Imagerie de la synapse immunologique humaine

Summary

Ce protocole image à la fois la formation de synapse immunologique et le trafic sécréteur polarisé suivant vers la synapse immunologique. Des conjugués cellulaires ont été formés entre une cellule Raji à impulsion de superantigène (agissant comme cellule de présentation d'antigène) et un clone de Jurkat (agissant comme lymphocyte T d'aide d'effecteur).

Abstract

Le but de la méthode est de générer une synapse immunologique (IS), un exemple de conjugaison cellule-cellule formée par une cellule présentant un antigène (APC) et une cellule de lymphocyte T (Th) d'aide effectrice, et d'enregistrer les images correspondant aux premières étapes de la formation de l'EI et les événements de trafic subséquents (qui se produisent à la fois dans l'APC et dans la cellule Th). Ces événements finiront par conduire à une sécrétion polarisée à l'EI. Dans ce protocole, les cellules de Jurkat ont défié avec staphylococcus entérotoxine E (SEE)-pulsé raji cellules comme modèle de synapse de cellules a été employé, en raison de la proximité de ce système expérimental à la réalité biologique (Th cellules-APC conjugues synaptiques). L'approche présentée ici implique la conjugaison de cellule à cellule, l'acquisition de time-lapse, la microscopie à fluorescence à champ large (WFFM) suivie du traitement d'image (déconvolution post-acquisition). Cela améliore le rapport signal-bruit (SNR) des images, améliore la résolution temporelle, permet l'acquisition synchronisée de plusieurs fluorochromes dans les conjugués synaptiques émergents et diminue le blanchiment de fluorescence. En outre, le protocole est bien assorti avec les protocoles de fixation cellulaire de point final (paraformaldehyde, acétone ou méthanol), qui permettraient davantage de coloration et d'analyses d'immunofluorescence. Ce protocole est également compatible avec la microscopie confocale de balayage laser (LSCM) et d'autres techniques de microscopie de pointe. Comme mise en garde principale, seules les limites de la cellule T-APC (appelées interfaces IS) qui étaient à l'angle droit de 90 degrés par rapport au plan de mise au point le long de l'axe Z pouvaient être correctement imageet analysée. D'autres modèles expérimentaux existent qui simplifient l'imagerie dans la dimension Z et les analyses d'images suivantes, mais ces approches n'émulent pas la surface complexe et irrégulière d'un APC, et peuvent favoriser des interactions non physiologiques dans l'IS. Ainsi, l'approche expérimentale utilisée ici est appropriée pour se reproduire et pour faire face à certaines complexités biologiques se produisant à l'IS.

Introduction

L'objectif principal de la méthode est de générer des conjuguations immunologiques de synapse (IS) de cellule à cellule formées par une cellule de présentation d'antigènes (APC) pulsée avec des superantigènes SEE et une cellule Effector Th, et d'enregistrer les images correspondant aux premières étapes de la formation de synapse immunologique et des événements de trafic subséquents (se produisant à la fois dans l'APC et la cellule Th), qui finiront par conduire à la sécrétion polarisée à l'IS. La mise en place de l'IS par lymphocytes T sur la liaison de leur récepteur cellulaire (TCR) aux antigènes liés à MHC-II sur l'APC organise un cas extrêmement dynamique, malléable et critique impliqué dans les réponses immunitaires antigènes spécifiques, humoristiques et cellulaires^1,2. L'IS est défini par la formation d'un modèle spécial de complexe d'activation supramoléculaire (SMAC) caractérisé par un processus de réorganisation de l'actine³. Lors de la construction par les lymphocytes T avec un APC, la polarisation des vésicules sécrétrices vers l'EI semble être impliquée dans la sécrétion polarisée à l'écart synaptique. Cette machinerie ciblée semble fournir sans ambiguïté le système immunitaire avec un stratagème superbement réglementé pour améliorer l'efficacité des rôles critiques effecteur sécréteur de sécrétrices des lymphocytes T, tout en réduisant non spécifique, cytokine-arbitrated stimulation des cellules de spectateur, la mise à mort des cellules cibles non pertinentes et le suicide apoptotique par la mort cellulaire induite par l'activation (AICD)⁴.

La conséquence de l'IS varie en fonction de la nature du lymphocyte T et de l'APC. Le contact synaptique des cellules Th (généralement des cellules CD4) avec l'APC affichant l'antigène associé au MHC-II produit l'activation de la cellule T (sécrétion de cytokine, prolifération, etc.) et, dans certains cas, de l'apoptose via AICD⁴. Pour les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) (principalement les cellules CD8MD) qui interagissent avec l'antigène aPC présentant un antigène associé au MHC-I, le résultat diffère sur la préstimulation ou non des CTL avec de l'antigène. Ainsi, les CTL naïfs identifiant les complexes antigènes-MHC-I sur l'APC sont « préparés » pour détruire les cellules cibles et diviser. Les CTL apprêtés établissent également des synapses avec des cellules cibles (c.-à-d., cellules infectées par des virus ou des cellules tumorales) produisant l'extermination cellulaire antigène-spécifique^5,6.

La sécrétion polarisée des exosomes à la synapse immunologique est un domaine de recherche en développement et stimulant impliqué dans les réponses immunitaires pertinentes⁷. Il a été démontré que les corps multivésiculaires (MVB) porteurs de vésicules intraluminescentes (ILV) subissent un transport polarisé vers l'IS^8,9 ( Vidéo1) sur stimulation TCR avec antigène. La fusion de ces MVB à la membrane synaptique induit leur dégranulation et la libération des ILVs comme exosomes à la fente synaptique^8,10. Ceci se produit dans IS formé par les cellules de Jurkat de th-type qui ont été défiées avec les cellules de Raji superantigènes-enduites de SEE agissant comme APC^11,CD4 TCR-stimulés^- lymphoblastes, et CTLs apprêtés. Ainsi, les synapses fabriquées par les cellules Jurkat constituent un modèle précieux pour étudier le trafic sécréteur polarisé des exosomes. En outre, plusieurs décennies d'enquête ont montré que de nombreuses connaissances fondamentales sur la signalisation TCR provenaient d'études avec des lignées de lymphocytes T transformées, et en effet le plus connu de ces systèmes modèles est la ligne loucopique Jurkat t-cell¹².

