée sous la portée de dissection. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Outil de dissection de pique à double volet et porte-filtre modifié. Cet outil de dissection de 11 cm de long (A) a deux points très pointus, presque horizontalement opposés, 2 mm de bout en bout (B). En appliquant une légère pression vers le bas et en tordant légèrement dans le sens des aiguilles d'une montre (C), les points s'intègrent horizontalement dans les méninges afin qu'ils puissent être soulevés vers le haut. Ceci est particulièrement utile lors de l'enlèvement des méninges du cervelet, car il permet l'accès dans la profondeur des folia cerebelli. Il est également très utile lors de l'élimination des méninges du tissu cortical, en particulier gyrencéphale. Dans ce cas, la pia est fortement intégrée avec la vascularisation de haut calibre qui compromettra la pureté de l'isolement de microsevessel. De même, il facilite l'élimination du plexus choroïde, qui est la source la plus semblable de contamination. Les supports de filtre de 47 mm, 25 mm et 13 mm de diamètre ont été coupés au laser pour enlever le connecteur d'intérieur (D) du compartiment supérieur (E), mais garder le composant de tamis (G). Cette modification a permis l'assemblage d'une unité de filtre (I,J) en plaçant le filet de filtre en nylon de 20 m sur le tamis et la partie inférieure (G,H), la sécurisation du filet en place lors de la vissement de la partie supérieure (E). Seul le porte-filtre de 25 mm est affiché. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Microvessels isolés de plusieurs régions du SNC ont exprimé des marqueurs d'unité neurovasculaire canonique. (A) À l'aide de l'immunolabeling et de la microscopie confocale, les composants cellulaires intrinsèques du NVU sont utilisés pour identifier les micronavires murines C57BL/6J de C57BL/6J adultes (8 à 14 semaines). Comme on le voit sur l'image de fusion pour les micronavires corticaux (B), au-dessus des images confocales individuelles pour le marqueur cellulaire endothélial CD31 (blanc), marqueur périgraphique PDGFR (rouge), et astrocytic end-feet marqueur AQP4 (vert) tous ces composants cellulaires sont conservés. Notez que la relation intime entre les cellules endothéliales et les péritéytes les font apparaître magenta sur l'image fusionnée, tandis que les pieds d'extrémité astrocytiques semblent avoir un halo qui les entoure (B). Le même modèle d'expression est observé pour le cervelet (C), pituitaire (D), hypothalamus (E), tronc cérébral (F), et la moelle épinière (G, DAPI, tache nucléaire - bleu; barre d'échelle de 10 m). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : Les micronavires exprimaient des protéines associées à des propriétés propres à BBB. Les cellules endothéliales de l'unité neurovasculaire (NVU) sont également décrites par les protéines associées à leurs propriétés intrinsèques de barrière (A). Comme on le voit dans la figure, les cellules endothéliales ont des jonctions faites de VE-cadherin, CLDN5, ZO-1 (A, jaune), et angulin-1 (A, sarcelle). Ils présentent également une polarité apicobasale à plusieurs protéines, y compris GGT-1 et CXCL12 (A, vert et rouge). Les neurones, les oligodendrocytes et les corps à cellules astrocytes peuvent être inclus dans les microvaisseaux isolés, bien qu'ils ne soient pas intrinsèques au NVU (B). Ceux-ci sont identifiables par l'expression de NFM (rouge), OSP (cyan), et GFAP (vert lime), respectivement (B). Conformément à ceux-ci, nos micronavires isolés ont exprimé des adhérences protéine VE-cadherin (C, rouge), protéines de jonction serrées CLDN5 et ZO-1(D, rouge et vert, respectivement, fusion - jaune), protéine de jonction tricellulaire LSR (E, vert), et marqueurs apicobasal CXCL12 et GGT1 (F, rouge et vert, respectivement). Ils ont également montré des quantités limitées de GFAP (A, vert, G,blanc), OSP (G, vert), et NFM (H, rouge), suggérant une rétention négligeable des cellules unitaires non neurovasculaires (DAPI, tache nucléaire - bleu; barre d'échelle de 10 m). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5 : La plupart des micronavires isolés n'expriment pas l'AMS. L'unité neurovasculaire présente une transition sophistiquée de l'artériole-capillary-venule (A). L'expression anulaire de l'ASM identifie clairement l'artériole, et comme il devient l'expression capillaire, 'SMA (B, rouge) l'expression diminue, exposant le marqueur mural NG2 (B, vert). Nous avons mesuré le diamètre des navires 'SMA' et 'SMA' (parenthèses blanches, n '20), afin de les distinguer comme des artérioles ou des capillaires (DAPI, tache nucléaire, bleu, barre d'échelle de 10 m). L'analyse non appariée du diamètre des navires de l'AMA et de la SMA a montré une signification statistique élevée (C, SMAMD - rouge, rouge/vert, 'p 'lt; 0.0001). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6 : Isolement réussi des micronavires du SNC par ceux d'autres espèces lissencephalic. Le SNC a été récolté à partir d'une grenouille pêchée à l'état sauvage (8,2 cm), d'un lézard (12,7 cm), d'une truite arc-en-ciel élevée en réservoir (2 ans, 35,6 cm) et d'un pigeon élevé à la volière (9 mois, 300 g). Les micronavires de la grenouille, du poisson et du lézard ont été tachés par h et E (seuls les micro-navires de la truite sont montrés, barre d'échelle de 20 m). Les micronavires de pigeon ont été immunolabeled. Nous avons pu identifier les micronavires sur toutes les régions comme indiqué sur les contours du poisson et du pigeon CNS : cortex (A et H), lobe optique (B et I), cervelet (C et J), pituitaire (D et L), hypothalamus (E et K), tronc cérébral (F et M), et moelle épinière (G et N). En outre, nous avons pu identifier les cellules endothéliales avec l'isolectin IB4 (blanc), les pieds d'extrémité astrocytiques avec AQP4 (vert), et les neurones adjacents avec NFM (rouge) des micronavires isolés du pigeon (DAPI, tache nucléaire - bleu, barre d'échelle ' 10 'm). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7 : Isolement des micronavires du SNC par les espèces gyncéphaliques. Le cerveau et la moelle épinière ont été disséqués à partir d'un porc élevé à la ferme (6 mois, 120 kg) pour l'isolement des micronavires et l'immunoétiquetage. Nous avons pu identifier les micronavires étiquetés positivement pour ib4 (blanc), PDGFR (rouge) et AQP4 (vert) sur toutes les régions du CNS porcin : cortex (A), matière blanche périventriculaire (B), cervelet (C), pituitaire (D), hypothalamus (E), tronc cérébral (F), et moelle épinière (G, DAPI, tache nucléaire, bleu). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 8 : Exemple d'autre application de l'isolement des micronavires du SNC. L'expression de JAB-B et vCAM-1 a été quantifiée pour les micronavires eAE murines. Des unités arbitraires d'intensité (AUI) ont été mesurées pour le cortex, le cervelet, l'hypothalamus, l'hypotuitaire, le tronc cérébral, et la moelle épinière des souris aux stades de pointe et chroniques de l'EAE, avec le faux comme contrôle (n - 4). Pour chaque région du SNC, douze micronavires ont été évalués par souris pour déterminer l'AUI par fluorochrome et le diamètre du micronavire (A). Les supports blancs montrent des exemples de l'outil de mesure du logiciel de microscope confocal utilisé pour déterminer l'AUI pour VCAM-1 (blanc), VE-cadherin (vert), JAM-B (rouge) et DAPI (bleu, barre d'échelle de 10 m). Ensuite, l'AUI résultant a été tracée contre le diamètre des microns (B) pour calculer la zone sous la courbe (AUC) pour chaque protéine immunolabeled comme estimation de l'expression de protéine. L'AUC moyen par groupe a ensuite été analysé par ANOVA bidirectionnelle, suivi du test post hoc de Sidak, pour un total de 48 micronavires par région du SNC. À l'exception des microvaisseaux pituitaires, nous n'avons observé aucune différence majeure entre le diamètre des micronavires associé à l'état de la maladie (C, insert), mais une diminution significative de l'expression VE-cadhérine de l'hypothalamus et du tronc cérébral chez les souris EAE (C). Une analyse statistique similaire a montré une augmentation significative pour VCAM-1 (D) et JAM-B (E) à la moelle épinière, compatible avec le statut neuroinflammatoire pendant le pic de l'EAE. Intéressant, nous avons également observé des changements pour VCAM-1 à l'hypothalamus, pituitaire, et le tronc cérébral. Ces résultats font l'objet d'une enquête (barres et points noirs, faux, barres rouges et points, pic EAE, barres et points de saumon, EAE chronique, 0,05, @p lt;0,01, #p-lt;0,001, et 0,0001). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Tableau 1 : Solutions utilisées dans le protocole.

