Method Article

Détermination de la production, de la cristallisation et de la structure du domaine iKK-contraignant de NEMO

DOI:

10.3791/60339

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December 28th, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Dartmouth College

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons des protocoles pour la détermination de structure du domaine IKK-contraignant de NEMO par la cristallographie de rayon X. Les méthodes incluent l'expression, la purification et la caractérisation des protéines ainsi que des stratégies pour une optimisation réussie des cristaux et la détermination de la structure de la protéine sous sa forme non liée.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NEMO est une protéine d'échafaudage qui joue un rôle essentiel dans la voie NF-B en assemblant le complexe IKK avec les kinases IKKet et IKK. Lors de l'activation, le complexe IKK phosphorylate les molécules i-B conduisant à la translocation nucléaire NF-B et à l'activation des gènes cibles. L'inhibition de l'interaction NEMO/IKK est un paradigme thérapeutique attrayant pour la modulation de l'activité de la voie NF-B, faisant de NEMO une cible pour la conception et la découverte d'inhibiteurs. Pour faciliter le processus de découverte et d'optimisation des inhibiteurs NEMO, nous avons conçu une construction améliorée du domaine IKK-contraignant de NEMO qui permettrait la détermination de la structure de la protéine sous forme d'apo et tout en se liant à de petits inhibiteurs du poids moléculaire. Ici, nous présentons la stratégie utilisée pour la conception, l'expression et la caractérisation structurelle du domaine IKK-contraignant de NEMO. La protéine est exprimée dans les cellules E. coli, solubilisée dans des conditions dénaturantes et purifiée par trois étapes chromatographiques. Nous discutons des protocoles pour l'obtention de cristaux pour la détermination de la structure et décrions les stratégies d'acquisition et d'analyse des données. Les protocoles trouveront une large applicabilité à la détermination de la structure des complexes de NEMO et des inhibiteurs de petites molécules.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La voie NF-B est activée en réponse à une variété de stimuli, y compris les cytokines, les produits microbiens et le stress, pour réguler l'expression des gènes cibles responsables de la réponse inflammatoire et immunitaire, la mort cellulaire ou la survie et la prolifération1. Les pathologies, y compris les maladies inflammatoires et auto-immunes et le cancer2,3,4,5 ont été corrélées à l'hyperactivation de la voie, qui a fait de la modulation de l'activité NF-B une cible de choix pour le développement de nouvelles thérapies6,7.

La voie canonique NF-B en particulier se distingue de la voie non canonique, responsable de la lymphorganogenèse et de l'activation des cellules B, par la dépendance de l'ancien à la protéine d'échafaudage NEMO (modulateur essentiel NF-B8) pour l'assemblage du complexe IKK avec les kinases IKKet et IKK. Le complexe IKK est responsable de la phosphorylation de l'IB (inhibiteur de l'IB) qui le cible pour la dégradation, libérant les dieux NF-B pour se translocaliser au noyau pour la transcription génique1 et est donc une cible attrayante pour le développement d'inhibiteurs pour moduler l'activité NF-B.

Notre recherche se concentre sur la caractérisation de l'interaction protéine-protéine entre NEMO et IKKMD, ciblant NEMO pour le développement de petites molécules inhibitrices de la formation complexe IKK. Le domaine de liaison minimal de NEMO, requis pour lier IKKMD, englobe les résidus 44-111, et sa structure a été déterminée en complexe avec un peptide correspondant à la séquence IKKMD 701-7459. NEMO et IKKMD forment un faisceau de quatre hélices où le dimère NEMO accueille les deux helices d'IKKMD(701-745) dans une rainure ouverte allongée avec une interface d'interaction étendue. IKK(734-742), également connu sous le nom de domaine neMO-contraignant (NBD), définit le point chaud le plus important pour la liaison, où les deux tryptophanes essentiels (739 741) enterrent profondément dans la poche NEMO. Les détails de la structure complexe peuvent aider à la conception et à l'optimisation de la structure des inhibiteurs de petites molécules ciblant NEMO. Dans le même temps, il est difficile que la liaison d'une petite molécule ou d'un peptide recrée dans NEMO le changement conformationnel complet (c.-à-d., ouverture étendue du dimère enroulé-enroulé NEMO) causé par la liaison du long IKKMD(701-745), comme on l'observe dans le cristal, et la structure de NEMO ou NEMO non lié à un inhibiteur de petite molécule peut représenter une meilleure cible pour la conception et l'inhibition de la conception et de l'inhibition des médicaments basés sur la structure.

