Nous fournissons un protocole pour l'isolement des microglies de différentes régions disséquées d'un hémisphère de cerveau de souris adulte, suivi de la préparation semi-automatisée de bibliothèque pour le séquençage profond d'ARN unicellulaire des transcriptomes pleine longueur. Cette méthode aidera à élucider l'hétérogénéité fonctionnelle des microglies dans la santé et la maladie.
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Article de méthode
Isolement des microglies spécifiques à la région de l'hémisphère cérébral d'une souris adulte pour le séquençage profond de l'ARN à une seule cellule
Dans cet article
Résumé
Résumé
Comme macrophages résidents dans le système nerveux central, microglies contrôlent activement le développement du cerveau et l'homéostasie, et leurs dysfonctionnements peuvent conduire les maladies humaines. Des progrès considérables ont été réalisés pour découvrir les signatures moléculaires des microglies homéostatiques ainsi que des altérations de leur expression génique en réponse à des stimuli environnementaux. Avec l'avènement et la maturation des méthodologies génomiques unicellulaires, il est de plus en plus reconnu que les microglies hétérogènes peuvent sous-tendre les divers rôles qu'elles jouent dans différentes conditions développementales et pathologiques. Une dissection plus poussée d'une telle hétérogénéité peut être obtenue par un isolement efficace des microglies d'une région d'intérêt donnée, suivie d'un profilage sensible des cellules individuelles. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l'isolement rapide des microglies de différentes régions du cerveau dans un seul hémisphère de cerveau de souris adulte. Nous démontrons également comment utiliser ces microglies triées pour le séquençage profond d'ARN à cellule profonde à base de plaque. Nous discutons de l'adaptabilité de cette méthode à d'autres scénarios et fournissons des lignes directrices pour améliorer le système afin de tenir compte des études à grande échelle.
Introduction
Les microglies, qui représentent 5 % à 10 % de toutes les cellules neurales, sont des macrophages résidents dispersés dans tout le système nerveux central (SNC)1. Protégées derrière la barrière hémato-encéphalique, les microglies typiques d'un cerveau adulte en bonne santé contiennent de nombreux processus fins qui s'étendent rapidement et se rétractent pour interagir avec les neurones et autres cellules gliales du parenchyme. Microglia peut également adopter la morphologie amoeboid associée à une fonction phagocytique accrue au cours de stades de développement spécifiques ou sur les défis immunitaires dans les blessures et la maladie1,2,3,4. De récentes découvertes passionnantes ont clairement démontré que les microglies ne sont en aucun cas des spectateurs passifs aux signaux dérivés du cerveau ou pathologiques, mais jouent un rôle central dans le contrôle du développement du cerveau et de l'homéostasie, par exemple, en soutenant la survie neuronale, en élagant des synapses immatures, en favorisant la différenciation des cellules de lignée d'oligodendrocytes ainsi qu'en angiogenèse1. Comme plus de fonctions de microglies sont élucidés, l'excitation est encore alimentée par des études de génétique humaine, qui ont montré que de nombreux gènes de risque de maladie neurodégénérative, tels que TREM2, sont principalement ou exclusivement exprimés par microglies5,6,7. Compte tenu de leur importance dans le développement et des rôles plausibles de la maladie-moteur, des efforts énormes ont été récemment mis en vue de notre compréhension de la régulation et de la fonction des gènes microglials dans l'espoir de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour les maladies neurodégénératives1,8.
Le séquençage de l'ARN (ARN-seq) permet une caractérisation impartiale de l'expression génétique spécifique au type cellulaire, qui guide à son tour les scientifiques pour étudier les fonctions génétiques dans les réseaux cellulaires denses7. L'ARN-seq avait été principalement fait sur des échantillons en vrac, menant à la découverte d'une signature de gène microglial homéostatique qui les distingue des autres cellules neurales et immunitaires9. Cependant, une telle approche pourrait négliger les différences moléculaires et fonctionnelles entre les microglies, en particulier celles qui sont présentes de façon transitoire dans le développement, ou associées au vieillissement et à la maladie. En effet, l'ARN-seq unicellulaire (scRNA-seq) offre la sensibilité et la résolution qui ont révolutionné le domaine en révélant l'hétérogénéité précédemment sous-estimée des microglies dans une variété de contextes2,3,10. En outre, en raison de la présence d'autres cellules immunitaires similaires à l'interface de circulation du SNS, scRNA-seq fournit des informations aidant à la conception de nouveaux outils pour séparer et disséquer fonctionnellement ces cellules connexes avec peu de connaissances préalables2,11.