La formation d'un IS entièrement développé produit plusieurs résultats biologiques cruciaux, y compris l'activation des cellules Th, l'activation des CTL naïfs ou la mise à mort de cellules cibles par les CTL amorcés, en dehors de l'anergie ou AICD⁵. Par conséquent, il existe deux principaux types de sécrétion est établi par les lymphocytes T qui se traduisent par très diverses, mais tout aussi critique, fonctions de l'effecteur immunitaire^1,6,13. D'une part, l'IS des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) induisé une polarisation rapide (allant de quelques secondes à quelques minutes) de granules lytiques (appelés « lysosomes sécréteurs ») vers l'EI. La dégranulation des granules lytiques induit la perforine de sécrétion et les granzymes à la fente synaptique¹⁴, qui sont des molécules pro-apoptotic. La perforine sécrétée et les granzymes induissaient par la suite à tuer les cellules cibles^15,16. Les CTL développent des synapses temporaires, qui ne durent que quelques minutes, car les cellules cibles sont assassinées^3,17. Cela est probablement dû à la circonstance que la tâche optimale CTL nécessite un contact rapide et temporaire afin de distribuer autant de grèves mortelles que possible à de nombreuses cellules cibles^3,17. En revanche, les lymphocytes Th tels que les cellules Dejurkat génèrent des IS stables et de longue date (de 10 à 30 minutes jusqu'à des heures), car cela semble nécessaire à la fois pour la sécrétion directionnelle et incessante de cytokines stimulantes^3,17. Les cytokines sont également enfermés dans des vésicules sécrétrices et certains d'entre eux (c.-à-d., IL-2, IFN-) expérience de transport polarisé à l'IS¹⁷ et la sécrétion. Une caractéristique essentielle de l'Is est la formation de contacts exploratoires, faibles et transitoires entre la cellule T et l'APC (Vidéo 1) qui peuvent produire une interaction plus forte et l'établissement d'un IS mature, à condition que le TCR identifie les complexes d'antigène-MHC cognate et que des connexions co-stimulantes appropriées soient établies⁵. Le début des premiers contacts et la fondation d'un IS mature et totalement productif sont intrinsèquement stochastiques, rapides et asynchrones processus^5,18. En outre, il y a une fréquence rare dans la création des conjugaisons de cellule à cellule^19,qui peuvent constituer un défi pour les techniques d'imagerie (s'il vous plaît se référer aux résultats et aux sections de discussion).

Un autre défi principal en examinant la polarisation du centre d'organisation de microtubule (MTOC) et des granules de sécrétion dans les lymphocytes T est que le processus entier est rapide (secondes à quelques minutes), particulièrement dans Les CTL. Compte tenu de ces faits, la plupart des premières approches ont fait face à une stratégie de point final dans laquelle les cellules APC/cibles et les lymphocytes T sont mélangés conjointement et convergentparés par centrifugation à basse vitesse, pour favoriser la création conjugale de cellule à cellule, incubée pendant plusieurs minutes, fixe et évaluée par la suite pour le relocalisation du MTOC et/ou des vésicules sécrétrices vers l'IS²⁰. Cette approche a deux limites importantes : aucune donnée de trafic animée n'a été obtenue et des niveaux élevés de polarisation des granules MTOC/sécréteurs ont été obtenus, probablement en raison du caractère stochastique de l'établissement^{IS 18}. En outre, toute corrélation entre les événements de signalisation initiale stimulés par le TCR (c.-à-d. augmentations intracellulaires de calcium, réorganisation de l'actine) et polarisation sécrétrice de vésicule est problématique à étudier. Ainsi, les dispositions impératives pour une imagerie appropriée de l'IS dans les cellules vivantes se combinent pour améliorer la matérialisation conjugalisation cellule-cellule, pour synchroniser la génération de l'IS et, dans la mesure du possible, pour garantir l'établissement de conjugués cellulaires aux champs et aux positions Z du microscope défini. Plusieurs stratégies ont été élaborées afin d'éviter tous ces problèmes. Il n'est pas possible d'expliquer ces méthodes, leurs avantages et leurs faiblesses. S'il vous plaît se référer aux commentaires déjà publiés s'attaquant à ces points importants^1,4,5,21.

Le fait que les is faites par les lymphocytes Th sont de longue durée, et la circonstance que dans th lymphocytes le MTOC, les granules sécréteurs de lymphokine contenant et MVB prendre de plusieurs minutes jusqu'à des heures pour se déplacer et s'amarrer à l'IS²² rend le Th-APC IS un candidat idéal pour l'imagerie en utilisant le protocole décrit ici.

Protocol

1. Préparation de diapositives pour adhérer aux cellules Raji

1. Ajouter 150 l de fibronectin (100 g/mL) par puits à une glissière de chambre de 8 micropuits (glissière de chambre en plastique)) et l'incuber pendant 30 min à 1 h à 37 oC. Ce substrat d'adhérence permettra la liaison des cellules Raji au fond du puits (étape 2), la formation de conjugués vivants avec les cellules Jurkat (étape 4) et la capture de microscopie en accéléré (étape 6), et est également compatible par la suite avec la fixation paraformaldehyde facultative (PFA) (étape 7).
   REMARQUE: Pour la fixation de l'acétone, utilisez des glissières de chambre en verre et de la polylysine (20 g/mL) au lieu de la fibronectine, puisque l'acétone dissout le plastique. La glissière de chambre de 8 micropuits (1 cm² puits, volume maximum de 300 l) ou équivalent est un format flexible et approprié.
2. Aspirez la fibronectine à l'aide d'une pipette automatique de 200 l et lavez chaque puits avec 200 l de PBS pendant 2 min avec des secousses douces. Répétez ce lavage une fois de plus. La glissière de chambre peut être stockée à ce stade avec PBS pendant 1-2 semaines à 4 oC.