La pleine longueur NEMO et les constructions de truncation plus petites englobant le domaine IKK-contraignant se sont avérées insolubles pour la détermination de structure dans la forme non liée par l'intermédiaire de la cristallographie de rayon X et des méthodes de résonance magnétique nucléaire (NMR)10,qui nous a incités à concevoir une version améliorée du domaine IKK-contraignant de NEMO. En effet, NEMO (44-111) sous la forme non liée n'est que partiellement plié et subit un échange conformationnel et nous nous sommes donc mis à stabiliser sa structure dimérique, pli de bobine enroulée et la stabilité, tout en préservant l'affinité de liaison pour IKK. En émettant trois heptades de séquences idéales de bobines sombres11 au n et C-termini de la protéine, et une série de mutations à quatre points, nous avons généré NEMO-EEAA, une construction entièrement dimérique et pliée dans une bobine enroulée, qui a sauvé l'affinité IKK-liaison à la gamme nanomolar comme observé pour la pleine longueur NEMO12. Comme avantage supplémentaire, nous espérions que les adaptateurs enroulés (basés sur la séquence GCN4) faciliteraient la cristallisation et, éventuellement, faciliteraient la détermination de la structure des rayons X par le remplacement moléculaire. Les adaptateurs enroulés ont été utilisés de la même façon pour augmenter la stabilité, améliorer le comportement de la solution et faciliter la cristallisation des bobines et des fragments d'anticorps trimmériques13,14. NEMO-EEAA est facilement exprimé et purifié à partir des cellules Escherichia. coli avec une étiquette cléavable Histidine, est soluble, plié dans une bobine faible stable enroulée et est facilement cristallisé, avec une diffraction à 1,9 . La présence des régions à bobines commandées de GCN4 pourrait en outre aider à l'apaisement des données des cristaux de NEMO-EEAA par remplacement moléculaire en utilisant la structure connue de GCN415.

Compte tenu des résultats obtenus avec apo-NEMO-EEAA, nous croyons que les protocoles décrits ici pourraient également être appliqués à la cristallisation de NEMO-EEAA en présence de petits peptides (comme le peptide NBD) ou d'inhibiteurs de petites molécules, dans le but de comprendre les exigences pour l'inhibition de NEMO et l'optimisation basée sur la structure des inhibiteurs initiaux de plomb à une affinité élevée. Étant donné la plasticité et la nature dynamique de nombreux domaines enroulés16, l'utilisation des adaptateurs enroulés pourrait trouver une applicabilité plus générale pour faciliter la détermination structurelle.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Conception de la construction pour la cristallographie

  1. Clonez la séquence de NEMO-EEAA comme dans la publication précédente12 dans un vecteur d'expression chez E. coli en utilisant le promoteur T7, y compris une étiquette D'hexa-histidine N-terminal e et un site de clivage de protéase.
    REMARQUE : Dans ce protocole, nous avons utilisé un vecteur modifié pour inclure une étiquette d'hexa-histidine N-terminale et un site de clivage du virus du tabac Etch (TEV)10. Ce vecteur facilite le clivage de l'étiquette His pour la cristallisation des protéines et ne laisse que la courte extension des résidus de GSW avant le début de la séquence protéique désirée. Le vecteur à partir duquel cela a été dérivé, et les vecteurs alternatifs sont répertoriés dans le Tableau des matériaux. Dans ce protocole, des modifications ultérieures à la séquence originale de NEMO(44-111) ont été introduites dans le sens des étapes, comme décrit précédemment10, en utilisant la mutagénèse dirigée latéralement. Nous avons d'abord tenté de stabiliser le dimère enroulé-enroulé NEMO en adaptant les adaptateurs à bobines idéales (d'une longueur d'au moins trois heptades) à l'extrémité N-terminal ou C-terminal ou aux deux. La bobine à double enroulage était la plus prometteuse des essais de cristallisation antérieurs et elle a ensuite été modifiée introduisant des mutations pour améliorer la cristallisation comme décrit précédemment12.

2. Expression à grande échelle de ses6 neMO-EEAA marqués

  1. Transformez la construction en cellules compétentes BL21(DE3). Conserver à -80 oC comme stock de glycérol cellulaire.
  2. Jour 1 - Préparer une culture de démarrage cellulaire. Dans un flacon Erlenmeyer de 125 ml, ajouter 20 ml de solution De broth terrible et 20 l d'un stock d'ampicilline de 100 mg/ml. Ajouter quelques microlitres de stock de glycérol cellulaire (à partir de -80 oC de stockage de cellules compétentes BL21(DE3) transformées avec vecteur).
  3. Secouez la culture de démarrage de 10 ml pendant la nuit à 37 oC, 220 tr/min (environ 15 h).
  4. Jour 2 - De l'entrée, diluer à un OD600 - 0,1 dans 250 ml de Broth Terrific. Ajouter l'ampicilline à une concentration finale de 100 g/mL. Atteindre un OD600 0,8-1.0.
    1. Ajouter l'isopropyl -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à 500 M, et faire pousser pendant 4 h à 37 oC.
    2. MesureZ OD600 de la culture induite après 4 h. La culture devrait atteindre un OD600 -6-10.

