Article de méthode

Isolement fiable des micronavires du système nerveux central dans cinq groupes de vertébrés

DOI :

10.3791/60291

⸱

12 janvier 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Physiology and Cell Biology, University of California Davis, 2University of Veterinary Medicine Hannover Foundation

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le but de ce protocole est d'isoler les micronavires de plusieurs régions du système nerveux central des vertébrés lissencephalic et gyrencephalic.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'isolement des microvaisseaux du système nerveux central (SNC) est généralement effectué en combinant le tissu cortical de plusieurs animaux, le plus souvent des rongeurs. Cette approche limite l'interrogation des propriétés de la barrière hémato-encéphalique (BBB) au cortex et ne permet pas de comparaison individuelle. Ce projet se concentre sur le développement d'une méthode d'isolement qui permet la comparaison de l'unité neurovasculaire (NVU) à partir de plusieurs régions du SNC : cortex, cervelet, lobe optique, hypothalamus, pituitaire, tronc cérébral et moelle épinière. En outre, ce protocole, initialement développé pour les échantillons de murine, a été adapté avec succès pour une utilisation sur les tissus du SNC à partir de petites et grandes espèces de vertébrés à partir de laquelle nous sommes également en mesure d'isoler les micronavires de la matière blanche de l'hémisphère cérébral. Cette méthode, lorsqu'elle est jumelée à l'immunolabeling, permet la quantitation de l'expression des protéines et la comparaison statistique entre les individus, le type de tissu ou le traitement. Nous avons prouvé cette applicabilité en évaluant des changements dans l'expression de protéine pendant l'encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAE), un modèle murine d'une maladie neuroinflammatoire, sclérose en plaques. En outre, les micronavires isolés par cette méthode pourraient être utilisés pour des applications en aval comme qPCR, RNA-seq, et Western blot, entre autres. Même s'il ne s'agit pas de la première tentative d'isoler les micronavires du SNC sans l'utilisation d'ultracentrifugation ou de dissociation enzymatique, il est unique dans son aptitude à la comparaison des individus isolés et de plusieurs régions du SNC. Par conséquent, il permet d'enquêter sur une gamme de différences qui pourraient autrement rester obscures : parties du SNC (cortex, cervelet, lobe optique, tronc cérébral, hypothalamus, pituitaire et moelle épinière), type tissu du SNC (matière grise ou blanche), individus, groupes de traitement expérimental et des espèces.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Notre cerveau est l'organe le plus important de notre corps. Pour cette raison, garder l'homéostasie du cerveau en dépit de facteurs externes qui peuvent déclencher une déviation de la normalité est une priorité. Selon certains chercheurs, il y a environ 400 à 500 millions d'années1, les animaux vertébrés ont développé ce que nous connaissons aujourd'hui comme la barrière hémato-encéphalique (BBB)2,3. Cette « clôture » protectrice exerce la plus grande influence sur l'homéostasie et les fonctions du système nerveux central (SNC) en régulant étroitement le transport des ions, des molécules et des cellules entre le sang et le parenchyme du SNC. Lorsque le BBB est perturbé, le cerveau devient sensible à l'exposition toxique, l'infection et l'inflammation. Par conséquent, le dysfonctionnement de BBB est associé à beaucoup, sinon tous, désordres neurologiques et neurodevelopmental4,5,6.

La fonction sophistiquée du BBB est attribuée à la microvasculature unique du SNC conforme par l'unité neurovasculaire (NVU)2,3. Les cellules endothéliales hautement spécialisées, les péricytes et les pieds d'extrémité astrocytiques sont les composants cellulaires du NVU2,3. La matrice extracellulaire générée par ces cellules est également essentielle à la physiologie NVU et BBB2,3. Bien que les composants cellulaires et moléculaires essentiels de la NVU soient conservés chez les vertébrés, l'hétérogénéité est signalée chez les ordres et les espèces7,8. Cependant, les limitations techniques entravent notre capacité à considérer pleinement ces différences dans la neurobiologie, la recherche biomédicale ou translationnelle.