2. Adhérence des cellules Raji aux diapositives de chambre et 7-amino-4-chloromethylcoumarin (CMAC) Étiquetage

1. Transférer 10 ml d'un confluent (1-2 x 10⁶ cellules/mL) pré-culture des cellules Raji à un tube de 15 ml, v-bottom. Bien mélanger et utiliser 10 L pour compter les cellules sur la chambre Neubauer ou équivalent.
2. Centrifuger les cellules restantes à 300 x g pendant 5 min à température ambiante. Aspirer et jeter le supernatant.
3. Resuspendre doucement la pastille cellulaire dans un milieu de culture chaud et complet (RPMI 1640 complété de 10 % de FCS, 2 mM de glutamine, 10 mM HEPES, 100 u/mL de pénicilline et 100 x g/mL de streptomycine) à une concentration de 10⁶ cellules/mL. Utilisez l'équation ci-dessous :
   ([ ]_{initial x} V_initial , [ ]_final x V_final), où [ ]_initial représente la concentration_{cellulaire initiale,} V initial - volume initial de la suspension cellulaire, [ ]_{concentration finale} de cellules, V_final - volume final de la suspension cellulaire.
   REMARQUE: Selon la concentration cellulaire de la culture de départ, il est possible de recueillir plus de cellules que nécessaire, mais il est important de maintenir les cellules restantes en culture (37 oC) jusqu'à la fin de l'expérience afin de prévenir les problèmes potentiels (voir l'étape 2.6).
4. Étiquetez les cellules Raji pour permettre leur identification lors de la formation conjuguée synaptique. Dans cette expérience, l'étiquetage 7-amino-4-chloromethylcoumarin (CMAC) est effectué à l'étape 2.4.2.
   1. Transférer le nombre requis de cellules Raji dans le milieu de culture à un tube de 2 ml. Pour la glissière de chambre de 8 micropuits, un total de 1,6 ml de suspension cellulaire est nécessaire (200 l par puits).
   2. Ajoutez le CMAC à une concentration finale de 10 M. Gardez les cellules dans l'obscurité en recouvrant le tube de papier d'aluminium puisque le CMAC est sensible à la lumière. 200 L contenant 2 x 10⁵ cellules Raji sont nécessaires pour un puits de 1 cm^2. Ainsi, si 8 puits doivent être préparés, 1,6 x 10⁶ cellules Raji sont nécessaires.
      REMARQUE: L'étiquetage des cellules Raji avec le bleu de traqueur cellulaire (CMAC, excitation UV et émission bleue) les distingue des cellules de Th quand les conjugués synaptiques sont formés. Ce colorant est compatible avec les fixatifs PFA et acétone et permet d'autres procédures d'immunofluorescence. Essayez d'éviter l'exposition de lumière. L'étiquetage des cellules Raji dans un pool avec CMAC suivi d'une résuspension avant l'adhérence des cellules Raji aux diapositives de chambre enduites de fibronectin assure l'étiquetage homogène des cellules Raji avec CMAC parmi différents puits.
5. Resuspendre les cellules tachées de CMAC et, après l'aspiration du PBS dans la glissière de chambre de l'étape 1.2., transférer 200 l de la suspension cellulaire à chaque puits des glissières de chambre enduites de fibronectines préparées à l'étape 1.1-1.2. Incuber la glissière de chambre à 37 oC, 5 % de CO₂ pendant 30 min-1 h.
   REMARQUE: L'adhérence et l'étiquetage CMAC se produiront simultanément à cette étape, ce qui permet de gagner du temps. S'il vous plaît être conscient que les cellules Raji sédiments rapidement et la prudence doit être prise pour maintenir une concentration homogène dans la suspension cellulaire avant l'ensemencement. Il n'est pas nécessaire de laver le CMAC à ce stade par centrifugation, puisque le lavage du CMAC sera plus facile à l'étape 2.7 (lorsque les cellules Raji étiquetées sont déjà respectées aux glissières de chambre). Puisque le CMAC est présent dans la suspension cellulaire en grand excès, le fond de fluorescence bleue est trop élevé pour distinguer les cellules tachées de bleu. Vérifiez la fluorescence de la cellule CMAC à l'étape 2.7 après le lavage du CMAC.
6. Assurez-vous que les cellules Raji sont adhérées au fond des puits par des secousses douces des diapositives de chambre sur le microscope. Assurez-vous que les cellules présentent des lacunes entre elles et ne sont pas confluentes(figure 1, panneau moyen). 50-60% de la confluence cellulaire est appropriée.
   1. Si la plupart des cellules adhèrent efficacement à la glissière de la chambre et qu'aucune lacune cellulaire n'est observée, lavez chaque puits avec un milieu chaud et complet et suspendez le milieu avec une tuyauterie automatique de 200 l pour détacher l'excès cellulaire. Vérifiez la confluence après chaque étape de résuspension.
   2. Si les cellules n'adhèrent pas, répétez à nouveau l'étape d'adhérence et augmentez le temps d'adhérence et/ou le nombre de cellules.
      REMARQUE: Il est possible de s'arrêter ici, d'incuber la glissière de chambre à 37 oC, 5 % de CO₂ pendant la nuit (O/N), et de poursuivre le protocole le lendemain. Veuillez confirmer le lendemain que les cellules Raji restent respectées et étiquetées CMAC en utilisant la microscopie à fluorescence.
7. Lavez-les à nouveau soigneusement avec le RPMI chaud complété pour éliminer l'excès de CMAC et vérifiez l'émission bleue avec le microscope à fluorescence (Figure 1).
   REMARQUE: Pour éviter l'utilisation d'huile d'immersion (collante et visqueuse) et d'objectifs d'huile à ouverture numérique élevée, des objectifs d'extra-longue distance (c.-à-d. 20x ou 40x) peuvent être utilisés pour vérifier rapidement l'étiquetage du CMAC à l'aide du microscope à fluorescence.

3. Pulse of CMAC — Cellules Raji étiquetées avec entérotoxine staphylococcique E

1. Ajouter l'entérotoxine staphylococcique E (VOIR, 1 g/mL) à chaque puits. SEE peut être commodément dilué dans le milieu de culture cellulaire (solution de travail à 100 g/mL) à partir des stocks congelés SEE (1 mg/mL en PBS). Utilisez 2 ll de la solution de travail 100x pour un micropuits de 200 l.
   MISE EN GARDE: Utilisez des gants pour cette étape et jetez la pointe utilisée dans la boîte de biorisque.
2. Incuber la glissière de chambre à 37 oC, 5 % de CO₂ pendant au moins 30 min. L'effet SEE dure au moins 3-4 h.
   REMARQUE: SEE peut être ajouté aux puits à différents moments lorsque cela est nécessaire, si des configurations de time-lapse distinctes sont planifiées (étape 5) et/ou en fonction du point de départ pour les expériences de point final (étape 6).

4. Préparation des cellules Jurkat

1. Utilisez une culture de cellules Jurkat qui s'est déjà croissante (1-2 x 10⁶ cellules/mL) pour cette expérience. Utilisez des cellules d'un flacon de culture standard ou d'une transfection précédente suivant des protocoles d'électroporation standard, comme décrit précédemment²³. La transfection des cellules Jurkat permettra la visualisation par laps de temps du trafic de granules sécréteurs dans les cellules vivantes. Par exemple, lorsque GFP-CD63 (un marqueur de MVB) est exprimé le mouvement des vésicules GFP-CD63-décorées peut être enregistré (Vidéo 1).
2. Observez les cellules sous un microscope de contraste de phase. Si un excès de cellules mortes (-20-30%) sont observés, effectuer la centrifugation gradient de densité Ficoll en utilisant des protocoles standard²⁴, pour éliminer l'excès de cellules mortes (les cellules mortes présentent une densité plus élevée que les cellules vivantes) avant l'utilisation (voir Discussion).
3. Transférer les cellules dans un tube de 15 ml, tube à fond V, et utiliser 10 L pour compter à l'aide de l'hémocytomètre.
4. Centrifuger les cellules restantes telles que décrites à l'étape 2.2. Jeter le supernatant et resuspendre les cellules à la même concentration que les cellules Raji (1 x 10⁶/mL) à l'aide d'un milieu de culture frais et chaud. Suivez les étapes 2.2-2.3.
5. Maintenir les cellules Jurkat en culture (37 oC, 5 % CO₂) en attendant l'étape 4.
   REMARQUE: Dans la deuxième option (transfection), le nombre de cellules vivantes va être beaucoup plus faible que dans la première. Ainsi, envisagez d'utiliser un volume de culture cellulaire de départ plus élevé afin d'avoir suffisamment de cellules pour l'expérience. De 10 x 10⁶ cellules Jurkat par cuvette d'électroporation et transfection, seulement 2-4 x 10⁶ cellules Jurkat survivront après 48 h de transfection et certaines de ces cellules seront perdues pendant l'étape De Ficoll. Ainsi, une cuvette d'électroporation est généralement suffisante pour contester les cellules Raji adhérentes à l'impulsion DE SEE à partir de 8 micro-puits (1,6 x 10⁶ cellules Jurkat transfectées nécessaires).