Tableau 2 : Mise en page pour l'isolement des petits micronavires vertébrés. Ce graphique est une version abrégée du protocole lors de l'utilisation d'un spécimen lissencephalic.

Tableau 3 : Volume/taille recommandé. Ce contour a le volume recommandé de solutions pour l'utilisation d'un petit spécimen de vertébrés allant de 20 à 800 g, ou plus précisément, la souris de 25 g montrée sur la vidéo. L'ajustement final des volumes nécessaires doit être déterminé par le chercheur en fonction de la quantité spécifique de tissu humide obtenue après la dissection. La pratique et le dépannage sont fortement recommandés. CTX - cortex, CBL - cervelet, BST - tronc cérébral, OPT - lobe optique (non présent chez les mammifères), HYP , hypothalamus, PIT , pituitaire, SC et moelle épinière.

Tableau 4 : Mise en page pour l'isolement des grands micronavires vertébrés. Ce graphique est une version abrégée du protocole lors de l'utilisation d'un spécimen gyrencéphalique.

Tableau 5 : Volume/taille recommandé. Ce contour a le volume recommandé de solutions pour l'utilisation d'un grand spécimen de vertébrés. Plus précisément, il s'applique aux biopsies tissulaires du SNC de 45 cm3 pour le cortex, le cervelet, la matière blanche, le tronc cérébral, la moelle épinière, et l'hypothalamus et l'hypotuite entiers, comme le montre la vidéo. L'ajustement final des volumes nécessaires doit être déterminé par le chercheur en fonction de la quantité spécifique de tissu humide obtenue après la dissection. La pratique et le dépannage sont fortement recommandés. CTX - cortex, CBL - cervelet, WM - matière blanche, BST - tronc cérébral, HYP - hypothalamus, PIT - pituitaire, SC - moelle épinière.

Les auteurs n'ont rien à révéler.