Pour cette raison, nous avons élargi une méthode d'isolement micronavire spécifique à la région du SNC pour la rendre applicable à de nombreuses espèces des cinq groupes de vertébrés : poissons, amphibiens, reptiles, oiseaux et mammifères. Le protocole est décrit pour une utilisation sur les vertébrés de petite-lissencéphale et de grande gyrencéphalie, y compris les espèces avec la pertinence translationnelle9. En outre, nous incluons d'autres régions du SNC non étudiées auparavant dans ce contexte, mais pertinentes à la neurophysiologie et avec des implications cliniques énormes : l'hypothalamus, l'hypotuitaire et la matière blanche. Enfin, nous avons testé la capacité de cette méthode d'isolement comme un outil fiable pour identifier les changements dans l'expression des protéines le long de la NVU et / ou BBB9,10,11. Comme preuve de concept, nous avons montré comment déterminer les changements dans l'expression VCAM-1 et JAM-B pendant EAE utilisant la méthode d'isolement suivie de l'immunofluorescence.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les procédures de la présente étude sont conformes aux lignes directrices fixées par l'Université de Californie (UC), le Davis Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Les soins aux animaux de l'UC Davis sont réglementés par plusieurs ressources indépendantes et sont entièrement accrédités par l'Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) depuis 1966. Les tissus porcins du SNC ont été obtenus auprès du Département des sciences animales de l'UCD, Laboratoire des sciences de la viande. Les tissus de CNS des macaques de rhesus ont été obtenus du département de pathologie de centre national de primate de la Californie (NIH P51OD011107). Aucune anesthésie, euthanasie, ou autopsie n'a été exécutée par le personnel de laboratoire sur des porcs et des macaques. Par conséquent, il n'y a pas de recommandations particulières à ce sujet.

REMARQUE : Cette méthode a été validée pour plusieurs espèces, mais le protocole fourni correspond plus directement aux tissus de souris et de porcin. Les détails relatifs au lobe optique ne s'appliquent pas lors de l'utilisation de spécimens de mammifères. Tous les matériaux biodangereux doivent être manipulés dans une installation de biosécurité appropriée (BSL). Tous les matériaux extrêmement toxiques doivent être manipulés sous une hotte de fumée. Tous les déchets médicaux biodangereux et les déchets extrêmement toxiques doivent être éliminés correctement.

1. Préparation

  1. Préparer des solutions (tableau 1) au moins un jour à l'avance.
    REMARQUE: Il est très difficile de dissoudre 70 kDa poids moléculaire (MW) dextran. Il est plus efficace de laisser la solution remuer toute la nuit recouverte d'un film de paraffine ou d'une feuille. Le protocole exige l'utilisation de deux solutions MV-2 différentes selon le spécimen à l'étude. Le dextran de 18% sépare efficacement la myéline de la pastille de microvessel lors de l'exécution du protocole sur de petits spécimens lissencephalic. Cependant, il développe un frottis de myéline dans l'interface des tissus du SNC à partir de grands spécimens gyrencéphaliques, ainsi que l'hypothalamus et l'hypotuitaire de petits spécimens. Ce frottis est empêché en utilisant 20% dextran.
  2. Préparer les toboggans bien en chargeant 50 L par puits de poly-Lysine et laisser sécher pendant 2 h à température ambiante (RT), de préférence dans une classe 2 de coffret de sécurité biologique (BSC-2). Ne pas trop sécher. Rincer deux fois à l'alin tamponné par le phosphate (PBS) et conserver au réfrigérateur jusqu'à ce qu'il soit prêt à l'emploi.

2. Dissection tissulaire du SNC à partir d'un petit spécimen de vertébré lissencéphalique

REMARQUE: L'article démontre l'application du protocole sur un C57BL6/J, 10 semaines, 25 g, souris mâle.