5. Co-ensemencement des cellules Raji et Jurkat

1. Sortez les diapositives de chambre contenant les cellules Raji étiquetées, pulsées par SEE et adhérées à l'étape 3.2. Il n'est pas nécessaire de laver le CMAC à ce stade puisque cela a déjà été fait à l'étape 2.7.
2. Aspirez soigneusement le milieu de culture de chaque puits, un par un, d'un coin du puits à l'aide d'une pipette automatique de 200 l. Ne laissez pas le milieu dans le puits sécher complètement.
3. Remplacez immédiatement le milieu par 200 l de cellules Jurkat remises en suspension dans le milieu de culture cellulaire (1 x 10⁶/mL) préparée à l'étape 4.5. Si l'imagerie par laps de temps est effectuée, passez à l'étape 6 immédiatement après cette étape, puisque les cellules Jurkat ont tendance à sédimenter et à former des conjugués synaptiques très rapidement. Pour plus de commodité, les micropuits contenant des cellules Raji adhérentes à l'impulsion DE SEE qui ne reçoivent pas d'ensemencement avec des cellules Jurkat à ce stade devraient être maintenus avec le milieu de culture cellulaire jusqu'à ce que le défi ultérieur avec les cellules Dejkat. Cela permettra avec souplesse de contester ultérieurement avec les cellules Jurkat pour un laps de temps supplémentaire ou inverser les approches incinétiques, point final expérimental.
4. Si un laps de temps doit être effectué, passez rapidement à l'étape 6. Il s'agit de la co-culture pour 1-2 h sur l'incubateur de stade de microscope ou équivalent à 37 oC, 5% CO₂ pour permettre la formation conjugale synaptique et l'acquisition simultanée d'images. Si l'analyse des points finaux, mais pas de laps de temps, est prévue vérifier la formation conjuguée après la période de co-culture à l'aide du microscope (comme dans la figure 1) avant de fixer les cellules (étape 7).

6. Time Lapse Imaging of Emerging Synaptic Conjugates

1. Préparer le microscope et la chambre d'incubation avant l'imagerie. Pour l'exemple montré dans la vidéo 1, les paramètres détaillés de microscopie sont affichés dans la figure 2.
   REMARQUE: Si une expérience de laps de temps est prévue, tous les réglages et les compléments de microscope (chambre de culture cellulaire ambiante, etc.) doivent être préparés avant d'ajouter la suspension Jurkat à la glissière de chambre avec les cellules Raji adhérentes. Les étapes suivantes sont décrites pour un microscope commercial (Tableau des matériaux). Cependant, n'importe quel microscope à fluorescence inversée équipé d'un incubateur de culture cellulaire peut être utilisé.
   1. Utilisez un microscope avec une immersion d'huile 60x, ouverture numérique élevée lors de l'imagerie du trafic polarisé.
   2. Assurez-vous que le système de mise au point automatique est allumé et ajustez le décalage pour concentrer les cellules Raji liées à la surface inférieure. S'il vous plaît se référer à la figure 1, Vidéo 1 et Vidéo 2.
2. Après l'ajout de Jurkat à chaque puits contenant les cellules Raji adhérentes à l'étape 5.3, localisez rapidement la glissière de chambre de micropuits sur l'incubateur d'étape de microscope préchauffé (1-2 h) (c.-à-d., OKOlab) et sélectionnez quelques positions de XY avec le microscope, champs dans lesquels il est susceptibles d'enregistrer une formation émergente d'IS faite par, par exemple, une cellule Jurkat-transfected tombant dans la mise au point de microscope.
3. Utilisez un incubateur de stade de microscope préchauffé puisqu'il a été observé qu'un stade stabilisé par la température maintient des positions stables de X,Y,Z. Les critères pour un champ XY pratique sont les suivants : cellules Raji bien ciblées et non-confluentes (c.-à-d., affichant des lacunes entre les cellules) et la présence de cellules Jurkat transfectées (cela peut être vérifié en combinant la transmission et les canaux UV ou GFP). Les cellules Jurkat se sédimenteront très rapidement (quelques minutes) sur la glissière de la chambre, et les chances d'imager les synapses émergentes diminueront avec le temps (figure 1). Il est possible soit de terminer l'expérience après le laps de temps défini ou de passer à l'étape 7 et de fixer les conjugués pour l'immunofluorescence et les analyses ultérieures.
   REMARQUE: Il est possible de sélectionner jusqu'à 16 champs de microscope différents de jusqu'à 4 micropuits différents pour l'acquisition simultanée, multi-bien time-lapse avec la résolution temporelle appropriée (1-2 min par cadre). La limitation repose à la fois sur le nombre et l'intensité (affectant l'exposition de la caméra) des divers fluorochromes à imager (en fonction du nombre de protéines fluorescentes exprimées, à l'exception du CMAC). Une façon d'augmenter le taux d'images est l'enregistrement pour le canal CMAC dans un seul de chaque "n" délais pour GFP (c.-à-d., n ' 8, comme indiqué dans la figure 2), puisque les cellules Raji sont adhérées au fond du puits et ne se déplacent pas facilement comme cellules Jurkat. En outre, cela profite à la viabilité des cellules, puisque l'exposition fréquente à la lumière UV peut endommager les cellules. Essayez d'ajuster le délai à 1 image toutes les 1 minute ou moins (c.-à-d., 20 s par image dans la vidéo 1, Figure 2) puisque la polarisation de MVB prend quelques minutes à heures. Un microscope équipé d'une tourelle à épifluorescence motorisée et de filtres ou équivalents de fluorescence de passage de bande appropriés sont nécessaires pour effectuer cette capture multicanal.