3. Purification de ses6 neMO-EEAA étiquetés

  1. Faire tourner la culture cellulaire vers le bas à 3 800 x g pendant 20 min à 4 oC.
  2. Enregistrer la pastille cellulaire et jeter le milieu.
    REMARQUE : Le granule de cellules peut être enregistré et stocké à -20 oC à ce stade, pour la purification à un moment ultérieur.
  3. Resuspendre les cellules dans 40 ml de tampon de lyse contenant 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM d'imidazole, 2 mM MgCl2, 0,5 mM de phénylmethylsullsullsulfonyl fluorure, 2 mM Dithiothreitol (DTT), et 3 l de Benzonase Nuclease.
    REMARQUE : La chromatographie d'affinité d'ion métallique immobilisée de nickel (IMAC) utilisée est compatible avec 2 mM DTT. Alternativement, 0.2 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) peut être utilisé.
  4. Diviser les cellules resuspendues en deux aliquots de 20-25 ml.
  5. Lyser les cellules à l'aide d'Français presse (pression approximative de 25 000 psi), répétant 2-3 fois pour chaque aliquot (dans la chambre froide).
    REMARQUE : Alternativement, les cellules pourraient être lysées par sonication (non testées dans ce protocole).
  6. Ajouter l'urée au lysate cellulaire à une concentration finale de 8 M, laisser incuber sur une plate-forme à bascule pendant un minimum de 2 h ou jusqu'à la nuit. Ceci et toutes les étapes de purification suivantes, à l'exception de la dialyse, peuvent être effectués à température ambiante.
  7. Jour 3 - Transférer le lysate aux tubes d'ultracentrifuge et équilibrer le poids, en veillant à ce que le lysate remplisse les tubes à au moins 3/4 plein. Faire tourner le lysate à 125 000 x g pendant 45 min à 25 oC. Décant le supernatant dans un bécher de 100 ml pour le chargement sur la colonne.
    REMARQUE : Le centrifuage à 4 oC entraînera l'écrasement de l'urée.
  8. Sur un système de chromatographie liquide rapide, retirer l'éthanol de la colonne IMAC 5 ml avec 25 ml d'ultrapure H2O à 5 ml/min, suivi de 25 ml de tampon d'élution contenant 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 500 mM imidazole, 2 mM DTT, pH 8,0, puis 25 mL de tampon de liaison contenant 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazole, 2 mM DTT, 8 M urea, pH 8,0.
  9. Chargez le supernatant incubé d'urée à 3 ml/min sur la colonne IMAC, recueillant le flux à travers. Laver la colonne pendant 10 volumes de colonnes avec un tampon de liaison à 3 ml/min.
  10. Repliez la construction NEMO-EEAA sur la colonne en lavant la colonne avec tampon de repliement pour 20 volumes de colonne à 3 ml/min, contenant 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazole, 2 mM DTT, pH 8.0.
  11. Effectuer l'élution de gradient de NEMO-EEAA, de 10 à 500 mM Imidazole sur un gradient de volume de 12 colonnes, recueillant tous les éluates dans une plaque de collecte de fractions (1 mL fractions).
  12. Continuer l'élution à 500 mM imidazole pendant deux volumes de colonnes, en continuant à recueillir.
  13. Exécuter le sulfate de dodecyl de sodium (SDS)- électrophoresis de gel de polyacrylamide (PAGE) des fractions pour déterminer la présence de NEMO- EEAA dans les fractions d'élution.
    REMARQUE: Nous avons utilisé 10% d'acrylamide, tampon MES.
  14. Poulez les fractions contenant des protéines cibles pures.
  15. Mesurer la concentration en protéines par Bradford assay17.
    REMARQUE: Ceci est nécessaire pour estimer la quantité de protéase pour le clivage tag.