  1. Préparer deux tubes coniques de 15 ml et un tube microcentrifuge de 1,7 ml avec 5 ml et 1 ml, respectivement, de la solution MV-1 par spécimen. Gardez les tubes sur la glace.
  2. Anesthésie
    1. Anesthésiez les souris par injection intrapéritonéale d'une kétamine, de xylazine et d'acépromazine cocktail anesthésique à 100/10/3 mg par kg de poids corporel et vaporisez avec 70 % d'éthanol. Confirmer l'anesthésie en évaluant l'absence de réflexes palpébrals et de pédales en touchant un œil et en pinçant un pied, respectivement.
    2. Anesthésiez les pigeons par inhalation de 5% d'isoflurane à l'aide d'une boîte d'anesthésie par induction.
    3. Anesthésiez les poissons et les grenouilles en 1 % de Tricaine dans un réservoir d'eau de retenue de poisson ou dans la solution de ringer d'amphibiens (Table of Materials), respectivement.
    4. Anesthésiez les lézards en refroidissant à 4 oC avant l'euthanasie.
  3. Décapiter l'animal avec des ciseaux chirurgicaux, éplucher la peau avec des forceps pour exposer le crâne, et couper avec des ciseaux LaGrange à travers le magnum foramen (Figure 1A).
  4. Disséquer le cerveau avec une spatule et transférer dans un tube conique de 15 ml avec la solution MV-1. Gardez le tube sur la glace.
  5. Récupérer l'hypotuitaire de la sella turcica du crâne avec des forceps et transférer dans un tube microcentrifuge de 1,7 ml avec la solution MV-1. Gardez le tube sur la glace.
  6. Enlever la peau et le muscle pour exposer la colonne vertébrale. Découper les membres, la cage thoracique et les organes internes (Figure 1B).
  7. Disséquer la moelle épinière par l'une des deux méthodes décrites ci-dessous. Ensuite, transférer dans un tube conique de 5 ml avec la solution MV-1. Gardez le tube sur la glace.
    1. Effectuer lalactomie en coupant dans une direction rostrale à caudale avec des ciseaux LaGrange, en commençant par le foramen vertébralcervical, jusqu'à atteindre le cordon lombaire.
    2. Effectuer le rinçage dans une direction caudale à rostral dans tout le foramen vertébral lombaire avec une aiguille de 18 G et une seringue de 10 ml chargée de solution MV-1(figure 1C,D).
      REMARQUE : Cette méthode ne fonctionne qu'avec de très petits spécimens, principalement des rongeurs (100 g).
  8. À l'aide d'une lunette de dissection, couper le sac dural de la moelle épinière à l'aide de ciseaux à ressort et enlever les méninges restantes à l'aide d'un pic à double volet(figure 2).
  9. Transférer le cerveau dans un plat Petri et, à l'aide d'une portée de dissection, enlever les méninges à l'aide d'un pic à deux volets (Figure 2A-C).
  10. Excisez les bulbes olfactifs et le thalamus avec des forceps, des ciseaux d'iris et des ciseaux de ressort. À l'aide de la pioche à double volet, retirer le plexus choroïde de tous les ventricules du cerveau. Assurez-vous d'enlever tous les plexus choroïdes.
    REMARQUE : Le plexus choroïde et les bulbes olfactifs sont une source massive de contamination. Contrairement au BBB, ces capillaires sont fortement fenestrés et les résultats des expériences ultérieures seront compromis s'ils ne sont pas enlevés.
  11. À l'aide de forceps, séparez les régions distinctes du SNC : cortex, cervelet, tronc cérébral, lobe optique (pas sur des spécimens de mammifères) et hypothalamus.

3. Dissection tissulaire du SNC d'un grand spécimen de vertébré gyncéphalique

REMARQUE : Ce protocole utilise des tissus porcins du SNC obtenus d'un abattoir. Par conséquent, aucune anesthésie, euthanasie, ou autopsie n'est décrite ou montrée ici.

  1. Transport de tissus CNS porcins dans un conteneur d'histologie de 0,946 L (32 oz) chargé de la solution MV-1 à l'intérieur d'un glacière/seau.
  2. À l'aide d'une lunette de dissection, retirez les méninges à l'aide d'un pic à deux volets, de forceps, de ciseaux à iris et de ciseaux de ressort de chaque tissu du SNC. Assurez-vous d'enlever tous les morceaux de plexus choroïde des ventricules du cerveau.

4. Homogénéisation des tissus du SNC

REMARQUE : Il est plus efficace quand deux investigateurs s'engagent dans le processus d'homogénéisation : un disséquant les méninges sous le stéréoscope et l'autre homogénéisant les tissus hachés. De cette façon, les tissus sont rapidement retournés au seau à glace et gardés au froid.

