Modelage de la géométrie des colonies de cellules souches embryonnaires humaines sur des substrats conformes pour contrôler la mécanique de niveau tissulaire

Résumé

Les ligands de matrice extracellulaire peuvent être modelés sur des hydrogels de polyacrylamide pour permettre la culture des cellules souches embryonnaires humaines dans les colonies confinées sur des substrats conformes. Cette méthode peut être combinée avec la microscopie de force de traction et des essais biochimiques pour examiner l'interaction entre la géométrie de tissu, les forces cell-générées, et la spécification de destin.

Résumé

Les cellules souches embryonnaires humaines démontrent une capacité unique de répondre aux morphogènes in vitro par des modèles auto-organisés de spécification sépariane du destin cellulaire qui correspondent à la formation de couches germinales primaires pendant l'embryogenèse. Ainsi, ces cellules représentent un outil puissant pour examiner les mécanismes qui conduisent le développement humain précoce. Nous avons mis au point une méthode de culture de cellules souches embryonnaires humaines dans des colonies confinées sur des substrats conformes qui assure le contrôle de la géométrie des colonies et de leur environnement mécanique afin de récapituler les paramètres physiques qui sous-tendent l'embryogenèse. La caractéristique clé de cette méthode est la capacité de générer des hydrogels polyacrylamides avec des modèles définis de ligand matrice extracellulaire à la surface pour promouvoir l'attachement cellulaire. Ceci est réalisé en fabriquant des pochoirs avec les motifs géométriques désirés, en utilisant ces pochoirs pour créer des modèles de ligand de matrice extracellulaire sur des couvertures en verre, et en transférant ces modèles aux hydrogels de polyacrylamide pendant la polymérisation. Cette méthode est également compatible avec la microscopie de force de traction, permettant à l'utilisateur de mesurer et de cartographier la distribution des forces générées par les cellules dans les colonies confinées. En combinaison avec des essais biochimiques standard, ces mesures peuvent être utilisées pour examiner le rôle des indices mécaniques jouer dans la spécification du destin et la morphogénèse au cours du développement humain précoce.

Introduction

Les cellules souches embryonnaires humaines (HESC) sont très prometteuses pour une utilisation dans les applications de médecine régénérative et d'ingénierie tissulaire. La nature pluripotente de ces cellules leur donne la capacité de se différencier en n'importe quel type de cellule adulte. Bien que de grands progrès aient été réalisés dans la direction du sort des HESC vers des types cellulaires particuliers, il est resté très difficile de générer des tissus entiers ou des organes de novo^1,2,3^{,4, 5}. Cela est dû, en grande partie, à une compréhension limitée des mécanismes qui conduisent la formation de ces tissus au cours du développement humain. Afin de combler cette lacune dans les connaissances, un certain nombre de méthodes ont émergé ces dernières années pour modéliser l'embryon précoce et les stades de développement ultérieurs avec des cellules souches embryonnaires^{6,7,8,9 ,10,11,12,13}.

Peu de temps après la dérivation des premières lignées hESC¹⁴, il a été démontré que les corps embryonnaires formés à partir de HESCs étaient capables de produire spontanément des cellules des trois couches germinales primaires⁶. Cependant, en raison du manque inhérent de contrôle sur la taille et la morphologie des corps embryonnaires, l'organisation des couches germinales variait considérablement et ne correspondait pas à l'organisation de l'embryon précoce. Plus récemment, Warmflash et coll. ont mis au point une méthode pour confiner les colonies de HESC sur des substrats de verre par micro-patterning, fournissant un contrôle et une cohérence sur la taille et la géométrie des colonies⁸. En présence de BMP4, un morphogène important dans le développement précoce, ces colonies confinées étaient capables d'auto-organiser des modèles reproductibles de spécification aux destins représentant les couches germinales primaires. Bien que cela ait fourni un modèle utile pour étudier les mécanismes par lesquels les couches germinales primaires sont établies, les modèles de spécification de destin ne correspondent pas exactement à l'organisation et à la morphogenèse observées pendant l'embryogenèse^15. Une récapitulation plus fidèle du développement embryonnaire précoce a été réalisée en intégrant des HESC dans une matrice extracellulaire tridimensionnelle (ECM) de matrigel¹¹, fournissant les preuves les plus solides à ce jour de la capacité des HESC à s'auto-organiser et à modéliser les premiers stades de l'embryogenèse ex vivo. Cependant, cette méthode donne des résultats incohérents et est donc incompatible avec un certain nombre d'essais qui pourraient être utilisés pour révéler les mécanismes sous-jacents de l'auto-organisation et la spécification du destin.