7. Formation de point d'extrémité des conjugates et de fixation synaptiques

1. Si seulement une expérience de point de terminaison est planifiée (1-2 heures d'incubation pour permettre la formation conjugale synaptique est appropriée), incuber la glissière de chambre à 37 oC, 5 % de CO₂ pour 1-2 h. Vérifier la formation conjuguée après la période de culture (comme à la figure 1) et, par la suite, fixer les conjuguures avec de l'acétone ou de la PFA (la fixation dépendra des antigènes et des anticorps à utiliser dans l'immunodétermination ultérieure). Dans ce cas, l'incubation ne nécessite pas d'incubateur de stade de microscope. Veuillez consulter la vidéo 3 pour un exemple.
2. Pour fixer les cellules, lavez le puits en secouant doucement avec le milieu chaud de RPMI (37 oC) sans FCS (l'albumine du sérum peut précipiter avec la fixation d'acétone). Aspirez et ajoutez 200 L de PFA ou d'acétone préréfrigéré à chaque puits. Incuber la glissière de chambre à température ambiante (RT) ou sur la glace, respectivement, pendant 20 min.
   REMARQUE: Pour la fixation de l'acétone, pré-réfrigérer l'acétone à -20 oC et pré-réfrigérer la glissière de chambre à 4 oC. Retirez les couvercles en plastique lorsque l'acétone est utilisée pour fixer les cellules cultivées dans les 8 diapositives de chambre en verre de puits.
3. Lavez-vous deux fois avec du PBS et ajoutez 200 l de solution d'étanchéité (PBS, 50 mM NH₄Cl). Incuber la glissière de chambre à 4 oC.
   REMARQUE: À ce stade, la glissière de chambre peut rester pendant au moins un mois à 4 oC avant d'exécuter le protocole d'immunofluorescence, tel que décrit⁸. Le couvercle empêche l'évaporation.

8. Traitement d'image

1. Effectuer la déconvolution d'image post-acquisition (c.-à-d. Huygens deconvolution ou équivalent, Table of Materials) de la série time-lapse et/ou des photos fixes de cellules fixes. Décongestionnce en utilisant un logiciel approprié (c.-à-d., en utilisant l'option optique « champ large » à Huygens) et les paramètres optiques corrects. Deconvolution nécessite pour le traitement de l'image de la fonction de propagation de point mesurée (PSF) du microscope⁴.
2. Alternativement, utilisez le logiciel pour calculer le PSF idéalisé par le chargement automatique des paramètres optiques inclus parmi les métadonnées des fichiers microscope. Ces paramètres optiques comprennent la longueur d'onde fluorochrome, l'indice de réfraction, l'ouverture numérique de l'objectif et la technique d'imagerie (confocale, champ large, etc.) ⁴.
3. Par la suite, le logiciel d'imagerie utilise le PSF et divers algorithmes de déconvolution (c.-à-d. QMLE et CMLE dans le logiciel Huygens) dans un processus de calcul cumulatif étape par étape, dont les résultats peuvent être continuellement visualisés et arrêtés (ou repris) lorsque l'utilisateur l'exige. À ce stade, l'utilisateur peut modifier le nombre de convolutions et/ou le rapport signal/bruit et reprendre la déconvolution. Le logiciel de convolution fonctionne bien avec la série time lapse (X,Y,T) (Vidéo 2) et Z-stacks (X,Y,Z) (Vidéo 3). Les canaux décongestionnés ont ensuite été fusionnés au CMAC, canal brut, puisque les fluorochromes cytosoliques et diffus ne s'améliorent pas par la déconvolution^4,9.

Results

Nous avons suivi le protocole décrit afin de générer des conjugués jurkat-Raji synapse immunitaire et d'imager correctement les premiers stades de la formation IS. Notre objectif était d'améliorer les premières approches^{suivies 20} pour étudier la polarisation du MTOC et de la machinerie sécrétrice vers l'EI. Ces approches étaient basées sur une stratégie de point final qui ne permettait pas l'imagerie de la formation d'IS ou des événements synaptiques précoces, puisque dans ces stratégies la formation d'IS obligatoire s'est produite dans le granule des cellules mélangées et centrifugées, mais pas sur un microscope. Notre protocole a été conçu pour éviter cette mise en garde principale, puisque l'approche était basée sur l'utilisation d'une concentration cellulaire appropriée (étapes 2 et 3), pour favoriser la formation des conjugués IS de cellule à cellule sur les diapositives de chambre de microscope propres (8 micro glissière de chambre de puits), montés sur l'incubateur de microscope pré-chauffé (à l'étape 4). Cette stratégie induit la formation IS, simultanément à la capture d'imagerie time-lapse (Vidéo 1).

La figure 1 représente les conjuguations jurkat-Raji synaptiques obtenues selon le protocole (étape 5.2). L'image représente la première image d'une expérience représentative en time-lapse. 2 x 10⁵ cellules Raji et 2 x 10⁵ cellules Jurkat ont été ajoutées à un puits de 1 cm^2. Le panneau supérieur montre le canal de transmission, le panneau moyen se compose du canal CMAC (bleu) (cellules Raji), et le panneau inférieur montre à la fois la transmission plus les canaux fusionnés CMAC. Les flèches jaunes étiquettent quelques conjugués synaptiques, comme référence, tandis que les flèches vertes indiquent des conjugates synaptiques faites par une cellule de Jurkat et plusieurs cellules de Raji (conjugués complexes). La diminution des concentrations cellulaires (10 cellules de⁵ ou moins dans le puits de 1 cm²⁾ contournera la formation de conjugués cellulaires complexes, mais il se peut qu'il n'y ait pas assez de conjugués cellulaires pour l'analyse ultérieure du trafic polarisé (voir ci-dessous), ce qui diminuera également les chances de trouver et d'imager les conjugues synaptiques émergentes.

La figure 2 représente des captures d'écran correspondant aux paramètres d'imagerie utilisés pour la capture simultanée des deux fluorochromes différents (CMAC et GFP-CD63) en utilisant un logiciel approprié (c.-à-d. NIKON NIS_AR) dans une expérience de laps de temps représentative correspondant à la vidéo 1.