  1. Placer chaque région du SNC sur un plat Petri avec une solution MV-1 d'une ml. À l'aide d'une lame à bord unique, hacher le tissu pour obtenir des morceaux d'un 2 mm.
    1. Pour un petit spécimen de vertébrés, utilisez un plat Petri de 100 mm x 20 mm.
    2. Pour un gros spécimen de vertébrés, utilisez un plat Petri de 150 mm x 15 mm.
  2. Homogénéisation d'un petit spécimen de vertébré(tableau 2 et tableau 3)
    1. Transférer le cortex, le cervelet, le tronc cérébral, le lobe optique et la moelle épinière à 1 ml de solution MV-1 dans un broyeur de tissu en verre Potter-Elvehjem de 10 ml avec un pilon PTFE à l'aide d'une pipette de transfert. Ajouter 5 ml de solution MV-1 et homogénéiser chaque tissu (10 coups). Transférer sur des tubes coniques individuels de 15 ml. Gardez les tubes sur la glace.
      REMARQUE : Pour un petit vertébré de 5 ou 4 ans, avec ou sans lobe optique, respectivement, des broyeurs Potter-Elvehjem de 10 ml et des tubes coniques de 15 ml sont nécessaires.
    2. Transférer l'hypothalamus et l'hypotuitrie avec des forceps à 100 oL de la solution MV-1 dans un tube individuel de 1,7 ml et homogénéiser soigneusement avec un micropestle en verre. Rincer chaque micropestle avec une solution MV-1 de 1 ml. Gardez le tube sur la glace.
      REMARQUE : Pour un petit vertébré, 2 micropestles en verre et 1,7 ml de tubes sont nécessaires.
  3. Homogénéisation d'un grand spécimen de vertébrés (tableau 4 et tableau 5)
    1. À l'aide d'une pipette de transfert, transférer le tissu haché dans un broyeur de tissu en verre Potter-Elvehjem de 55 ml à l'aide d'un pilon PTFE et attacher à l'agitateur supérieur. Ajouter la moitié du volume recommandé de la solution MV-1, selon la partie spécifique du SNC homogénéisée (tableau 5).
    2. Allumez l'agitateur supérieur à très basse vitesse (150 tr/min) et déplacez soigneusement le tube de verre de haut en bas pendant environ 30 s.
    3. Éteignez l'agitateur supérieur, ajoutez plus de solution MV-1 et répétez l'étape 4.3.2 jusqu'à obtenir une boue homogène.
    4. Transférer dans un tube conique de 50 ml. Gardez le tube sur la glace.
    5. Laver le broyeur avec de l'eau déionisée entre chaque homogénéisation des tissus du SNC.
      REMARQUE : Pour un grand vertébré 5 ou 4, avec ou sans matière blanche, respectivement, des tubes coniques de 50 ml sont nécessaires. De même, deux (2) tubes coniques de 15 ml sont nécessaires pour l'hypothalamus et l'hypotuitaire.

5. Purification des micronavires

  1. Les homogénéités de tissu centrifugeuses résultant de l'étape 4.2.1, 4.2.2, ou 4.3.4 à 2.000 x g pendant 10 min à 4 oC. Une grande interface blanche de myéline se formera sur le dessus des granulés des micronavires rougeâtres. Jetez les supernatants.
    1. Petit spécimen de vertébré(tableau 2 et tableau 3)
      1. Resuspendre le cortex, le cervelet, le tronc cérébral, le lobe optique et les granulés de moelle épinière dans 5 ml de solution MV-2 glacée avec une pipette sérologique de 5 ml (10 rincés). Ajouter 5 ml de solution MV-2 glacée à chaque suspension et mélanger soigneusement en retournant les tubes.
      2. Resuspendre l'hypothalamus et les granulés pituitaires avec 1 ml de solution MV-2.
    2. Grand spécimen de vertébré(tableau 4 et tableau 5)
      1. Ajoutez 20 ml de solution MV-2 glacée au cortex, au cervelet, au tronc cérébral et aux granulés de microvessel de la moelle épinière. Resuspendre les granulés en mélangeant sur un shaker de revolver de tube, en remuant à 40 tr/min pendant 5 min. Équilibrez les volumes des tubes coniques du cortex, du cervelet, du tronc cérébral, et des suspensions de moelle épinière en ajoutant plus de solution MV-2.
      2. Resuspendre les granulés hypothalamus et pituitaires de microvessel dans 5 ml de solution MV-2 avec une pipette sérologique de 5 ml (10 rinçages). Ajouter 5 ml de solution MV-2 glacée aux suspensions et mélanger soigneusement en retournant le tube.
  2. Centrifugeuse à 4 400 x g pendant 15 min à 4 oC.
  3. Détachez soigneusement la couche épaisse et dense de myéline sur l'interface liquide des parois de chaque tube en tournant lentement les tubes et en permettant au supernatant de passer le long des murs.
  4. Jeter la myéline et l'interface liquide et effacer le mur intérieur de chaque tube avec une spatule enveloppée d'une lingette en papier à faible teneur en papier. Pour les petits spécimens de vertébrés, retirer la couche de myéline de chaque hypothalamus et tube pituitaire en s'assousiant soigneusement à l'aube d'une pipette de transfert.
  5. Essuyez l'excès de liquide à l'œil d'une lingette en papier à faible teneur en papier tordue. Resuspendre chaque granule avec 1 ml de solution MV-3 à l'aide de pointes à faible liaison. Gardez les tubes sur la glace.