Compte tenu de ces méthodes existantes et de leurs limites respectives, nous avons cherché à développer une méthode de culture reproduction des colonies hESC de géométries définies dans des conditions qui modélisent l'environnement extracellulaire de l'embryon précoce. Pour ce faire, nous avons utilisé des hydrogels polyacrylamides d'élasticité réglable pour contrôler les propriétés mécaniques du substrat. En utilisant la microscopie de force atomique sur les embryons de poulet au stade de la gastrulation, nous avons constaté que l'élasticité de l'épiblaste variait de centaines de pascals à quelques kilopascals. Ainsi, nous nous sommes concentrés sur la production d'hydrogels de polyacrylamide avec l'élasticité dans cette gamme pour servir de substrat pour les colonies de hESC. Nous avons modifié nos méthodes précédentes de culture des hESC sur les hydrogels polyacrylamides^7,9 afin de fournir un contrôle robuste sur la géométrie des colonies. Nous y sommes parvenus en faisant d'abord des glaçages eCM ligands, à savoir des matrigel, sur des feuilles de verre à travers des pochoirs microfabriqués, comme indiqué précédemment¹⁶. Nous avons ensuite conçu une nouvelle technique pour transférer le ligand à motifs à la surface des hydrogels de polyacrylamide pendant la polymérisation. La méthode que nous décrivons ici consiste à utiliser la photolithographie pour fabriquer une plaquette de silicium avec les motifs géométriques souhaités, la création de timbres de thèses géométriques avec polydimethylsiloxane (PDMS), et en utilisant ces timbres pour générer les pochoirs qui finalement permettre le modelage de ligand sur la surface des feuilles de verre et de transférer à polyacrylamide.

En plus de récapituler l'environnement mécanique de l'embryon précoce, le confinement des colonies hESC sur le polyacrylamide permet de mesurer les forces générées par les cellules avec la microscopie de force de traction (TFM), tel que rapporté dans notre méthode précédente⁹. En bref, les perles fluorescentes peuvent être incorporées dans le polyacrylamide et utilisées comme marqueurs fiducial. Les forces générées par les cellules sont calculées en imagerie du déplacement de ces perles après l'ensemencement des HESC sur le substrat à motifs. En outre, les cartes de force de traction qui en résultent peuvent être combinées avec des essais traditionnels, tels que l'immunostaining, pour examiner comment la distribution des forces générées par les cellules dans les colonies hESC confinées peut réguler ou moduler la signalisation en aval. Nous nous attendons à ce que ces méthodes révèlent que les forces mécaniques jouent un rôle critique dans le modelage de la spécification du destin cellulaire au cours du développement embryonnaire précoce qui est actuellement négligé.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici concernant l'utilisation des HESC ont été approuvées par le Human Gamete, Embryo and Stem Cell Research (GESCR) Committee de l'Université de Californie à San Francisco.

1. Préparation de plaquette de silicium avec des dispositifs géométriques

1. Créez un photomasque avec les caractéristiques géométriques souhaitées. Utilisez un logiciel de rédaction assisté par ordinateur pour concevoir les fonctionnalités. Pour une utilisation avec photoresist négatif, rendre les caractéristiques opaques et le reste du masque transparent.
   REMARQUE : Pour le modelage sur des couvertures de diamètre de 18 mm, les caractéristiques de groupe pour chaque condition expérimentale dans des zones de 10 x 10 mm pour s'assurer que les pochoirs générés à l'étape 3 s'adaptent aux couvertures.
2. Spin manteau photoresist négatif sur une plaquette de silicium de 100 mm. Utilisez la fiche de données photorésistante pour déterminer la vitesse et la longueur de la rotation afin de générer une épaisseur de film de 100 à 250 m.
   REMARQUE : L'épaisseur du film doit être ajustée de telle sorte que le rapport d'aspect de la largeur des motifs à la hauteur du pochoir soit aussi proche que possible de 1:1. Cependant, nous recommandons une épaisseur minimale de 100 m, car rien de moins produit des pochoirs délicats qui se déchirent facilement.
3. Traiter le photoresist selon la feuille de données du produit. Il s'agit généralement d'une cuisson molle, l'exposition aux UV avec photomask dans un aligneur de masque, après l'exposition cuire, le développement, et cuire dur cuire. Par exemple, la procédure utilisée pour traiter les gaufrettes utilisées dans ce protocole est décrite dans le tableau 1.
   REMARQUE : Soyez prudent lorsque vous manipulez des plaquettes de silicium car elles sont fragiles. Une fois générées, les gaufrettes peuvent être utilisées à plusieurs reprises tant qu'elles ne sont pas endommagées.