La vidéo 1 (synapses immunologiques, brutes) représente un lymphocyte Jurkat T exprimant GFP-CD63 (un marqueur de corps multivésiculaires-MVB, vésicules vertes) et la formation d'une double synapse entre 1 cellule Jurkat et 2 cellules Raji étiquetées avec CMAC, en bleu (l'une d'entre elles subit un engloutissement). Le mouvement simultané du MVB à l'intérieur de la cellule de Jurkat vers les zones de synapse a été enregistré (taux d'images de capture 1 cadre toutes les 20 secondes pour GFP-CD63; vitesse de reproduction vidéo à 2 images par s). Les conjugués synaptiques ont été obtenus et photographiés suivant le protocole décrit ci-dessus (étape 6.2), qui a permis l'imagerie des synapses émergentes (Vidéo 1). La capture simultanée des canaux de fluorescence GFP-CD63 et CMAC a été effectuée à l'aide d'un logiciel approprié (c.-à-d. NIS-AR, Table of Materials). La vidéo représente les données brutes d'une expérience représentative en time-lapse. Le système de mise au point automatique a été défini avec un décalage approprié en ce qui concerne les cellules Raji liés au fond de verre, pour assurer une orientation stable le long de l'expérience.

La vidéo 2 (synapses immunologiques, après déconvolution) correspond à la vidéo 1, mais la déconvolution des images du canal de fluorescence GFP-CD63 a été réalisée en utilisant un logiciel de déconvolution approprié (c.-à-d. Huygens), en utilisant l'option optique « champ large » et les paramètres optiques appropriés (étape 8). Ce canal décongestionné a ensuite été fusionné au CMAC, canal brut. L'amélioration du rapport signal-bruit et de la netteté de l'image est évidente. La déconvolution a été effectuée après l'acquisition, comme décrit ci-dessus. Pour plus de détails concernant le logiciel de déconvolution s'il vous plaît se référer à⁴.

La vidéo 3 (synapse immunologique, après fixation et coloration immunofluorescence) représente une pile Z (taille de l'étape Z à 0,8 m, 5 cadres) d'un conjugaison IS fixe après l'étape 6 du protocole (fixation de l'acétone). Après fixation, l'immunofluorescence a été exécutée suivant les protocoles standard²⁵ en utilisant Phalloidin pour visualiser le F-actin (vert), anti-CD63 pour visualiser MVB (magenta), anti-tubulin pour visualiser MTOC (rouge). Le CMAC (bleu) étiquette la cellule Raji. Par la suite, le conjugaison a été photographié par épifluorescence et plusieurs canaux décongestionné en utilisant l'option optique « champ large » et les paramètres optiques appropriés (étape 7). Les canaux décongestionnés ont par la suite été fusionnés au CMAC, canal brut, comme indiqué dans les différents panneaux (CMAC plus Transmittance-TRANS, CMAC plus Phallodin, CMAC plus anti-CMac63 et CMAC plus anti-tubulin, respectivement). La flèche blanche étiquette la synapse, tandis que la flèche verte étiquette le MVB et la flèche jaune étiquette le MTOC. La quantification détaillée de la polarisation MVB et MTOC a été expliquée ailleurs²⁵.

L'approche présentée ici implique la formation de conjugués de cellule à cellule et, simultanément, l'acquisition en time-lapse par microscopie à fluorescence à large champ (FMFM) suivie du traitement de l'image (déconvolution post-acquisition). Cette tactique a amélioré le rapport signal-bruit (SNR) des images, amélioré leur résolution temporelle, et a permis l'acquisition synchronisée de plusieurs fluorochromes dans les conjuguations synaptiques émergentes⁴. En outre, le protocole est bien assorti avec les méthodes ultérieures de fixation des cellules point final (paraformaldéhyde, acétone ou méthanol), ce qui permettrait d'autres taches d'immunofluorescence et d'analyses²⁵ (Vidéo 3). Ce protocole est également compatible avec la microscopie confocale de balayage laser et d'autres techniques de microscopie de pointe.

Figure 1 : Champ de microscopie double représentatif des conjugués synaptiques. L'image représente la première image d'une expérience représentative en time-lapse suivant le protocole. Le panneau supérieur montre le canal de transmission, le canal CMAC du panneau moyen (cellules Raji) et le panneau inférieur les deux canaux fusionnés. Les flèches jaunes étiquettent quelques conjugates synaptiques, comme référence. Les flèches vertes indiquent des conjugués synaptiques complexes (c.-à-d. une cellule Jurkat établissant des synapses avec plus d'une cellule Raji). Capturé avec un objectif 40x EWD (0.6 NA). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Réglages du microscope laps de temps. L'image correspond à plusieurs captures d'écran correspondant aux paramètres d'imagerie utilisés pour la capture simultanée des deux fluorochromes différents (CMAC et GFP-CD63) à l'aide d'un logiciel approprié (c.-à-d. NIKON NIS_AR) dans une expérience de laps de temps représentative correspondant à la vidéo 1. Chaque image pour le canal GFP-CD63 a été capturée tous les 20 s. Un seul cadre pour un canal UV sur huit images pour le canal GFP a été capturé afin de maintenir la viabilité cellulaire tout au long de l'expérience. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Vidéo 1 : Synapses immunologiques faites par une cellule Jurkat exprimant GFP-CD63, données brutes. Les cellules Raji B étiquetées avec le bleu de traqueur de cellules (CMAC, bleu) ont été pulsées avec LE pendant 30 min et des synapses avec des cellules de Jurkat exprimant GFP-CD63⁸ ont été formées. Des time-lapses correspondant aux canaux GFP-CD63 et CMAC ont été capturés (20 s par image; vitesse de reproduction vidéo à 2 images par s) et un exemple représentatif est montré. Capturé avec un objectif 60x PLAN APO (1.4 NA). S'il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo (Cliquez à droite pour télécharger).

Vidéo 2 : Synapses immunologiques faites par une cellule Dejurkat exprimant GFP-CD63, après la déconvolution. Idem que la vidéo 1, mais les images ont été décongestionnelles à l'aide d'un logiciel de déconvolution. L'amélioration du rapport signal-bruit et l'amélioration de la netteté, en raison de l'élimination de la fluorescence hors foyer de contaminants, sont évidentes. S'il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo (Cliquez à droite pour télécharger).

Vidéo 3 : Synapse immunologique fixe et immunostained. L'image montre un conjugaison synaptique fixe représentatif après l'étape 7 du protocole et l'immunofluorescence suivante. CMAC (bleu) étiquette les cellules raji, la transmission (TRANS) pour montrer les conjugués synaptiques (flèche blanche), Phalloidin étiquettes F-actin (vert), anti-CD63 étiquettes MVB (magenta, flèche verte) et anti-tubulin étiquettes MTOC (rouge, flèche jaune), respectivement. Ces canaux ont été imagepar épifluorescence, décongestionné et fusionné comme indiqué. La vidéo comprend une pile Z (taille de l'étape z de 0,8 m, 5 images). La flèche blanche étiquette la zone de contact synaptique, tandis que la flèche verte étiquette le MVB et la flèche jaune étiquette le MTOC. S'il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo (Cliquez à droite pour télécharger).