4.Son clivage 6 étiquette et la purification

  1. Ajouter TEV dans un rapport de poids 1:10 de la protéine TEV:NEMO-EEAA pour cender l'étiquette Deson 6. La protéase TEV a été purifiée dans la maison.
    REMARQUE : Optimiser la quantité de TEV, le temps et la température nécessaires pour le clivage complet séparément.
    1. Express TEV protéase, S219V mutant18 en BL21(DE3)-RIL cellules et purifier comme décrit plus tôt19. Cultivez brièvement les cellules telles que décrites à l'étape 2, lyser par Français presse et purifier à l'aide d'une colonne IMAC. Conservez la protéine finale dans un tampon de phosphate de sodium de 25 mM, pH 7,8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM DTT, 20 % v/v glycérol.
  2. Dialyser l'échantillon pendant la nuit (environ 15 h) dans 4 L de 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 8,0, pour permettre le clivage et pour enlever l'excès d'imidazole de l'échantillon pour la purification ultérieure.
  3. Jour 4 - Retirez l'échantillon de la dialyse. Exécuter un gel SDS-PAGE de l'échantillon de clivage TEV pour s'assurer que le clivage est terminé.
  4. Sur un système de chromatographie liquide rapide, retirer l'éthanol d'une colonne IMAC de 5 ml avec 25 ml d'ultrapure H2O à 5 ml/min, suivi de 25 ml de tampon d'élution contenant 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 500 mM imidazole, 2 mM DTT, pH 8,0, puis tampon de liaison contenant 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazole, 2 mM DTT, pH 8,0.
  5. Chargez la colonne à 1 ml/min avec NEMO-EEAA clivé Par TEV. NeMO-EEAA clivé s'élinira dans le flux : recueillir dans une plaque de collecte de 96 fractions de puits (1 mL de fractions). Laver la colonne pour cinq volumes de colonne s'élève à 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM d'imidazole à 1 ml/min, en continuant à s'accumuler en plaque de collecte de fractions.
  6. Elute TEV et détrôné son6-NEMO-EEAA avec trois volumes de colonnede de 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 500 mM imidazole, 2 mM DTT, pH 8.0, collecte d'élution dans un flacon de 50 ml.
  7. Exécutez le gel SDS-PAGE des fractions d'écoulement pour déterminer la présence de NEMO-EEAA clivé.
  8. Fractions d'écoulement de piscine contenant la construction de NEMO-EEAA clivée, et concentrez-vous à l'aide d'un concentrateur à cellules agitées à 5 ml. Coupure de poids moléculaire membranaire (MWCO) à 3 kDa.
  9. À l'aide d'une membrane MWCO de 3 kDa, dialysez l'échantillon concentré dans 2 L de 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 8,0 pour 2 h. Changer le tampon de dialyse à 2 L de tampon de dialyse fraîche pour la dialyse de nuit (environ 15 h), à 4 oC.
  10. Jour 5 - Chargez 5 ml de l'échantillon dialysé sur une chromatographie d'exclusion de taille (SEC) colonne de 16 mm x 60 cm (34 m de taille moyenne des particules) à 1 ml/min en 2 mm Tris, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 8,0. Répéter l'opération avec des colonnes supplémentaires en fonction du volume de l'échantillon.
  11. Mettre en commun les fractions correspondant à la NEMO-EEAA.
    REMARQUE : NEMO-EEAA élude entre 60-65 ml, correspondant à une protéine de poids moléculaire plus grande, due à la nature allongée de la bobine enroulée dimérique.
  12. Concentrez-vous à l'aide d'un concentrateur à cellules remuées et d'une membrane MWCO de 3 kDa jusqu'à une concentration finale de 113 M (1,65 mg/mL).
  13. Aliquot la protéine et stocker à 4 oC (stable pendant plus d'un mois).

5. Dépistage de la matrice sparse

REMARQUE : Le protocole effectue des essais de cristallisation à l'aide d'écrans disponibles dans le commerce et met en place des expériences de chute assise à l'aide d'un robot de cristallisation. Les images en cristal sont collectées automatiquement par un imageur.