2. Préparation des couvertures

1. Préparation des couvertures « supérieures » lavées à l'acide
   1. Placer les couvercles de #1 de 18 mm de diamètre dans un plat Petri en verre. Le nombre approprié de couvertures dépend de la taille du plat. Pour un plat de 100 mm, préparer 50-100 couvertures à la fois. Les quantités de volume données dans le reste de cette section correspondent à un plat de 100 mm.
   2. Ajouter 20 ml de 1 M HCl au plat Petri et secouer délicatement le plat pour disperser les couvercles. Assurez-vous que toutes les fiches sont submergées et relâchez des bulles d'air entre les couvertures. Incuber toute la nuit à température ambiante en secouant doucement.
      CAUTION: HCl est acide et corrosif. Faites preuve de prudence et portez un EPI approprié tout en travaillant avec HCl.
   3. Decant HCl du plat. Ajouter 20 ml d'eau ultrapure et laver en secouant doucement pendant 10 min. Jeter l'eau et répéter pour un total de cinq lavages.
   4. Après avoir jeté le lavage final, ajouter 20 ml d'éthanol à 100 % au plat. À l'aide de forceps, retirer les couvertures individuellement et disposer entre deux morceaux de papier filtre pour sécher.
   5. Conserver les feuilles de couverture séchées dans un contenant scellé. Les couvertures lavées à l'acide peuvent être préparées à l'avance et entreposées pendant un mois ou plus dans des conditions exemptes de poussière.
2. Préparation des couvertures « inférieures » activées par le glutaraldéhyde
   REMARQUE: Se référer aux méthodes précédentes pour plus de détails^7,9.
   1. Placer des couvertures de #1 de 18 mm de diamètre dans un plat Petri.
   2. Ajouter 20 ml de 0,2 M HCl dans le plat de Pétri et secouer délicatement le plat pour disperser les couvercles. Assurez-vous que toutes les fiches sont submergées et relâchez des bulles d'air entre les couvertures. Incuber toute la nuit à température ambiante en secouant doucement.
   3. Decant HCl du plat. Ajouter 20 ml d'eau ultrapure et laver en secouant doucement pendant 10 min. Jeter l'eau et répéter pour un total de cinq lavages.
   4. Après avoir jeté le lavage final, ajouter 20 ml de 0,1 M NaOH et secouer doucement pour disperser et submerger les couvertures. Incuber à température ambiante en secouant doucement pendant 1 h.
   5. Decant NaOH du plat. Ajouter 20 ml d'eau ultrapure et laver en secouant doucement pendant 10 min. Jeter l'eau et répéter pour un total de cinq lavages.
   6. Après avoir jeté le lavage final, ajouter 20 ml d'une dilution de 1:200 de 3-aminopropyltrimethoxysilane dans l'eau ultrapure et secouer doucement pour disperser et submerger les couvertures. Incuber à température ambiante en secouant doucement pendant 1 h ou toute la nuit.
      CAUTION: 3-aminopropyltrimethoxysilane est inflammable et peut causer une irritation de la peau. Manipuler avec soin, porter le PPE approprié et jeter les déchets conformément aux règlements locaux d'élimination.
   7. Decant la solution diluée 3-aminopropyltrimethoxysilane du plat. Ajouter 20 ml d'eau ultrapure et laver en secouant doucement pendant 10 min. Jeter l'eau et répéter pour un total d'au moins cinq lavages. Il est essentiel d'enlever tous les 3-aminopropyltrimethoxysilane avant de procéder.
   8. Après avoir jeté le lavage final, ajouter 20 ml d'une dilution de 1:140 de 70% de glutaraldéhyde dans le phosphate tamponné salin (PBS) et secouer doucement pour disperser et submerger les couvertures. Incuber à température ambiante en secouant doucement pendant 1 h ou toute la nuit.
      CAUTION : 70% de glutaraldéhyde est toxique et peut causer une irritation de la peau. Manipuler avec soin, porter le PPE approprié et jeter les déchets conformément aux règlements locaux d'élimination.
   9. Décant la solution diluée de glutaraldéhyde du plat. Ajouter 20 ml d'eau ultrapure et laver en secouant doucement pendant 10 min. Jeter l'eau et répéter pour un total de cinq lavages.
   10. Après avoir jeté le lavage final, ajouter 20 ml d'éthanol à 100 %. À l'aide de forceps, retirer les couvertures individuellement et disposer entre deux morceaux de papier filtre pour sécher.
   11. Conserver les feuilles de couverture séchées dans un contenant scellé. Les fiches de couverture activées par le glutaraldéhyde peuvent être préparées à l'avance et stockées jusqu'à six mois.