Discussion

Une limitation de ce protocole est que toutes les synapses ne seront pas idéalement orientées perpendiculairement à l'axe optique. En utilisant cette technique, il n'existe aucun moyen de prédire et/ou d'influencer l'orientation idéale pour l'imagerie par synapse immunitaire. Pour résoudre ce problème, nous excluons des analyses ultérieures toutes les synapses capturées au hasard qui ne répondent finalement pas aux critères idéaux. Ces synapses, opportunement, ne sont pas très fréquentes. Cependant, il est possible de contourner cette limitation en utilisant plusieurs approches expérimentales⁴.

La libération polarisée de CD63 (dégranulation) peut être quantifiée par d'autres techniques complémentaires telles que la coloration de surface cellulaire de CD63 (relocalisation de CD63 à la surface de cellules) dans les cellules vivantes (non fixes et non perméabilisées), après l'étape 6, et la fixation et la fixation et la fixation de lavage et de lavage suivantes, comme indiqué précédemment^8. En outre, la libération de CD63 sur les exosomes^8,9 et la quantification exosome par des analyses de suivi des nanoparticules^9,25 peuvent être effectuées. Ces approches sont certainement compatibles avec notre protocole, à condition que la fixation soit effectuée après l'immunofluorescence de surface cellulaire des cellules vivantes.

Nous avons trouvé le nombre idéal de cellules (pour un puits de 1 cm² dans la glissière de chambre de 8 puits) est de 4 x 10⁵ cellules (2 x 10⁵ cellules Raji et 2 x 10⁵ cellules Jurkat) car elles adhèrent efficacement au fond du puits. L'efficacité de liaison au plastique (à l'aide de fibronectin), ou le fond de verre (utilisant la poly-L-lysine) microslides n'est généralement pas un problème. Le nombre plus élevé de cellules peut ne pas produire de lacunes entre les cellules adhérentes et, par la suite, les conjugates synaptiques complexes (figure 1); les deux situations ne sont pas souhaitables lorsque les conjuguations unicellulaires doivent être représentées dans, par exemple, des expériences de polarisation des granules MTOC ou sécrétrices. Un nombre plus faible de cellules peut diminuer les chances de trouver des conjugués, en particulier lorsque les cellules Jurkat transfectées sont mises au défi avec APC pour générer des synapses. Veuillez noter qu'un incubateur de stade stabilisé par la température en place sur le stade du microscope X/Y avant le début du protocole (c.-à-d. 1-2 h à l'avance pour stabiliser la configuration de stade/microscope) maintient les paramètres stables de X,Y,Z, ce qui est crucial pour une imagerie appropriée. Le système de mise au point automatique finira par compenser les petites variations Z.

Lorsque certaines techniques de transduction génique telles que l'électroporation sont utilisées pour exprimer des protéines chimériques fluorescentes (c.-à-d. GFP-CD63) dans les clones de Jurkat (Vidéo 1), une fraction considérable des cellules peuvent mourir après l'électroporation. Cela peut être un problème puisque bien que les cellules mortes ne forment pas de synapses, quand elles sont en excès sur les cellules vivantes et transfectées, elles peuvent interférer avec la formation de conjugués faits par les cellules vivantes de Th. Nous avons constaté que l'élimination soigneuse des cellules mortes des cultures transfectées en utilisant un milieu de gradient de densité suivant des protocoles standard avant l'étape de formation conjuguée peut en effet augmenter les chances de bien image conjuguer. En outre, les faibles efficacités de transfection (lt;20%) peut être une mise en garde importante puisque ceci, combiné avec une efficacité modérée de formation conjuguée (environ 60%)^25,diminuera la probabilité de trouver des conjugués faits par les cellules transfectées. Ce n'est pas un problème lorsque des cellules non transfectées sont utilisées pour obtenir des conjugués dans les expériences de point final et la fixation ultérieure. Les 8 diapositives de chambre de micropuits sont compatibles avec les protocoles conventionnels d'immunofluorescence. Cela augmente la flexibilité du protocole ci-dessus à des fins différentes. Fixation avec l'acétone peut être un problème à considérer lors de l'utilisation de diapositives de chambre avec des puits de fond en plastique. Cependant, il y a dans le commerce 8 diapositives de chambre de microscope de micropuits disponibles contenant des fonds en verre, qui sont compatibles avec la fixation d'acétone. Retirez les couvercles en plastique lorsque l'acétone est utilisée pour fixer les cellules cultivées dans 8 diapositives de chambre en verre micropuits.

Il est recommandé que le microscope soit équipé d'un stade XY motorisé, d'une tourelle à épifluorescence motorisée et d'un système de mise au point automatique (p. ex., Perfect Focus System) ou de suppléments équivalents. Lorsque l'acquisition multi-puits est nécessaire²⁵, le système de mise au point automatique assurera une orientation stable tout au long de l'expérience. L'expérience antérieure indique qu'en établissant une compensation appropriée de mise au point sur les cellules Raji, le mouvement des lymphocytes T (Vidéo 1) et les mouvements de diapositives de stade/chambre de microscope dans les expériences multi-points de XY, peuvent être compensés. C'est en effet pratique pour la capture multiwell time-lapse.

Une caméra couplée à dispositif couplé (CDD) chargée en noir et blanc, panchromatique et refroidie a été utilisée, mais une caméra semi-conducteur complémentaire à oxyde de métal (sCMOS) à sensibilité plus élevée est souhaitable, car cela réduira les temps d'exposition de la caméra et améliorera la résolution temporelle. Les temps d'exposition à la caméra courte que nous avons utilisés (forme de classement de 100 ms à 500 ms) combinés à l'obturateur de fluorescence automatique permettent une capture prolongée du laps de temps (jusqu'à 24 h) avec une résolution de temps adéquate (1 cadre par minute ou moins, pour un nombre de 16 positions XY) sans blanchiment de fluorescence significative et/ou perte de viabilité cellulaire. L'étape motorisée permet la capture multi-points (XY) et augmente la chance de trouver et d'imager les synapses émergentes et en développement dans l'orientation idéale, mais permet également l'acquisition d'images dans des diapositives de chambre multiwell lorsque différents clones Jurkat doivent être simultanément conjugués²⁵. Une ouverture numérique élevée de l'objectif (c.-à-d. 60x, 1.4) est nécessaire afin d'obtenir les meilleurs résultats lors de l'analyse du trafic de granules sécréteurs.

Le RAJI-SEE-Jurkat constitue un modèle de synapse immunologique bien établi qui a été utilisé par une myriade de chercheurs depuis qu'il a été initialement décrit¹¹. Nous avons adapté notre protocole à ce modèle afin d'imager correctement les premiers stades de la formation de l'EI. Notre objectif était d'améliorer les premières approches^{suivies 20} pour étudier la polarisation du MTOC et de la machinerie sécrétrice vers l'EI. Il est remarquable que les conjugués réalisés avec ce protocole produisent F-actin réorganisation à la synapse, la configuration d'un SMAC canonique, en même temps que le trafic polarisé MVB²⁵. Ces événements cruciaux ont également été analysés et validés par microscopie^{confocale 25}.