  1. À l'aide d'écrans à matrice clairsemée disponibles dans le commerce (voir Tableau des matériaux),pipette 60 'L de solution de matrice clairsemée dans chacun des 96 puits d'une plaque de cristallisation à 2 chambres à goutte pour la diffusion de vapeur de chute assise (solution de réservoir).
  2. À l'aide d'un poseur de gouttes robotisé, distribuez 100 nL de solution protéique à 1,65 mg/mL dans un rapport de 1:1 avec une solution de réservoir en goutte 1 pour un volume final de 200 nL; puis 66 nL de solution protéique avec 134 nL de solution réservoir pour un volume final de 200 nL en goutte 2 (1:2 ratio).
  3. Scellez la plaque à l'aide d'un ruban adhésif de 3 pouces de large immédiatement après la distribution.
    REMARQUE : Les gouttes se dessèchent si elles sont laissées exposées à l'atmosphère pendant plus de 2-3 min.
  4. Entreposez les plateaux dans le stockage de l'imageur de cristallisation, à 20 oC, en vérifiant les images collectées automatiquement pour la présence de cristaux, à partir de deux jours.
    REMARQUE : Le criblage de cristallisation s'est déroulé parallèlement à l'optimisation de la construction. Cristaux initiaux formés dans les conditions suivantes (écrans commerciaux énumérés dans le tableau des matériaux):a) 0,1 M Tris, pH 8,0, 30 % v/v polyethylene glycol (PEG) MME 550, 5% poly--glutamique acide, 200-400 kDa polymère de faible poids moléculaire (PGA -LM); b) 0,1 M Tris, pH 7,8, 20% w/v PEG MME 2k, 5% PGA-LM; c) 0,1 M Tris, pH 7,8, 20% w/v PEG 3350, 5% PGA-LM. Les cristaux d'écran de matrice clairsemée auront l'uniformité pauvre de treillis ; par conséquent, ils auront l'air pauvres en utilisant l'imagerie transpolarisée. Utilisez l'imagerie UV pour s'assurer que les cristaux contiennent des protéines. L'étape suivante de production de stock de semences est nécessaire pour obtenir les cristaux de qualité de diffraction finale.

6. Production de stocks de semences

REMARQUE: Nous obtenons reproductiblement des cristaux pour la production de graines dans 0.1 M Tris pH 8.0, 5% PGA-LM, 3.6% w/v PEG 20k. Cependant, les cristaux montreront la mosaïque élevée et ne sont pas appropriés pour la collecte de données à ce stade.

  1. À l'aide d'un kit pour la production de graines, préparer le stock de graines en chaperonnant la goutte entière avec du cristal présent, et placer dans la solution de condition de cristallisation de 50 L dans le flacon fourni.
  2. Vortex le bouillon de graines pendant 3 min, pulsant 20 s sur et 10 s off.
  3. Diluer en série le stock de semences par incréments de 1:10 jusqu'à 1:10,000. Conserver toutes les dilutions à 4 oC, pour une utilisation plus poussée.

7. Écrans fins

  1. Concevez des écrans fins variant les conditions pour Tris, PGA-LM et PEG. Variez la longueur DE PEG pour les plateaux individuels.
    REMARQUE : L'écran fin qui a produit le cristal utilisé pour la détermination de structure de NEMO-EEAA a employé les conditions suivantes : 0.1 M Tris pH 8 ; PGA-LM variait de 8 à 0% dans les colonnes 1-12. Les lignes A-H ont examiné différents PEG, avec des concentrations variant dans les colonnes 1-12 comme suit. A: PEG 200 (0-40% v/v); B: PEG 400 (0-40% v/v); dm: PEG MME 500 (0-40% v/v); D: PEG 1000 (0-30% w/v); E: PEG 3350 (0-30% w/v); F: PEG 6k (0-30% w/v); G: PEG 10k (0-20% w/v); H: PEG 20k (0-20% w/v). Le cristal est apparu dans bien H4 (5,45% w/ v PEG 20k, 5.8% w/v PGA-LM). Dans ce protocole, un gestionnaire liquide de constructeur d'écran de cristallographie de protéine a été employé pour construire les écrans.
  2. Ensemencer un stock de protéines dans un rapport de volume de 1:25 de 1:1 000 dilution des graines.
    REMARQUE : La concentration de NEMO-EEAA diminuera légèrement, mais les cristaux se formeront toujours.
  3. Répétez l'étape 2 en utilisant 1:10,000 dilution des graines, même rapport de volume de 1:25.
  4. À l'aide du poseur de gouttes, distribuez 100 nL de solution protéique à 1,65 mg/mL, avec 1:1 000 dilution du stock de graines dans un rapport 1:1 avec la solution de réservoir en goutte 1 pour un volume final de 200 nL. Répétez pour la baisse 2, mais avec 1:10,000 dilution du stock de graines présents.
  5. Scellez la plaque à l'aide d'un ruban adhésif de 3 pouces de large immédiatement après la distribution.
    REMARQUE : Les gouttes se dessèchent si elles sont laissées exposées à l'atmosphère pendant plus de 2-3 min.
  6. Entreposez les plateaux dans le rangement de l'imageur, à 20 oC, en vérifiant les images recueillies au bout de deux jours pour vérifier la présence de cristaux.
  7. Vérifiez les cristaux avec l'imageur de multi-polariseur pour l'uniformité de treillis, pour sélectionner pour des conditions simples pour installer les plateaux suivants.