6. Elution et filtration de micronavires

  1. Verser la solution MV-3 glacée dans les béchers individuels pour chaque région du SNC. Conserver à 4 oC.
    1. Pour les petits spécimens de vertébrés, utiliser 10 ml de solution MV-3 par bécher de 50 ml. Un total de 6 à 7 béchers est nécessaire selon que le lobe optique est inclus ou non.
    2. Pour les grands spécimens de vertébrés, utiliser 30 ml de solution MV-3 par bécher de 100 ml. Un total de 6 à 7 béchers est nécessaire selon que la matière blanche est incluse ou non.
  2. Placer une passoire cellulaire sur un tube conique de 50 ml. Utilisez-en un par région du SNC. Utilisez une passoire de 100 m pour le cortex, le tronc cérébral, le lobe optique, la moelle épinière et l'hypotuitaire. Utilisez une passoire cellulaire de 70 m pour le cervelet et l'hypothalamus.
  3. Mouiller chaque passoire avec 1 ml de solution MV-3 glacée.
  4. Ajoutez plus de solution MV-3 aux suspensions préparées à l'étape 5.5 avec une pipette sérologique tout en mélangeant pour éviter les agrégats. Chargez soigneusement les micronavires sur le dessus de la passoire. Rincer à la solution MV-3 glacée.
    1. Pour les petits spécimens de vertébrés(tableau 2 et tableau 3),ajoutez 10 à 15 ml de solution MV-3 avec une pipette sérologique et rincez avec 5 ml de solution MV-3.
    2. Pour les grands spécimens de vertébrés, ajouter 20 ml de solution MV-3 avec une pipette sérologique et rincer avec 10 ml de solution MV-3.
  5. Assembler l'unité de filtration en plaçant un filtre à filet en nylon de 20 m sur un porte-filtre modifié (figure 2D), un par région du SNC.
    1. Pour les petits spécimens de vertébrés(tableau 2 et tableau 3),utilisez des supports de filtre modifiés de 25 mm pour le cortex, le cervelet, le tronc cérébral, le lobe optique et la moelle épinière. Utilisez des supports de filtre modifiés de 13 mm pour l'hypothalamus et l'hypotuitaire.
    2. Pour les grands spécimens de vertébrés(tableau 4 et tableau 5),utilisez des supports de filtre modifiés de 47 mm pour le cortex, le cervelet, le tronc cérébral et la moelle épinière. Utiliser 25 mm pour l'hypothalamus et l'hypotuitaire.
  6. Placez le filtre sur un tube conique de 50 ml et un filtre humide avec 5 ml de solution MV-3 glacée pour s'assurer que le tampon verse le support du filtre vers le tube conique.
  7. Transférer les micronavires éliqués (à partir de l'étape 6.4) sur le dessus du filtre à filet en nylon de 20 m et rincer les micronavires avec une solution MV-3 glacée de 5 à 10 ml.
  8. Récupérer le filtre à l'aide de forceps propres et l'immerger dans le bécher contenant la solution MV-3 glacée préparée à l'étape 6.1.
  9. Détachez les micro-navires du filtre en le secouant doucement pendant environ 30 s. Pour les petits spécimens de vertébrés, versez la teneur en bécher dans un tube conique de 15 ml. Pour les grands spécimens de vertébrés, versez la teneur en bécher dans un tube conique de 50 ml.
  10. Centrifugeuse à 2 000 x g pendant 5 min à 4 oC et suspendez la pastille dans 1 ml de solution MV-3 glacée à l'aide d'une pointe de pipette à faible liaison.
    1. Pour les petits spécimens de vertébrés, transférer la suspension (à partir de l'étape 6.10) dans un tube microcentrifuge de 1,7 ml et une centrifugeuse à 20 000 x g pendant 5 min à 4 oC.
      REMARQUE : Cette rotation est effectuée sur une centrifugeuse de banc à vitesse maximale (20 000 x g)pour assurer un rendement robuste.
    2. Pour les grands spécimens de vertébrés, transférer la suspension de l'étape 6.10 dans un tube microcentrifuge de 5,0 ml, ajouter 4 ml de solution MV-3, et centrifugeuse à 2 000 x g pendant 5 min à 4 oC.

7. Immunostaining

REMARQUE : La coloration de l'hématoxylin et de l'éosine (H et E) a été réalisée sur des spécimens de reptiles, d'amphibiens et de poissons comme preuve de concept de la faisabilité du protocole. Par conséquent, il n'y a aucune recommandation pour l'immunolabeling pour ces spécimens.