Une gamme variée de plates-formes scRNA-seq ont été inventées, chacune adaptée à certaines applications12. En général, les méthodes à base de gouttelettes, telles que la génomique 10x, sont plus élevées dans le débit avec (des dizaines de) milliers de cellules séquencées dans chaque course, et ils sont moins sélectifs pour l'entrée qui peut contenir des populations de cellules mixtes nécessitant une catégorisation large. Les méthodes basées sur les plaques fournissent une sensibilité plus élevée et lisent la profondeur13,14, ciblant habituellement des populations spécifiques du tri cellulaire pour révéler des différences subtiles ou des transcriptions rares. Étant donné le faible pourcentage de cellules microgliales, en particulier celles qui sont associées au développement ou à la maladie, parmi tous les types de cellules du SNC, il est souvent souhaitable d'isoler les microglies d'une région d'intérêt spécifique et d'obtenir des informations transcriptomiques profondes et complètes afin de comprendre leur hétérogénéité.
Ici, nous fournissons des détails sur la façon d'isoler les microglies de différentes régions du cerveau de souris disséqués à partir d'un seul hémisphère, qui sont utilisés pour une seule cellule (ou en vrac) ARN-seq suivant une procédure semi-automatisée de préparation de bibliothèque à base de plaques. L'autre hémisphère peut alors être utilisé pour la validation histologique. Simplifié à partir d'une méthode9déjà publiée, ce protocole d'isolement vise à maximiser le rendement à partir d'une petite quantité de matériaux de départ, et en attendant maintenir des profils d'expression microgliale endogène. Nous utilisons le tri des cellules activées par la fluorescence (FACS) pour enrichir les microglies (ou d'autres cellules immunitaires connexes d'intérêt) en plaques de 96 puits et miniaturiser les volumes de réactifs pour la préparation de la bibliothèque afin d'augmenter le débit. Nous mettons en évidence cette plate-forme sensible scRNA-seq, bien que d'autres stratégies basées sur les plaques puissent être appliquées. Cette méthode peut être facilement adaptée pour isoler les microglies d'autres tissus disséqués, tels que les blessures ou les foyers de la maladie, et l'âge de la souris peut varier selon presque tous les stades postnatals. L'isolement efficace des microglies régionales pour les études de transcriptomique unicellulaire facilitera une meilleure compréhension de leurs fonctions en santé et en maladie.
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Protocole
Toutes les procédures impliquant des rongeurs étaient conformes aux directives de l'Université Stanford, qui sont conformes aux lois et aux politiques nationales et étatiques. Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par le Comité administratif sur les soins aux animaux de laboratoire de l'Université Stanford.
REMARQUE: Toutes les compositions de solution et de mémoire tampon sont fournies dans tableau des matériaux.
1. Préparation le jour de l'isolement cellulaire
- Préparer les réactifs suivants et les refroidir sur la glace : moyen A (50 mL), tampon de tri cellulaire à activation magnétique (MCS) (30 mL), tampon FACS (25 mL), saline tamponnée en phosphate (PBS; 30 mL), DNase (320 l) et inhibiteur de la RNase (30 l).
REMARQUE: Les volumes fournis ici sont suffisants pour isoler les microglies de 4 régions du cerveau (par exemple, cortex, cervelet, hippocampe et striatum) d'un seul hémisphère cérébral de souris. Échelle si plus de tissus sont utilisés. - Placer quatre homogénéisateurs d'once propre de 2 ml sur la glace et ajouter 2 ml de Moyen A avec 80 l de DNase (12 500 unités/mL) et 5 l d'inhibiteur de la RNase dans chaque homogénéisateur Dounce. Refroidir les pistons dans des tubes de 15 ml.