3. Génération de pochoirs pour le modèle ECM ligand

1. Génération de timbres intermédiaires en polydiméthylsiloxane (PDMS)
   1. Mélanger la base PDMS avec l'agent de durcissement PDMS à un rapport de 10:1, par poids. Mélanger.
      REMARQUE : Pour l'application initiale du PDMS, préparer environ 100 g de PDMS pour remplir un plat de 100 mm. Pour les applications ultérieures, retirez Le PDMS du centre du plat où se trouvent les caractéristiques des plaquettes de silicium et préparez 20 à 30 g de nouveau PDMS.
   2. Dégazer le mélange PDMS dans un dessiccateur pendant 30-60 min ou jusqu'à ce que toutes les bulles d'air soient enlevées.
   3. Placer la plaquette de silicium modifiée de l'étape 1 dans un plat en plastique de 100 mm. Verser lentement et uniformément le mélange De PDMS sur la surface de la plaquette. Appuyez sur le plat sur la surface de travail pour libérer les bulles d'air de la surface de la plaquette.
   4. Degas le mélange PDMS versé sur la plaquette pendant 10 min ou jusqu'à ce que toutes les bulles d'air sont enlevés ou sont venus à la surface du PDMS.
   5. Cuire le PDMS à 70 oC pendant 2 h. Laisser refroidir à température ambiante.
   6. À l'aide d'un scalpel ou d'un coupe-boîte, découper la section de PDMS du centre du plat qui contient les caractéristiques géométriques.
   7. Couper le PDMS en carrés d'environ 10 x 10 mm, chacun contenant les caractéristiques d'une seule condition expérimentale. Ces « timbres » sont appelés « timbres » dans les étapes ultérieures du protocole.
2. Génération de dalles plates de PDMS
   1. Mélanger la base PDMS avec l'agent de durcissement PDMS à un rapport de 8:1, par poids. Préparer environ 20 g pour chaque plat de 100 mm à utiliser. Mélanger.
   2. Dégazer le mélange PDMS dans un dessiccateur pendant 30-60 min ou jusqu'à ce que toutes les bulles d'air soient enlevées.
   3. Versez lentement et uniformément le PDMS dans un plat propre de 100 mm. Appuyez sur le plat sur la surface de travail pour libérer les bulles d'air.
   4. Cuire le PDMS à 70 oC pendant 2 h. Laisser refroidir à température ambiante.
   5. Retirer le PDMS du plat. Inverser de telle sorte que la surface du PDMS qui était en contact avec le fond du plat est orientée vers le haut.
   6. Pour chaque timbre généré à l'étape 3.1, coupez un carré de 15 x 15 mm de PDMS. Ces « dalles plates » sont appelées « dalles plates » dans les étapes ultérieures du protocole.
3. Générer des pochoirs
   1. Disposer les dalles plates de PDMS sur le couvercle d'un plat de 150 mm, ou toute autre surface plane pour une manipulation plus facile. Assurer un espacement suffisant entre les dalles (p. ex., pour un plat de 150 mm, disposer neuf dalles plates avec un espacement uniforme).
   2. Inverser chaque timbre généré à l'étape 3.1 sur une dalle plate de PDMS, de sorte que les caractéristiques du timbre sont en contact avec la dalle plate de PDMS. Appuyez doucement sur le dessus du timbre avec des forceps pour assurer un contact uniforme.
   3. Aplatlez soigneusement le couvercle tenant pDMS timbre / dalle paires sur la base du plat, de sorte que le couvercle repose à un angle. Cela aide à l'évacuation du polymère UV-curable dans l'étape suivante.
   4. Placez une petite goutte de polymère UV-curable à l'interface supérieure de chaque paire timbre/dalle. Le polymère sera méchant entre les deux par la tension de surface, assisté par la gravité.
      REMARQUE : De nombreux polymères UV-curables peuvent fonctionner dans ce protocole. Nous avons sélectionné Norland Optical Adhesive 74 pour les propriétés suivantes: i) Durcissement rapide lors de l'exposition à la lumière UV, ii) Retrait facile des timbres PDMS sur le durcissement, iii) Adhérence robuste aux couvertures en verre avec pression manuelle.
   5. Une fois que le polymère a été complètement méchant à travers, placez le couvercle avec des paires de timbres / dalle à plat sur la surface de travail. Placez une petite goutte de polymère UV-curable sur chacun des trois côtés restants de chaque interface timbre/dalle.
   6. À l'aide d'une pointe de pipette de 200 l L, connectez les gouttes de polymère sur les bords de l'interface timbre/dalle. Cela crée une frontière qui tiendra la solution ligand à l'étape 4.
      REMARQUE : Soyez prudent lorsque vous travaillez le polymère sur les bords du timbre. Si l'interface timbre/dalle est perturbée, le polymère mèche sous les caractéristiques et le pochoir ne se formera pas correctement.
   7. Placez délicatement les paires timbre/dalle dans une boîte de stérilisation UV. Utilisez le réglage de puissance stérile "Str" et exposez pendant 10 min.
   8. Retirez les paires timbre/dalle de la boîte de stérilisation UV. À l'aide de deux paires de forceps, retirez délicatement le timbre PDMS tout en maintenant la dalle plate et le pochoir qui se sont formés à partir du polymère curable UV.
   9. À l'aide de forceps, retirez soigneusement le pochoir et inversez-le de telle sorte que la surface qui était en contact avec la dalle plate de PDMS est orientée vers le haut.
      REMARQUE : Les pochoirs sont délicats. Soyez prudent lors de leur remise, en particulier tout en les retirant d'abord du PDMS, afin qu'ils ne se déchirent pas.
   10. Remettre les pochoirs inversés dans une boîte de stérilisation UV. Utilisez le réglage de puissance stérile "Str" et exposez pendant 3 min.