  1. Retirer le supernatant des tubes de microcentrifuge.
  2. Resuspendre la pastille en 1x PBS stérile à l'aide d'une pointe de pipette à faible liaison (Tableau des matériaux). Empêchez les micronavires de former des agrégats en tapotage plusieurs fois. Pour les petits spécimens de vertébrés(tableau 3),utilisez 100 l à 2 000 l selon la taille des granulés. Pour les grands spécimens de vertébrés(tableau 5),utilisez 1 000 l 4 000 l selon la taille des granulés.
  3. À l'aide d'une pointe de pipette à faible liaison, transférer les micronavires sur des toboggans bien, en prenant soin de les ajouter au centre de chaque puits, en évitant les parois latérales.
  4. Mettre les toboggans de puits, à découvert, à l'intérieur d'un BSC-2, et laisser sécher pendant 20 à 30 min à RT.
    REMARQUE : Un volume relativement élevé de 1x PBS est utilisé pour éviter la formation d'agrégats. Pour cette raison, il est nécessaire de laisser sécher les glissières avant la fixation pour s'assurer que les micronavires sont détenus par le revêtement poly-D-lysine.
  5. Enlever les résidus de 1x PBS en pipeting à l'extérieur avec une pipette de transfert, ajouter 200 'L de paraformaldehyde (PFA) et incuber pendant 30 min à RT.
  6. Pipette sur la solution fixative et laver 3x avec 200 L de 1x PBS pendant 5 min à RT.
    REMARQUE : Des taches de H et E sur des micronavires de poissons, d'amphibiens et de reptiles du SNC ont été réalisées à ce stade.
  7. Ajouter 200 l de tampon de blocage à la glissière du puits et incuber pendant 60 min à 37 oC.
  8. Retirez le tampon de blocage à l'arme de transfert et ajoutez 200 l du cocktail d'anticorps primaire dans le diluant d'anticorps(Tableau des matériaux). Incuber à 4 oC pendant la nuit.
  9. Pipette sur le cocktail d'anticorps primaire et laver 3x avec 200 L de 1x PBS pendant 5 min à RT.
  10. Chargez le cocktail d'anticorps secondaire (Table of Materials) dilué en 1x PBS et incuber pendant 2 h à RT, à l'abri de la lumière.
  11. Pipette sur le cocktail d'anticorps secondaire et laver 3x avec 200 L de 1x PBS pendant 5 min à RT, protégé de la lumière. Après le dernier lavage détacher le cadre du puits et sécher à l'air libre tout excès de 1x PBS avec une lingette en papier à faible charpente.
  12. Ajoutez un couvercle, un milieu de moninature antifade liquide et un support antifade liquide et un support antifade liquide de 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) pour la coloration nucléaire. Laisser sécher toute la nuit à RT protégé de la lumière.
  13. Une fois au sec, restez à l'abri de la lumière sur une boîte à glissière à 4 oC jusqu'à ce qu'il soit prêt pour la microscopie confocale et l'acquisition de données.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les microvessels isolés du SNC murine ont montré tous les composants cellulaires intrinsèques de l'unité neurovasculaire2,3. Utilisation de la molécule d'adhérence des cellules endothéliales plaquettaires-1 (PECAM, également connue sous le nom de CD31) ou de l'isolectin IB4 (une glycoprotéine qui lie la cellule endothéliale glycocalyx) pour les cellules endothéliales, Le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFTRD) ou ant...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le BBB comprend les propriétés uniques des cellules endothéliales microvasculature du cerveau couplées par une architecture sophistiquée de serré, adherens-, "peg-socket"- jonctions, et plaques d'adhérence critique pour l'homéostasie du SNC2,3,19. Les propriétés des cellules endothéliales sont induites et maintenues par les péritéytes et les processus d'astroglia environnants2,