- Étiqueter quatre plats Petri de 6 cm avec des régions cérébrales pour la collecte des tissus et ajouter 200 l de moyen froid A dans chaque plat sur glace. Ajouter environ 5 ml de Moyen A dans un plat Petri de 6 cm pour la dissection.
REMARQUE: Avant d'être utilisé, assurez-vous que tous les réactifs sont stériles et adaptés aux applications d'ARN. Les outils de banc et de dissection doivent être nettoyés et pulvérisés avec la solution de décontamination de RNase (Tableau des matériaux).
2. Dissection de région de cerveau
REMARQUE: Cette étape devrait prendre 30 min.
- Injecter 400 à 500 l de kétamine/xylazine (24 mg/mL de kétamine et 2,4 mg/mL de xylazine) dans le péritoine d'une souris de stade juvénile à adulte (1 mois).
REMARQUE: Une souris mâle est utilisée ici pour l'illustration, mais l'un ou l'autre sexe est approprié. - Attendez 5 min et pincez une patte postérieure pour assurer le manque de rétraction.
- Utilisez immédiatement une aiguille de 26 G x 3/8 pour effectuer la perfusion transcardique avec 20 à 30 ml de PBS glacé jusqu'à ce que le tampon s'épuise sans sang visible.
- Décapiter la souris avec une paire de ciseaux chirurgicaux. Utilisez de petits ciseaux pour ouvrir la peau pour exposer le crâne sous-le-champ, puis coupez à travers la suture sagittale, la suture lambdoidal et la suture coronale. Utilisez des forceps pour retirer les deux côtés de l'os pariétal et de l'os interpariétal sans endommager le tissu, et déplacez soigneusement le cerveau dans le plat Petri de dissection avec A moyen.
- Utilisez une lame pré-réfrigérée pour couper le cerveau à travers la ligne médiane en deux hémisphères.
REMARQUE: Les quatre régions de cerveau décrites ici d'un seul hémisphère produisent des nombres suffisants de microglies pour des applications d'ARN-seq unicellulaires ou en vrac. L'autre hémisphère peut être utilisé pour l'immunohistochimie ou la validation in situ de l'ARN. - Séparez le cervelet du lobe cortical et du tronc cérébral avec #55 forceps et transférez le tissu dans un plat Petri de collection.
- Utilisez #55 forceps pour disséquer soigneusement l'hippocampe et le striatum du cortex et transférer chaque tissu dans un plat Petri collection.
3. Dissociation des tissus mécaniques
REMARQUE: Gardez les cellules et les réactifs au frais tout le temps, sauf pendant les étapes de coloration. Cette étape devrait prendre 30 min.
- Hacher chaque tissu cérébral à l'arme de rasoir en morceaux fins de3 mm.
- Utilisez une pipette de 1 ml (avec des pointes coupées) pour transférer des morceaux de tissu dans les homogénéisateurs Dounce préréfrigérés, contenant chacun 2 ml de Moyenne A avec inhibiteur de la DNase et de la NAse.
- Homogériser le tissu en tordant lentement le piston dans et hors de l'homogénéisateur Dounce pendant 6 à 10 coups complets, jusqu'à ce qu'aucun morceau visible ne soit présent.
REMARQUE: Douncing tue les neurones et la plupart des autres cellules gliales, mais laisser les cellules microgliales plutôt intactes. L'insuffisance et le sur-douncing peuvent mener au faible rendement des cellules. - Transférer les tissus dissociés dans des tubes de 50 ml à travers des passoires de 70 m.
- Rincer chaque homogénéisateur Dounce et piston avec un total de 6 ml de milieu a froid et filtrer la solution de rinçant e à travers la même passoire dans le tube correspondant.
- Transférer les suspensions à une seule cellule (environ 8 ml chacune) dans des tubes coniques de 15 ml et une centrifugeuse à 400 x g pendant 5 min à 4 oC avec frein 5.
4. Enlèvement de myéline
REMARQUE: Cette étape devrait prendre 60 min.
- Préparer 1 grande colonne d'épuisement (LD) (pour le cortex) et 3 colonnes de grande sélection (LS) (pour les 3 autres régions) dans un séparateur magnétique (Tableau des matériaux). Rincer chaque colonne avec 3 ml de tampon MCS.