4. Ligand de modèle d'ECM sur des couvertures

1. Appuyer sur les pochoirs sur des couvertures lavées à l'acide
   1. Placer une feuille de couverture lavée à l'acide pour chaque pochoir sur un morceau propre de film de laboratoire.
   2. À l'aide de forceps, placez soigneusement chaque pochoir, côté plat vers le bas, sur un bordereau lavé à l'acide. Placez de telle sorte que les caractéristiques sont centrées sur le bordereau de couverture.
   3. Placer un petit morceau de film de laboratoire sur chaque pochoir. Appuyez fermement et uniformément sur le pochoir pour créer un contact fort entre le pochoir et le bordereau.
      REMARQUE: Il s'agit d'une étape critique! Appuyez fermement et sur toute la surface du pochoir. Si un contact suffisant n'est pas créé, la solution ligand s'infiltrera entre le pochoir et les couvertures et le modelage échouera. OPTIONAL: Pour confirmer un contact suffisant entre le pochoir et la glissière, pipette 100 'L d'eau stérile ultrapure sur la surface de chaque pochoir et incuber à température ambiante. Après 1 h, vérifiez s'il y a une fuite. Aspirez l'eau des pochoirs collés avec succès et procédez.
2. Plasma nettoyant la surface des couvertures au pochoir pour augmenter l'hydrophilie
   1. Placer les feuilles de couverture avec des pochoirs dans un nettoyant à plasma. Appliquer du plasma de haute puissance pendant 30 s.
3. Préparation de la solution ECM ligand
   REMARQUE : Toutes les étapes ultérieures doivent être effectuées dans des conditions stériles, si possible.
   1. Placer stérile 100 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 8.0 solution sur glace. Une fois la glace froide, ajouter le matrigel et le collagène pour obtenir des concentrations de 225 g/mL et de 25 g/mL, respectivement. OPTIONAL: Pour le dépannage ou pour la visualisation ligand, inclure un ligand étiqueté fluorescent dans la solution ligand.
      1. REMARQUE: Différents ligands ECM peuvent être utilisés avec cette méthode. Pour différents ligands, une optimisation supplémentaire peut être nécessaire pour déterminer la concentration idéale, le temps d'incubation et la température d'incubation. Voir la section de discussion pour plus d'informations.
   2. Pipette la solution ligand sur la surface de chaque pochoir. Pour les pochoirs fabriqués à partir de timbres carrés de 10 x 10 mm, appliquez 100 l par pochoir.
   3. Vérifiez s'il y a des bulles d'air dans les fonctions de pochoir. Si nécessaire, utilisez des forceps à pointe fine ou une pointe de pipette de 2 l pour enlever les bulles d'air des entités.
      REMARQUE: Il s'agit d'une étape critique! Si les bulles d'air restent emprisonnées à la surface de la glissière de couverture, le ligand ne sera pas adsorb à la surface et le modèle résultant sera incomplet.
   4. Placer les feuilles de couverture au pochoir avec du ligand dans un plat, envelopper avec du film de laboratoire, et incuber à 4 oC pendant la nuit.

