Caractérisation cytométrique simultanée des types de cellules multiples récupérées du cerveau de la souris / moelle épinière grâce à différentes méthodes d'homogénéisation

Summary

Nous présentons une méthode de cytométrie de flux pour identifier simultanément différents types de cellules récupérées du cerveau de souris ou de la moelle épinière. Cette méthode pourrait être exploitée pour isoler ou caractériser les populations cellulaires pures dans les maladies neurodégénératives ou pour quantifier l'étendue du ciblage cellulaire sur l'administration in vivo de vecteurs viraux ou de nanoparticules.

Abstract

Les progrès récents des sciences des vecteurs viraux et des nanomatériaux ont ouvert la voie à de nouvelles approches de pointe pour étudier ou manipuler le système nerveux central (SNC). Cependant, une optimisation plus poussée de ces technologies bénéficierait de méthodes permettant une détermination rapide et rationalisée de l'étendue du SNC et du ciblage cellulaire spécifique à l'administration de vecteurs viraux ou de nanoparticules dans l'organisme. Ici, nous présentons un protocole qui tire parti des capacités de haut débit et de multiplexage de la cytométrie du débit pour permettre une simple quantification de différents sous-types cellulaires isolés du cerveau de souris ou de la moelle épinière, à savoir des microglies/macrophages, des lymphocytes, des astrocytes, des oligodendrocytes, des neurones et des cellules endothéliales. Nous appliquons cette approche pour mettre en évidence les différences critiques entre deux méthodes d'homogénéisation des tissus en termes de rendement cellulaire, de viabilité et de composition. Cela pourrait demander à l'utilisateur de choisir la meilleure méthode en fonction du type de cellule (s) d'intérêt et de l'application spécifique. Cette méthode n'est pas adaptée à l'analyse de la distribution anatomique, puisque le tissu est homogénéisé pour générer une suspension unicellulaire. Cependant, il permet de travailler avec des cellules viables et il peut être combiné avec le tri cellulaire, ouvrant la voie à plusieurs applications qui pourraient élargir le répertoire des outils dans les mains du neuroscientifique, allant de l'établissement de cultures primaires dérivées de populations cellulaires pures, à des analyses d'expression génique et des essais biochimiques ou fonctionnels sur des sous-types cellulaires bien définis dans le contexte des maladies neurodégénératives, sur le traitement pharmacologique ou la thérapie génique.

Introduction

Les technologies d'administration de gènes et de médicaments (comme les vecteurs viraux et les nanoparticules) sont devenues un outil puissant qui peut être appliqué pour obtenir de meilleures connaissances sur des voies moléculaires spécifiques modifiées dans les maladies neurodégénératives et pour le développement d'approches thérapeutiques innovantes^1,2,3. L'optimisation de ces outils repose sur la quantification de : (1) l'étendue de la pénétration du SNC sur différents axes d'administration et (2) le ciblage de populations cellulaires spécifiques. Les analyses histologiq....

Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) du Dana Farber Cancer Institute (protocole numéro 16-024).

1. Préparation des solutions nécessaires à l'expérience

1. Préparer la solution de sel équilibrée (HBSS) de 1x Hank en diluant 10x HBSS avec de l'eau stérile. Pré-réfrigérer la solution sur glace. Au moins 25 ml de solution sont nécessaires pour chaque échantillon.
2. Préparer la solution isotonique Percoll (IPS) en mélangeant 10x HBSS stérile 1:10 avec le milieu de gradient de densité (c.-à-d., Percoll). Pré-froid sur glace.
   REMARQUE : L'IP....

Results

Nous avons comparé deux méthodes différentes d'homogénéisation (DH contre PD) appliquées au cerveau de souris et à la moelle épinière, pour tester l'efficacité dans la récupération de différents types de cellules viables adaptées aux applications en aval. Pour ce faire, nous avons exploité un panneau de cytométrie de flux de 9 couleurs conçu pour caractériser, dans le même échantillon, différents types de cellules du SNC, y compris les microglies, les lymphocytes, les neurones, les astrocytes, les oligodendrocytes et l'e.......

Discussion

Ici nous décrivons un protocole pour la co-purification et l'analyse cytométrique simultanée de flux de quelques-unes des cellules les plus pertinentes de CNS du cerveau de souris et de la moelle épinière. Traditionnellement, des analyses histologiques ont été appliquées pour décrire la distribution des nanoparticules ou l'efficacité de la transduction des vecteurs viraux dans le SNC^5,13, ou pour fournir des informations sur les changements morphologiques et molé.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X HBSS (sans calcium, chlorure de magnésium et sulfate de magnésium)	Gibco	14185-052
70 mm Filtre à cellules	Corning	431751
ACSA/ACSA2 anticorps anti-souris	Miltenyi Biotec	130-117-535	APC conjugué
Albumine sérique bovine	Sigma Aldrich	A9647-1KG
CD11b anticorps anti-souris	Invitrogen	47-0112-82	APC-eFluor 780 CD31 conjugué
anti-souris anti-souris	BD Bioscience	562939	BV421 CD421 conjugué
CD45 anti-souris	Biolegend	103138	Brilliant Violet 510
CD90.1/Thy1.1 anti-souris	biolegend	202518	/Cy7 conjugué
CD90.2/Thy1.2 anti-souris	Biolegend	1005325	Tubes coniques conjugués PE/Cy7
(15 mL)	229411		CellTreat
(50 mL)	CellTreat	229422
Dounce Ensemble de broyeurs de tissus (comprend le mortier ainsi que les pilons A et B)	Sigma-Aldrich	D9063-1SET
Fc (CD16/CD32) Anticorps anti-souris anti-rat de bloc	BD Pharmingen	553142
Fetal Bovine Serum	Benchmark	100-106
Kit de dissociation du tissu neural (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628
O4 anti souris/rat/humain	Anticorps Miltenyi Biotec	130-095-895	Biotine conjuguée
Percoll	GE Healthcare	10266569	vendue comme réactif non stérile
Percoll	Sigma	65455529	réactif stérile (à utiliser pour les applications nécessitant la stérilité)
Réactif Percoll PLUS	Sigma	GE17-5445-01	contenant de très faibles traces d’endotoxine
Streptavidin	Invitrogen	S3258	Alexa Fluor 680 conjugué