- Une fois la centrifugation terminée, sortir la pipette et jeter le supernatant sans déranger la pastille. Pour les tissus du cortex et du cervelet, resuspendre les cellules dans 850 l'amorti MCS avec 1,8 l d'inhibiteur de la RNase. Pour les tissus de l'hippocampe et du striatum, resuspendre les cellules dans 400 l'amorti MCS avec 0,9 l d'inhibiteur de la RNase.
REMARQUE: Les colonnes (LD vs LS) et le volume utilisé pour la resuspension sont optimisés en fonction de la quantité de myéline présente dans le tissu. Si d'autres régions du cerveau sont astoyées, ces conditions peuvent devoir être ajustées en fonction de la taille du tissu et de la quantité de myéline qui peut exister. L'efficacité de l'élimination de la myéline peut être estimée à l'étape 4.9. - Ajoutez 100 l de perles d'ablation de myéline chacune dans les cellules du cortex et du cervelet et ajoutez 50 l de perles d'ablation de la myéline chacune dans les cellules de l'hippocampe et du striatum.
- Mélanger délicatement les cellules avec des perles et incuber les tubes sur la glace pendant 10 min.
- Porter le volume du tube avec des cellules corticales à 2 ml avec tampon MCS, et tous les autres à 1 ml (c.-à-d., ajouter 1 mL pour les cellules corticales; 500 l pour les cellules hippocampales et striatal; pas besoin d'ajouter un tampon aux cellules cérévelaires).
- Une fois que les colonnes sont vides de tampon de rinçant, placez un tube de 15 ml au-dessous de chaque colonne. Chargez les cellules corticales (2 ml) sur la colonne LD, et toutes les autres (1 ml chacune) sur les colonnes LS. Utilisez immédiatement 1 mL de tampon MCS chacun pour laver les tubes d'origine et charger la solution sur les colonnes correspondantes.
- Laver la colonne LD une fois avec 1 mL de tampon MCS et laver chaque colonne LS deux fois avec 1 ml de tampon MCS chaque lavage. Continuer à recueillir la solution de flux pendant le lavage.
- Filtrer les cellules dans des tubes FACS à fond rond à travers des bouchons de passoire de 35 m.
REMARQUE: Chaque tube doit recueillir environ 4 ml de suspension à cellule unique appauvrie de la myéline. - En option, prenez 10 L de la suspension de la cellule et mélangez-la avec 10 l de la solution bleu trypan de 0,4 %. Examinez les cellules sous un microscope de champ lumineux de 10x pour estimer le rendement, le taux de survie et le niveau de myéline résiduelle.
REMARQUE: Une préparation réussie devrait générer plus de 90% de cellules vivantes (de forme ronde et à l'exclusion du colorant bleu) avec peu ou pas de débris de myéline. - Cellules de pellet dans les tubes FACS à 400 x g pendant 5 min à 4 oC, avec frein 5. Versez lentement le supernatant et tamponnez le bord du tube sur du papier de soie. Resuspendre les cellules dans chaque tube avec 300 l de tampon FACS.
REMARQUE: Si le tri MCS est préférable, les perles de CD11b peuvent être employées pour sélectionner des microglies et d'autres cellules myéloïdes suivant l'enlèvement de myéline. Ces cellules peuvent ensuite être utilisées pour le scRNA-seq non-plat-basé aussi bien que l'ARN-seq en vrac. La mise en garde de cette approche alternative est que les perles de CD11b ne séparent pas les microglies des autres cellules immunitaires connexes qui sont également positives pour cet antigène.
5. Staining pour le tri cellulaire activé par fluorescence
REMARQUE: Cette étape devrait prendre 40 min.
- Ajouter 5 ll de souris fc récepteurs bloquer réactif (Tableau des matériaux) dans chaque tube. Incuber 5 min sur glace.
- Ajouter 1 l de CD45-PE-Cy7 et 1 l de CD11b-BV421 dans chaque tube.