5. Transfert de ligand au gel de polyacrylamide

1. Suppression de la solution ligand et pochoir de chaque bordereau
   1. Aspirez la solution ligand de la surface d'un pochoir. La solution Ligand peut être collectée et stockée à 4 oC et réutilisée jusqu'à un mois.
   2. À l'aide de forceps, immerger brièvement la glissière de couverture avec du pochoir dans un plat contenant du PBS stérile à laver.
   3. Immerger brièvement le bordereau avec du pochoir dans un deuxième plat de PBS stérile à laver.
   4. Retirer le pochoir de la surface de la glissière. Veillez à ne pas casser la glissière de couverture.
   5. Immerger brièvement le bordereau dans un plat contenant de l'eau stérile ultrapure pour enlever les sels des lavages PBS. Appuyez sur le bord de la feuille de couverture à une tâche délicate essuyer pour évacuer l'excès d'eau.
   6. Séchez la couverture sous un gaz inerte, comme l'azote. Marquez le dessous de la couverture pour garder une trace de l'orientation à partir de ce point vers l'avant. Veillez à garder le côté à motifs vers le haut.
   7. Répétez les étapes 5.1.1 à 5.1.6 pour chaque feuillet de couverture au pochoir.
2. Fabrication d'hydrogels polyacrylamides avec des couvertures à motifs
   REMARQUE : Se référer aux méthodes précédentes pour des détails supplémentaires^7,9 Stérilisez tous les supports de chapeau, les tubes, et les espaceurs utilisés pour faire des gels de polyacrylamide en lavant avec 10% d'eau de Javel pendant la nuit, rinçant avec de l'eau au moins cinq fois pour enlever l'eau de Javel, et le lavage brièvement dans l'éthanol de 70%. Placer tous les morceaux sur des lingettes délicates dans une armoire de biosécurité stérile pour sécher avant utilisation.
   1. Préparer la solution de polyacrylamide pour obtenir l'élasticité d'hydrogel désirée (tableau 2). Mélanger tous les composants sauf les microsphères fluorescentes et le persulfate de potassium (PPS).
      REMARQUE : Préparer 1 % de persulfate de potassium à chaque fois.
   2. Dégazer la solution de polyacrylamide, les microsphères et le PPS dans des tubes séparés sous vide pendant 30 min.
   3. Pour chaque bordereau à motifs, préparez un bordereau « bas » activé par le glutaraldéhyde avec un espaceur (18 mm de diamètre extérieur, 14 mm de diamètre intérieur) placé sur le dessus.
   4. Après le dégazage, sonicate brièvement les microsphères et ajoutez le volume approprié à la solution de polyacrylamide. Mélanger en pipetting de haut en bas, en faisant attention de ne pas introduire de bulles d'air. Peu sonore.
   5. Ajoutez le volume approprié de PPS à la solution de polyacrylamide. Pipette de haut en bas pour mélanger la solution, en prenant soin de ne pas introduire de bulles d'air.
      REMARQUE : Après l'ajout de PPS, travaillez rapidement pour terminer les étapes 5.2.6 à 5.2.11 avant que le polyacrylamide ne polymérise.
   6. Pipette 75-150 L (selon l'épaisseur de l'espaceur) au centre de chaque bordereau activé par le glutaraldéhyde.
   7. À l'aide de forceps, placez un bordereau à motifs sur chaque bordereau activé par le glutaraldéhyde avec du polyacrylamide et de l'espaceur, de sorte que le ligand à motifs fait face à la solution de polyacrylamide. Si une solution suffisante de polyacrylamide a été ajoutée, la tension de surface évacuera le polyacrylamide entre les deux couvertures et aucune bulle d'air ne sera présente.
   8. Ramassez chaque polyacrylamide "sandwich" et touchez soigneusement le côté à une tâche délicate essuyer pour évacuer l'excès de solution de polyacrylamide.
   9. Placez soigneusement chaque polyacrylamide "sandwich" dans un porte-bouchon avec des fils qui sont compatibles avec 15 ml tubes conique-bas. L'orientation doit être telle que le fond de la glissière de couverture de glutaraldéhyde est en contact avec le bas du support de capuchon, et le couvercle modelé est sur le dessus.
   10. Visser un tube conique-bas de 15 ml dans chaque support de capuchon pour maintenir les « sandwichs » de polyacrylamide en place. Les tubes doivent être serrés pour éviter les fuites, mais attention à ne pas trop serrer et casser les couvercles.
   11. Centrifuger les "sandwichs" en polyacrylamide dans les tubes dans des seaux à balançoire à 200 x g pendant 10 min à température ambiante. Retirer les tubes de la centrifugeuse et les placer dans des grilles à tubes pour maintenir l'orientation pendant 50 minutes supplémentaires afin d'assurer une polymérisation complète. Garder couvert de papier d'aluminium pour éviter le blanchiment des microsphères fluorescentes.
       REMARQUE : La centrifugation est essentielle lors de l'utilisation de cette méthode pour effectuer TFM. La force centrifuge déplace toutes les microsphères vers un seul plan, qui sera finalement juste en dessous de la surface de l'hydrogel. Ceci est idéal pour l'imagerie des déplacements de microsphère qui sont utilisés pour calculer les contraintes de traction générées par les cellules. Si elles ne sont pas performantes, les microsphères peuvent être laissées à l'écart de la solution de polyacrylamide et la polymérisation peut se produire au banc sans centrifugation.
   12. Retirer les « sandwichs » polyacrylamide polymérisés des tubes et les immerger dans le PBS dans un plat de 100 mm. Envelopper dans un film de laboratoire et incuber pendant 3 h à température ambiante ou toute la nuit à 4 oC.
3. Préparation de gels à motifs pour les cellules d'ensemencement
   1. Utilisez un scalpel et des forceps pour enlever soigneusement le bordereau à motifs et l'espaceur du polyacrylamide "sandwich" alors qu'il reste immergé dans PBS. Le ligand à motifs aura été transféré au polyacrylamide pendant la polymérisation et restera après avoir enlevé le bordereau. Le gel de polyacrylamide restera attaché à la couverture activée par le glutaraldéhyde.
      REMARQUE: Il s'agit d'une étape critique! Le polyacrylamide doit être immergé dans PBS tout en enlevant le bordereau de couverture ou les modèles de ligand seront détruits.
   2. Placez chaque bordereau avec du polyacrylamide à motifs dans un porte-capuchon. Placez un joint (18 mm de diamètre extérieur, 14 mm de diamètre intérieur) sur le dessus de la glissière de couverture et autour du polyacrylamide, où se trouvait l'espaceur. Visser un tube conique de 15 mm à fond conique dans le porte-capuchon, formant un puits avec le polyacrylamide à motifs au fond. Ces assemblages s'intègrent dans les puits d'une plaque standard de 12 puits pour une manipulation facile.
   3. Laver chaque gel en ajoutant 500 L de PBS à l'assemblage du puits. Incuber 10 min à température ambiante en secouant doucement. Retirez le PBS et répétez deux fois pour un total de trois lavages.
   4. Après le lavage final de PBS, ajouter 500 'L de knock-out-DMEM médias aux gels et incuber à 37 oC pendant la nuit. Les gels peuvent être conservés à 37 oC avec des supports jusqu'à 5 jours avant l'ensemencement des cellules.
   5. La veille de l'ensemencement des cellules, remplacez le knock-out-DMEM pour les médias KSR complets et incuber à 37 oC pendant la nuit.