8. Génération de cristaux pour la collecte de données

  1. Concevoir des écrans à condition unique autour de Tris, PGA-LM, et peg condition qui a produit des cristaux uniformes analysés par des images trans-polarisées, et les plus grands cristaux possibles.
    REMARQUE : Les cristaux de ces conditions sont de forme irrégulière, la plupart du temps des feuilles minces rectangulaires. Il est essentiel de choisir une condition où les bords du cristal sont bien définis et ont la plus grande épaisseur possible.
  2. Faire 20 ml de cristallisation condition à la main.
  3. À l'aide d'un pipettor multicanal, distribuez 60 L par puits dans une plaque de cristallisation de 2 chambres à goutte, 96 puits pour la diffusion de vapeur de chute assise.
  4. Préparer le stock de semences tel que décrit à l'étape 6.2.
  5. Distribuez la protéine telle que décrite à l'étape 6.3.
  6. Scellez la plaque à l'aide d'un ruban adhésif de 3 pouces de large immédiatement après la distribution.
    REMARQUE : Les gouttes se dessèchent si elles sont laissées exposées à l'atmosphère pendant plus de 2-3 min.
  7. Entreposez les plateaux dans l'imageur à 20 oC et vérifiez la présence de cristaux chaque jour.
  8. Vérifiez les images interpolarisées des cristaux pour l'uniformité du treillis, pour sélectionner les cristaux pour la collecte de données.

9. Détermination du cryo-protecteur

  1. Pour tester les cryo-protecteurs, créez des solutions de stock correspondant aux conditions de cristallisation mais contenant 30%, 20%, 10% et 5% de concentration plus élevée de chaque composant. L'ajout du volume cryo-protecteur se traduira par une concentration finale de composants qui est la même que les conditions de cristallisation.
    REMARQUE : Pour tester un cryo-protecteur à une concentration de 30 % en volume pour une condition de cristallisation Tris de 0,1 M, commencez par une solution de stock de 0,143 M Tris, avant d'ajouter le cryo-protecteur.
  2. À partir d'un kit cryo-réactif, créez 10 l d'échantillon pour l'essai cryo-protecteur en mélangeant 30 % par volume de cryocondition dans 70 % de la solution de stock d'état de cristallisation, pour une concentration finale de 30 % de cryo-protecteur dans des conditions de cristallisation d'origine. Mélanger.
    1. À l'aide d'une pipette de 10 l, prendre 5 l de solution cryo-protégée d'essai et plonger la pointe de la tuyauterie dans l'azote liquide. Si de la glace est observée, jetez-le.
    2. Testez tous les cryo-protecteurs à 30%. Pour les solutions réussies, répétez le processus à 20%, puis 10% et 5% de cryo-protecteur.
    3. En utilisant la solution cryo-protectrice réussie avec le plus petit pourcentage de cryo-protectant, ajouter 0,5 L de solution dans une goutte d'essai avec des cristaux présents. Observez sous le microscope, en chronométrant combien de temps le cristal dure dans l'état, sinon indéfini.
      REMARQUE: Ces cristaux sont pour l'essai seulement et seront jetés. Pour NEMO-EEAA, 12 % 1,2-propanediol est la solution cryo-protectrice optimale. 12 % explique la dilution que la solution cryo-protectrice connaîtra lorsqu'elle sera ajoutée à la goutte de cristal d'environ 100 nL, pour une concentration finale approximative de 1,2 propanediol de 10 %.

10. Boucle de cristal

  1. Cristaux de boucle 1-2 jours avant l'expédition au synchrotron.
    REMARQUE : Les cristaux auront un diamètre d'environ 60 à 100 m : les boucles de 0,05 à 0,10 mm sont idéales pour boucler.
  2. Couper la bande du haut du puits.
  3. Ajouter 0,5 L de solution de cristallisation contenant 12 % de cryo-protecteur de 1,2 propanediol directement au puits.
    REMARQUE : La concentration finale de 1,2 propanediol est maintenant d'environ 10 %, en raison de la dilution par 100 nL de solution de chute (réduction approximative du volume de chute par rapport à 200 nL initiales, en raison de la diffusion de vapeur).
  4. Bouclez le cristal du puits.
    REMARQUE : Les cristaux poussent souvent sur le fond du puits, mais se délogeront d'un léger coup de pouce de la boucle. Une fois délogé, boucle.
  5. Conservez le cristal contenant des cryo-boucles dans des rondelles immergées dans le liquide N2.
  6. Conservez ces rondelles dans le liquide N2 dans le flacon Dewar jusqu'à ce qu'elles soient prêtes à être expédiées pour la diffraction des rayons X au synchrotron.