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le Dr Cruz-Orengo a reçu le soutien de l'Université de Californie, Davis, School of Veterinary Medicine Start Up Funds.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
10X PBSThermoFisherBP39920Utilisé pour le blocage et le diluant d’anticorps.
20 % PFAMicroscopie électronique Sciences15713-SUtilisé comme fixateur (4 % PFA)
70 000 MW DextranMillipore Sigma9004-54-0Utilisé pour la solution MV-2
Adson ForcepsFine Science Tools (FST)11006-12Utilisé pour l’ablation des muscles et de la peau
Adson Forceps, qualité étudianteFST91106-12Identique que ci-dessus mais moins cher
Sérum bovin albumine (BSA)Millipore SigmaA7906-100GUtilisé pour la solution MV-3, le blocage et le diluant d’anticorps
Corning 100 &mu ; m Crépine à cellulesMillipore SigmaCLS431752-50EA
Corning 70 &mu ; m Filtre à cellulesMillipore SigmaCLS431751-50EA
Corning Deskwork pointes à faible liaisonMillipore SigmaCLS4151Identique que ci-dessous mais moins cher.
Cultrex Poly-D-LysineR& D3439-100-01Utilisé pour le revêtement en glissement
Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555ThermoA21432Utilisé comme anticorps secondaire. Dilution recommandée de 1:200.
Âne anti-souris IgG-ALEXA 488ThermoA21202Utilisé comme anticorps secondaire. Dilution recommandée de 1:200.
Âne anti-Lapin IgG-ALEXA 488ThermoA21206Utilisé comme anticorps secondaire. Dilution recommandée de 1:200.
Âne anti-Lapin IgG-ALEXA 647ThermoA31573Utilisé comme anticorps secondaire. Dilution recommandée de 1:200.
Âne anti-Rat IgG-DyLight 650ThermoSA5-10029Utilisé comme anticorps secondaire. Dilution recommandée de 1:200.
Pic à tissu à double brocheFST18067-11Utilisé pour l’ablation des méninges et du plexus choroïde
Dumont #3c ForcepsFST11231-20Utilisé pour la manipulation de tissus du SNC plus délicates et/ou plus petites (comme l’hypophyse)
Dumont #7 ForcepsFST11274-20Utilisé pour la dissection et la manipulation du syndrome du SNC
Dumont #7 Forceps, étudiantFST91197-00Identique à ci-dessus mais
moins cher ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention TipsEppendorf22493008de meilleure qualité que les tips ci-dessus (plus cher).
Pince Graefe extra fine, denteléeFST11151-10Utilisée pour l’ablation des os
Ciseaux fins, tranchantsFST14060-09Utilisée pour l’ablation du sac dural du porc et du macaque
Pilon en verre 1,5 mL Microcentrifuge Tube Broyeur de tissus Homogénéisateur, paquet de 10Chang Bioscience Inc. (eBay)GP1.5_10Utilisé pour l’hypothale et l’hypophyse des petits vétébrés.
Anti-CXCL12 de chèvre,PeproTech500-P87BGBTUtilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC à partir de tous les échantillons. Dilution recommandée : 1:20.
Chèvre anti-JAM-BR& DAF1074Utilisé comme anticorps primaire pour évaluer la neuroinflammation. Concentration recommandée : 5 &mu ; g/mL.
Chèvre anti-souris IgG-ALEXA 488ThermoA11001Utilisé comme anticorps secondaire. Dilution recommandée de 1:200.
Anti-souris chèvre IgG-ALEXA 555ThermoA21424Utilisé comme anticorps secondaire. Dilution recommandée de 1:200.
Chèvre anti-PDGFR&beta ;R& DAF1042Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC à partir de tous les échantillons. Concentration recommandée : 5 &mu ; g/mL.
Chèvre anti-Lapin IgG-ALEXA 555ThermoA21249Utilisé comme anticorps secondaire. Dilution recommandée de 1:200.
Chèvre anti-Lapin IgG-DyLight 488Thermo35552Utilisé comme anticorps secondaire. Dilution recommandée de 1:200.
Anti-Rat de chèvre IgG-DyLight 650ThermoSA5-10021Utilisé comme anticorps secondaire. Dilution recommandée de 1:200.
Pince Graefe, pointe incurvée, 1X2 dentsFST11054-10Utilisation pour le maintien et l’agitation des filets filtrants en nylon
HBSS, 1X tampon avec calcium et magnésiumCorning21-022-CMUtilisé pour la solution MV-1
HEPES, tampon liquide 1MCorning25-060-CIUtilisé pour la solution MV-1
Isolectine GS-IB4-Biotin-XXThermoFisher Scientific (Thermo)I21414Glycoprotéine isolée de la légumineuse Griffonia simplicifolia qui se lie aux résidus D-galactosyle de la cellule endothéliale glycocalysx. Utilisé pour les microvaisseaux du SNC aviaire et porcin. Concentration recommandée : 5 &mu ; g/mL.
Ciseaux LaGrange, dentelésFST14173-12Utilisé pour la dissection du crâne et la laminectomie (sauf porc et macaque)
Lame Millicell EZ unité 8 puits MilliporeSigmaPEZGS0816
Souris anti-CLDN5Thermo35-2500Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC de tous les échantillons. Concentration recommandée : 5 &mu ; g/mL.
Souris anti-GGT1Abcamab55138Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC à partir de tous les échantillons. Concentration recommandée : 5 &mu ; g/mL.