6. Cultiver des hESC sur des gels à motifs

REMARQUE : Si vous prévoyez de fixer des échantillons pour l'immunostaining après TFM, prenez des images des positions non stressées de microsphère avant des cellules d'ensemencement. Dans ce cas, le ligand étiqueté fluorescent doit être utilisé à l'étape 4.3.1 afin que les emplacements éventuels des cellules soient connus avant que l'ensemencement et les microsphères puissent être photographiés dans ces régions.

1. Maintenir les cultures hESC de stock et les cultures secondaires sans mangeoire préparées sur des plaques matrigel-enduites dans les médias conditionnés de KSR avant l'ensemencement sur les gels de polyacrylamide modelés comme précédemment décrit^9.
   REMARQUE : Générer des médias KSR conditionnés en crepandant des fibroblastes embryonnaires irradiés de souris dans les médias KSR complétés par un facteur de croissance de base de 4 ng/mL de fibroblaste (bFGF). Recueillir et remplacer les médias tous les 24 h.
2. Aspirez les médias à partir de HESCs. Brièvement laver avec knock-out-DMEM médias. Ajouter 0,05 % de trypsine-EDTA complété par 10 M Y27632 (inhibiteur de la kinase rho) et incuber à 37 oC pendant 5 à 10 min.
3. Ajouter le support avec le sérum pour inhiber la trypsine. Aspirez délicatement le support et la pipette sur le plat pour enlever les cellules. Continuer à pipetting doucement pour enlever toutes les cellules et dissocier les amas cellulaires à des cellules simples.
4. Recueillir la suspension cellulaire et la centrifugeuse à 200 x g pendant 3 min.
5. Aspirer le supernatant et resuspendre la pastille dans un volume équivalent de support KSR pour laver. Centrifugeuse à 200 x g pendant 3 min.
6. Aspirez le supernatant et suspendez la pastille dans des supports KSR conditionnés complétés par 10 ng/mL bFGF et 10 M Y27632.
7. Comptez les cellules avec un hémocytomètre et ajustez la suspension cellulaire à une concentration de 300 000 cellules par mL. Pipette 500 l de la suspension cellulaire sur chaque gel à motifs (150 000 cellules par gel).
8. 3 h après l'ensemencement, utiliser une pipette pour aspirer soigneusement le support de chaque gel et remplacer par un nouveau support KSR conditionné complété par 10 ng/mL bFGF et 10 M Y27632. Ceci enlève les cellules excédentaires qui n'ont pas adhéré aux régions modelées du polyacrylamide.
   REMARQUE: Il s'agit d'une étape critique! À ce stade, les cellules seront lâchement adhéré à la ligand à motifs. Soyez très prudent lors de l'échange de médias pour ne pas détacher les cellules. Une attention égale doit être prise avec chacun des échanges de médias dans les étapes suivantes.
9. 24 h après l'ensemencement, utilisez une pipette pour aspirer soigneusement les médias et échangez-les pour les supports KSR conditionnés complétés par 10 ng/mL bFGF et 5 M Y27632.
10. 48 h après l'ensemencement, utiliser une pipette pour aspirer soigneusement les médias et échanger contre des supports KSR conditionnés complétés par 10 ng/mL bFGF. Cela supprime l'inhibiteur de la kinase Rho des médias et les expériences peuvent commencer le lendemain, 72 h après l'ensemencement.

7. Exécution de TFM

1. Si désiré, effectuer TFM comme précédemment décrit⁹ dans les conditions expérimentales souhaitées.
2. Si des positions de microsphère non stressées ont été imaginées avant l'ensemencement des cellules, fixez les cellules après avoir pris des positions de microsphère stressées et effectuez l'immunostaining pour déterminer la localisation des protéines d'intérêt par rapport aux régions des forces de traction élevées et basses.