11. Collecte de données

  1. Recueillir des données de diffraction des rayons X. Dans ce protocole, utilisez LA ligne de faisceau AMX (ID: 17-ID-1), National Synchrotron Light Source II.
    REMARQUE : Les données ont été recueillies sur place, mais peuvent être recueillies à distance. Recueillir des données dans la région du cristal qui a montré l'uniformité du treillis dans les images polarisées croisées. Placez les cristaux dans la boucle de sorte que la collecte de données n'implique pas les régions « pauvres » du cristal pendant que le cristal tourne dans le goniomètre. Les données qui ont fourni la meilleure résolution provenaient de la collecte sur le bord d'une extension d'un cristal d'environ 5 x 5 m de taille. Utilisez le rastering pour identifier les meilleures zones sur le cristal pour recueillir20.

12. Traitement des données radiographiques

  1. Traiter l'ensemble de données à la plus haute résolution collectée (1,8 ' ) avec le programme XDS IDXREF pour déterminer le groupe spatial, les cellules unitaires et la teneur en solvants.
  2. Intégrez les données à l'aide du programme XDS INTEGRATE.
  3. Intensités de processus mises à l'échelle du programme XDS XSCALE à l'aide du serveur STARANISO, en utilisant la moyenne de coupure I/I de 1,2 pour la surface de limite de diffraction pour les données.
    REMARQUE : Les données ne seront pas coupées dans de vrais ellipsoïdes. Conservez toutes les données au-dessus de la limite I/I de 1,2. Les statistiques sur les données calculées pour l'exhaustivité sphérique seront médiocres, en raison de la troncation non sphérique. L'exhaustivité elliptique était de 88 % avec des résolutions les plus élevées de : 1,88 , 2,10 et 2,55 euros le long de l'axe a, b et c, respectivement.

13. Solution de structure

  1. Utiliser la structure de rayons X de GCN4 (PDB: 4DMD)15 comme un modèle de recherche pour le remplacement moléculaire en utilisant MRage21 dans PHENIX22. La structure 4DMD a été définie dans MRage comme un « ensemble », et la solution MRage a réussi à construire la partie de la structure correspondant à l'adaptateur à bobine souillée N-terminal eilde de NEMO-EEAA, homologue du modèle de recherche, pour les deux chaînes dans le dimère.
    REMARQUE : Désactiver la correction d'anisotropie dans PHASER, ou les données seront encore réduits.
  2. Utiliser des tours successifs d'Autobuild23 dans PHENIX et la construction manuelle (en utilisant 2Fo-Fc et Fo-Fc cartes, dans Coot24) pour construire le reste de la structure.
  3. Construire manuellement les résidus manquants encore dans le modèle basé sur 2Fo-Fc et Fo-Fc cartes, en utilisant Coot24.
    REMARQUE : La dernière étape consistait à construire les 4 résidus N-terminaux et les 4 résidus de terminal C pour chaque monomère. Le placement de la chaîne latérale a également été ajusté manuellement au besoin.
  4. Calculer une carte d'omission composite à l'aide de PHENIX et d'une omission de 10 % de la structure.

14. Raffinement de la structure

  1. Affiner les structures avec PHENIX Refine. Exécutez les améliorations initiales contre les poids solvants en vrac et les poids stéréochimiques, en assouplissant les contraintes RMSbond et RMSangle à 0,01 et 1,0, respectivement. Continuer le raffinement sur les facteurs B individuels, les paramètres TLS et les occupations.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Clonage, expression et purification du domaine iKK-contraignant de NEMO.
Le protocole a suivi dans cette étude pour obtenir la séquence finale de NEMO-EEAA (Figure 1A), qui a produit des cristaux de qualité de diffraction, a impliqué l'expression et la caractérisation de toutes les constructions intermédiaires, y compris l'ajout des adaptateurs enroulés-enroulés à N- et ou C-terminus, les mutations C76A, C95S et les mutations E56A, E57A.