Il existe des différences cinétiques dans le trafic polarisé entre les différents types d'IS. Par exemple, le transport polarisé des granules lytiques à partir des LCT se fait en quelques secondes ou en très peu de minutes, alors que plusieurs vésicules contenant de la cytokine des lymphocytes Th prennent de quelques minutes à plusieurs heures de fin. Ces différences temporelles doivent être prises en compte à l'avance, afin de concevoir la meilleure stratégie et de choisir l'approche expérimentale et d'imagerie la plus appropriée, puisque pour certains stratagèmes d'imagerie (c.-à-d., microscopie confocale de balayage laser (LSCM)), le temps peut être un facteur limitant puisque le temps de capture est beaucoup plus élevé que la résolution de temps appropriée (1 min ou moins)⁴. Ce n'est pas une limitation lorsque la microscopie à fluorescence à large champ (FMFM) est utilisée comme décrit dans le protocole ci-dessus. Puisque dans les CTL, la polarisation du MTOC vers la synapse ne dure que quelques minutes^3,6,17, diverses approches spécifiques de microscopie de l'art différentes de celles décrites ici (mais abritant une résolution spatiale et temporelle plus élevée) sont nécessaires afin d'imager correctement ces synapses^26,27, principalement lorsque plusieurs champs de microscope (capture multi-point) sont image. Ces nouvelles approches à haute résolution peuvent également être utilisées pour l'imagerie des synapses faites par les lymphocytes Th, bien que des raisons économiques et/ou logistiques (c.-à-d. que l'équipement de base requis pour certaines de ces techniques d'imagerie coûte 6 à 7 fois plus que celui décrit ici) pourraient certainement constituer une limitation pour ces méthodes d'imagerie de pointe⁴. Le fait que les IS faites par les lymphocytes Th sont de longue durée, et la circonstance que dans th lymphocytes le MTOC, les vésicules sécrétrices de lymphokine contenant et MVB prendre de plusieurs minutes jusqu'à des heures pour le transport et l'amarrage à l'IS²², rend ce protocole une approche idéale et abordable pour l'imagerie de la Th-APC IS.

La FMAM, combinée à la déconvolution d'images post-acquisition, constitue une approche intéressante et non seulement des raisons économiques appuient cette stratégie. La mauvaise résolution intrinsèque dans l'axe Z (la mise en garde la plus importante de la technique) peut être améliorée en utilisant la déconvolution d'image post-acquisition⁴ (comparez la vidéo 1 avec la vidéo 2). Deconvolution utilise une approche de traitement d'image basée sur le calcul qui peut améliorer le rapport signal/bruit et la résolution de l'image et contraster²⁷ jusqu'à 2 fois, jusqu'à 150-100 nm dans l'axe XY et 500 nm dans l'axe Z⁴.

L'utilisation d'une sensibilité plus élevée, d'une vitesse de lecture élevée et d'une large plage dynamique, de nouvelles caméras sCMOS à fluorescence amélioreront la qualité des images et réduiront le blanchiment de fluorescence. La flexibilité offerte par le protocole de conjugaison de cellule à cellule décrit ici permet la combinaison de l'approche cellulaire décrite avec plusieurs techniques de microscopie de pointe, à la fois dans les cellules vivantes, mais aussi dans les cellules fixes, et les résultats attendus améliorera en effet notre connaissance de la synapse immunologique.

Bien que nous ayons mis en œuvre et validé le protocole en utilisant des lignées cellulaires faciles à manipuler et bien établies, le potentiel de l'approche peut permettre la visualisation d'interactions plus physiologiques lorsque les lymphocytes T primaires et différents types de cellules présentant des antigènes (comme les cellules dendritiques des macrophages) sont utilisés⁵. Dans ce contexte, ce protocole a également été étendu et validé en utilisant la lignée cellulaire EL-4 de souris à impulsions de superantigène (SEB) utilisée comme APC, pour défier les lymphoblastes T de souris primaires^9. En effet, les lymphocytes T primaires, en particulier les CTL, ont rendu des contacts synaptiques plus éphémères et dynamiques (voir La vidéo supplémentaire 8 en référence⁹) à ceux observés avec le modèle SEE-Raji et Jurkat. La variabilité des modes de contact synaptiques peut être mieux vu pour les interactions primaires de Cellule T avec les cellules dendritiques ou les cellules B dans les équivalents de tissu in vitro bidimensionnels qui peuvent également être enregistrés et analysés en utilisant ce protocole. En outre, en dehors des superantigènes, la technique peut être utilisée pour l'image d'autres types de synapses. Par exemple, il pourrait être utilisé dans un modèle de lymphocyteT transgénique et spécifique à l'antigène T, par exemple en utilisant le système spécifique d'OValbumin OT1/OT2 ou par transfection de lymphocytes T avec des récepteurs de lymphocytes T spécifiques à l'antigène. Cela ouvre une myriade de possibilités expérimentales pour l'avenir immédiat.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Appareil photo Nikon DS-QI1MC	Nikon	MQA11550	Tête d’appareil photo refroidie
CMAC	ThermoFisher Scientific	C2110	Cell tracker bleu
Cellules JURKAT	ATCC	ATCC TIB-152	Effecteur Lymphocytes T
&mu ;-Slide 8 puits ibiTreat, &mu ;-Slide 8 well Glass-Bottom	IBIDI	Cat.No : 80826, 80827	Supports de culture cellulaire et d’imagerie cellulaire
Microscope NIKON Eclipse Ti-E	Nikon	NIKON Eclipse Ti-E	Microscope à fluorescence grand champ, entièrement motorisé, équipé de l’option Perfect Focus System (PFS)
Incubateur de platine de microscope avec mélangeur de gaz manuel à 3 canaux et module de bulle de gaz/humidité	OKOLAB	H201-NIKON-TI-S-ER	Atmosphère de culture cellulaire
Raji Cells	ATCC	ATCC CCL-86	APC
RPMI medium GIBCO	ThermoFisher Scientific	21875034	Milieu de culture
Streptococcus Enterotoxine E (SEE)	Toxin Technology, Inc	EP404	Logiciel de toxine bactérienne
Huygens Essential	SVI	Logiciel de déconvolution d’image	Huygens Essential
Logiciel ImageJ	NIH	Image J	Logiciel d’image
Nikon NIS-AR	Nikon	NIS-Elements AR	Logiciel de capture et d’analyse d’images