Résultats

Le principal défi à surmonter en essayant de la culture hESCs dans les colonies de géométrie contrôlée sur des substrats conformes est de générer un modèle homogène de ECM-ligand sur la surface du substrat. La stratégie présentée dans cette méthode consiste d'abord à générer le motif désiré à la surface d'un bordereau de verre, puis à transférer ce motif à la surface d'un hydrogel polyacrylamide lors de la polymérisation du gel (Figure 1 R. A...

Discussion

Pour simplifier un protocole long et détaillé, cette méthode se compose de trois étapes critiques : 1) la génération de modèles de ligand ECM sur des couvertures en verre, 2) le transfert des modèles aux hydrogels de polyacrylamide pendant la polymérisation du gel, et 3) les HESC d'ensemencement sur le hydrogel à motifs. Il y a des étapes critiques qui doivent être prises en considération à chacune de ces trois étapes. Afin de générer des modèles de haute fidélité sur les feuilles de verre, le pochoir doit être fermement...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,05 % Trypsine	Gibco 25300054
100 mm boîte de Pétri en verre	Fisher Scientific	08-747B
Boîte de Pétri en plastique de 100 mm	Fisher Scientific	FB0875712
15 mL Tubes à fond conique	Corning	352095
150 mm Boîte de Pétri en plastique	Fisher Scientific	FB0875714
18 mm lamelles de diamètre #1	Thermo Scientific	18CIR-1
2 % bisacrylamide	Bio-Rad	161-0142
3-aminopropyltrimethoxysilane	ACROS Organics	313251000
40 % acrylamide	Bio-Rad	161-0140
Feuille d’aluminium	Fisher Scientific	01-213-100
Facteur de croissance des fibroblastes basiques	Sigma-Aldrich	F0291
Bleach	Clorox	N/A
Centrifugeuse avec swing-buckets	Eppendorf	22623508	Modèle : 5804 R
Collagen	Corning	354236
Dessicator	Fisher Scientific	08-642-7
Ethanol	Fisher Scientific	AC615095000
Fetal sérum bovin	Gibco	16000044
Microsphères fluorescentes	Thermo Scientific	F8821
Pince (pour lamelles)	Fisher Scientific	16-100-122
Pince (pour plaquettes)	Fisher Scientific	17-467-328
Porte-gel	N/A	N/A	Les supports de gel sont imprimés en 3D sur mesure, dessin CAO disponible sur demande
Glutaraldéhyde	Fisher Scientific	50-261-94
HEPES	Thermo Scientific	J16926A1
Plaque chauffante	Fisher Scientific	HP88854100
Acide chlorhydrique	Fisher Scientific	A144S-500
Alcool isopropylique	Fisher Scientific	A416-500
Kimwipes (lingettes délicates)	Kimberly-Clark Professional	34120
Knockout sérum de remplacement	Gibco	10828028
Knockout-DMEM	Gibco	10829018
Aligneur de masque (pour photolithographie)	Karl Suss America, Inc.	Karl Suss MJB3 Aligneur
Matrigel	Corning	354277
Microscope pour force de traction	Nikon	N/A	Modèle : Eclipse TE200 U
Platine de positionnement motorisée	Prior Scientific	N/A	Modèle : HLD117
Azote gazeux	Airgas	NI 250
Norland Adhésif optique 74 (polymère durcissable aux UV)	Norland Produits	NOA 74
Four	Thermo Scientific	PR305225G
Parafilm (film de laboratoire)	Fisher Scientific	13-374-12
PDMS (Sylgard 184)	Fisher Scientific	NC9285739
Photomask	CAD/Art Services, Inc.	N/A	Les photomasques sont fabriqués sur mesure. Dessin CAO pour nos conceptions disponible sur demande
Nettoyeur de plasma	Fisher Scientific	NC9332171
Plastique pour joint	Marian Chicago	HT6135
Plastique pour entretoise	TAP Plastiques	N/A	Feuille de polycarbonate, 0,01 pouce d’épaisseur
Chlorure de potassium (pour la fabrication de PBS)	Fisher Scientific	P217-500
Phosphate de potassium monobasique (pour la fabrication de PBS)	Fisher Scientific	P285-500
Persulfate de pottassium	ACROS Organics	424185000
Scalpel	Fisher Scientific	14-840-00
Plaquette de silicium	Microscopie électronique Sciences	71893-06	Type P, 3 pouces, plaquettes de silicium
Chlorure de sodium (pour la fabrication de PBS)	Fisher Scientific	S271-1
Hydroxyde de sodium	Fisher Scientific	S318-100
Phosphate dibasique de sodium dihydraté (pour la fabrication de PBS)	Fisher Scientific	S472-500
SU8-3050 Photoresist	MicroChem	SU8-3000
SU8-Developer	MicroChem	Y020100
TEMED	Bio-Rad	161-0800
Boîte de stérilisation UV	Bio-Rad	N/A	Bio-Rad GS Gene Linker Chambre UV
Y27632 (inhibiteur de la Rho kinase)	StemCell Technologies	72304