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les tentatives de cristallisation de NEMO sous la forme non liée ont échoué, y compris des tentatives utilisant la protéine pleine longueur et plusieurs constructions de truncation englobant le domaine iKK-contraignant. Notre caractérisation biophysique du domaine iKK-contraignant de NEMO (résidus 44-111) par dichroisme circulaire, spectroscopie RmN et anisotropy de fluorescence a indiqué que la construction, bien que capable de lier IKK, existait dans un état d'échange conformationnel, ne convient pas à la cristallisati...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions le professeur D. Madden pour les nombreuses discussions utiles qui ont eu lieu tout au long de ce projet. Nous remercions le professeur D. Bolon pour le don du plasmide contenant la bobine optimisée GCN4 enroulée. Nous remercions le Dr B. Guo pour les plasmides NEMO. Nous remercions Christina R. Arnoldy, Tamar Basiashvili et Amy E. Kennedy d'avoir démontré la procédure. Nous remercions l'installation de base de cristallographie BioMT et les départements de chimie et de biochimie et de biologie cellulaire de Dartmouth pour l'utilisation de l'équipement de cristallographie et du personnel de BioMT pour leur soutien. Cette recherche a utilisé la ligne de faisceau AMX du National Synchrotron Light Source II, un Office of Science User Facility du département de l'Énergie des États-Unis exploité pour le DOE Office of Science par le Brookhaven National Laboratory en vertu du contrat no. DE-SC0012704. Nous remercions le personnel de NSLS II pour son soutien. Ces travaux ont été financés par les subventions des NIH R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 et P20GM113132, ainsi qu'une subvention Munck-Pfefferkorn Novel and Interactive.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
20 % p/v &gamma ;-PGA (forme Na+, LM)Dimensions moléculairesMD2-100-150Pour la cristallisation à tamis fin de NEMO-EEAA
3,5 kDa MWCO Dialysis MembraneSpectra/Por132724Pour l’élimination par dialyse de l’imidazole
Amicon Stirred CellMillipose SigmaUFSC 05001Pour la concentration en protéines
Chlorure d’ammoniumMillipore SigmaG8270Pour un marquage minimal dans un milieu
Benzonase NucléaseMillipore Sigma9025-65-4Pour la digestion de l’acide nucléique
BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Cellules compétentesAgilent TechnologiesModèle : 230245expression de TEV
CryoProHampton ResearchHR2-073Kit de cryo-protecteurs
D-Glucose (Dextrose)Millipore SigmaA9434Pour Marquage minimal des milieux
Difco Terrific BrothThermoFisherDF043817Pour la croissance des cultures
Dithiothreitol > 99 %GoldbioDTT25Pour la réduction des disulfures
E. coli : Rosetta 2 (DE3)Novagen71400-3Expression du NEMO-EEAA
FORMULATORFormulatrixManipulateur de liquides/constructeur de tamis
HCl & ndash ; 1,0 M SolutionHampton ResearchHR2-581Pour la cristallisation à tamis fin de NEMO-EEAA
HiLoad 16/600 Superdex 75 pgGE Healthcare28989333Pour la purification par exclusion stérique
HisTrap HP 5 mL colonneGE Healthcare17524802Pour la purification de NEMO-EEAA
HT 96 MIDASDimensions moléculairesMD1-59Pour le criblage à matrice creuse de NEMO-EEAA
HT 96 Dimensions moléculaires morphiquesMD1-46Pour le criblage matriciel clairsemé de NEMO-EEAA
ImidazoleThermoFisher288-32-4Pour élution à partir de la colonne His-trap
Isopropyl-beta-D-thiogalactosideGoldbioI2481C5Pour l’induction de cultures
Plaque de cristallisation MRC2Hampton ResearchHR3-083Plaque de cristallisation
NT8 - DropSetter FormulatrixCristallisation
pET-16bMillipore Sigma69662Pour le clonage de NEMO-EEAA
pET-45bMillipore Sigma71327Pour le clonage de NEMO-EEAA
Fluorure de phénylméthylsulfonyleThermoFisher36978Pour l’inhibition des protéases
Flacon en polycarbonate pour utilisation dans le rotor d’ultracentrifugeuse Type 45 TiBeckmann Coulter339160Bouteille d’ultracentrifugeuse
Polyéthylène glycol 20 000Hampton ResearchHR2-609Pour la cristallisation à tamis fin de NEMO-EEAA
pRK793 (TEV)AddgenePlasmid 8827Pour la production de TEV
QuikChange XL IIAgilent Technologies200522Mutagénèse dirigée par site
Assemblage du capuchon requis :Beckmann Coulter355623Ultracenttrifuge
ROCK IMAGERFormulatrixCrystallization Imager
Seed Bead KitHampton ResearchHR2-320Génération de graines
Chlorure de sodium &ge ; 99 %Millipore SigmaS9888Pour le tamponnage des solutions de purification
TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride)GoldbioTCEP1Agent réducteur
The Berkeley ScreenRigakuMD15-BerekelyPour le criblage à matrice clairsemée de NEMO-EEAA
The PGA ScreenDimensions moléculairesMD1-50Pour la cristallisation à tamis fin de NEMO-EEAA
Tris &ndash ; 1.0 M SolutionHampton ResearchHR2-589Pour la cristallisation à tamis fin de NEMO-EEAA
Ultrapure Tris Buffer (poudre format)Thermofisher15504020Pour le tamponnage des solutions d’épuration
Urea ThermoFisher29700Pour la dénaturation de NEMO-EEAA
bouchon de bouteille

References

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