Souris anti-humaine CD31R& DBBA7Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC des primates. Concentration recommandée : 16,5 &mu ; g/mL.
ThermoRMO-270Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC à partir de tous les échantillons. Concentration recommandée : 5 &mu ; g/mL.
Souris anti-&alpha ;SMAThermoMA5-11547Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC à partir de tous les échantillons. Dilution recommandée de 1:200.
Filet filtrant en nylon, rouleauMillipore SigmaNY6000010Disques de filet filtrant découpés au laser à 13 mm de diamètre. Utilisé pour les petits hypothales et hypophysaires vétérés.
Filets filtrants en nylon, 25 mmMillipore SigmaNY2002500Utilisé sur la plupart des tissus du SNC des petits vertébrés, à l’exception de l’hypothalamus et de l’hypophyse. Utilisé pour l’hypothalamus et l’hypophyse du macaque et du porc.
Filets filtrants en nylon, 47 mmMillipore SigmaNY2004700Utilisé pour les tissus du SNC des macaques et des porcs, à l’exception de l’hypothalamus et de l’hypophyse.
Réactif anti-décoloration ProLong Gold avec DAPIThermoFisherP36935Utilisé pour les lames de lamelles.
Lapin anti-AQP4Millipore SigmaA5971Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC à partir de tous les échantillons. Dilution recommandée de 1:200.
Lapin anti-LSRMillipore SigmaSAB2107967Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC à partir de tous les échantillons. Concentration recommandée : 5 &mu ; g/mL.
Lapin anti-NG2Millipore SigmaAB5320Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC à partir de tous les échantillons. Dilution recommandée de 1:200.
Lapin anti-OSPAbcamab53041Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC à partir de tous les échantillons. Concentration recommandée : 1 &mu ; g/mL.
Lapin anti-VE-CadhérineAbcamab33168Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC à partir de tous les échantillons. Concentration recommandée : 5 &mu ; g/mL.
Lapin anti-ZO-1Thermo61-7300Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC à partir de tous les échantillons. Concentration recommandée : 5 &mu ; g/mL.
Rat anti-CD31Becton DickinsonBD 550274Utilisé comme anticorps primaire pour les microvaisseaux murins du SNC. Concentration recommandée : 5 &mu ; g/mL.
Anti-GFAP pour ratThermo13-0300Utilisé comme anticorps primaire sur les microvaisseaux du SNC à partir de tous les échantillons. Dilution recommandée de 1:200.
Rat anti-VCAM-1Becton DickinsonBD 553329Utilisé comme anticorps primaire pour évaluer la neuroinflammation. Concentration recommandée : 5 &mu ; g/mL.
Solution de Ringer stérile, FrogAldon CorporationIS5066Utilisé pour l’anesthésie amfibienne
Streptavidin-ALEXA 555ThermoS32355Utilisé comme anticorps secondaire pour marquer les anticorps primaires biotinylés. Dilution recommandée de 1:500.
Streptavidin-ALEXA 647ThermoS32357Utilisé comme anticorps secondaire pour marquer les anticorps primaires biotinylés. Dilution recommandée de 1:500.
Ciseaux chirurgicaux, tranchantsFST14002-12Utilisés pour l’ablation des muscles et de la peau
Ciseaux chirurgicaux, tranchants-émoussésFST14001-16Utilisés pour la décapitation (sauf porc et macaque)
Porte-filtre Swinnex, 13 mmMillipore SigmaSX0001300Modifié par découpe laser. Utilisé pour les petits hypothales et hypophysaires vétérés.
Porte-filtre Swinnex, 25 mmMillipore SigmaSX0002500Modifié par découpe laser. Utilisé sur la plupart des tissus du SNC des petits vertébrés, à l’exception de l’hypothalamus et de l’hypophyse. Utilisé pour l’hypothalamus et l’hypophyse du macaque et du porc.
Porte-filtre Swinnex, 47 mmMillipore SigmaSX0004700Modifié par découpe laser. Utilisé pour les tissus du SNC du macaque et du porc, à l’exception de l’hypothalamus et de l’hypophyse.
Triton X-100ThermoFisher50-165-7277Utilisé pour le blocage et le diluant d’anticorps.
Wheaton 120 Vac Overhead SutterrerVWR (Fournisseur DWK Life Sciences)62400-904 (DWK #903475)Utilisé pour les tissus du SNC du macaque et du porc avec un broyeur de tissus de 55 ml, à l’exception de l’hypothalamus et de l’hypophyse.
Broyeur de tissus Wheaton Potter-Elvehjem avec pilon en PTFE, 10 mLVWR (Fournisseur DWK Life Sciences)14231-384 (DWK #357979)Utilisé sur la plupart des tissus du SNC des petits vertébrés, à l’exception de l’hypothalamus et de l’hypophyse. Utilisé pour l’hypothalamus et l’hypophyse du macaque et du porc.
Broyeur de tissus Wheaton Potter-Elvehjem avec pilon en PTFE, 55 mLVWR (Fournisseur DWK Life Sciences)14231-372 (DWK #357994)Utilisé pour les tissus du SNC du macaque et du porc, à l’exception de l’hypothalamus et de l’hypophyse.
biotinylé

Références

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