REMARQUE: Des anticorps avec d'autres fluorophores conjugués peuvent être utilisés. Les anticorps contre TMEM119, un marqueur spécifique pour les microglies homéostatiques9, peuvent également être inclus, mais il est recommandé d'être utilisé avec CD45 et CD11b, parce que certaines sous-populations de microglies peuvent perdre l'expression de surface TMEM119. - Incuber les tubes sur un shaker pendant 10 min à température ambiante (RT).
- Ajouter 2 mL de tampon FACS pour laver.
- Les cellules pelleteuses à 4 oC, 400 x g pendant 5 min. Verser lentement le supernatant et tamponner le bord du tube sur du papier de soie. Resuspendre les cellules de chaque tube à l'aide de 400 l de tampon FACS avec 1 l d'inhibiteur de la RNase et 0,5 l d'iodure de propidium (PI, 1:1 000 dilution).
6. Index FACS Tri
REMARQUE: Cette étape devrait prendre 1 h.
- Suivant la procédure FACS standard, dessinez des portes basées sur la dispersion (à l'exclusion des débris), les cellules individuelles, les cellules vivantes (PI négatif), les microglies et les cellules myéloïdes (CD45,CD11b).
REMARQUE: Les cellules microgliales typiques expriment CD45 à des niveaux inférieurs comparés à d'autres macrophages frontaliers, tels que les macrophages périvasculaires et méningés, et donc gating sur CD45 faible CD11b- devrait être suffisant si l'accent de la recherche est des profils d'expression génique dans ces microglies classiques1,2. Cependant, certains sous-ensembles de microglies peuvent avoir une expression CD45 plus élevée et cela est particulièrement vrai pendant le développement ou dans des conditions de maladie. Afin d'assurer une analyse impartiale de l'expression des gènes microglial, les immunophénotypes cD45 élevés et cD45 faibles peuvent être enregistrés par le biais du réglage du tri de l'indice et des deux populations recueillies pour le séquençage et l'analyse en aval. En outre, l'expression de surface TMEM119 peut être utilisée pour cibler la population microgliale homéostatique (voir l'étape 5.2) et analysée avec les niveaux de CD45 et les résultats de séquençage. - Trier une seule microglie (avec une buse de 100 m) dans des plaques de réaction en chaîne de polymérase (PCR) de 96 puits, contenant 4 ll de tampon de lyse chaque puits (voir le protocole publié14 pour plus de détails).
REMARQUE: Le mélange de pointe d'ARN externe du Consortium (ERCC)(tableau des matériaux)peut être ajouté à 1:2.4 x 107 dans le tampon de lyse pour le contrôle de la qualité et la normalisation2. - Vortex brièvement les plaques et tourner vers le bas à l'aide d'une centrifugeuse banc-dessus.
- Congeler immédiatement les échantillons sur de la glace sèche. Conserver les assiettes à -80 oC jusqu'à la préparation de la bibliothèque.
REMARQUE: Alternativement, plus de cellules peuvent être rassemblées dans des tubes de 1.5 ml avec tampon d'extraction d'ARN pour l'ARN-seq en vrac. Selon l'expérience des auteurs, 3 000 cellules sont suffisantes pour générer des bibliothèques de bonne qualité suivant le protocole publié2,14.
7. Préparation de la bibliothèque à séquençage de l'ARN à cellule unique
REMARQUE: Ici, le protocole publié14 est suivi pour générer des bibliothèques scRNA-seq à l'aide de la robotique de manipulation liquide et quelques modifications. Dans cet article, la procédure n'est décrite que brièvement, et les différences sont mises en évidence. Le traitement simultané de 4 plaques prend environ 2,5 jours.
- Décongeler les plaques sur la glace et effectuer la transcription inverse avec l'amorce Oligo-dT30VN (dans le tampon de lyse) pour générer de l'ADNc avec des cycleurs thermiques (tableau 1) : 42 oC 90 min; 70 oC 5 min; 4 oC. Ensuite, amplifiez l'ADNc avec une étape supplémentaire de digestion exonuclée au début (tableau 2) en utilisant le mix maître PCR et les amorces IN situ PCR (ISPCR) ( Tableaudes matériaux) et l'état PCR suivant : 37 oC 30 min; 95 oC 3 min; 23 cycles de 98 oC 20 s, 67 oC 15 s, 72 oC 4 min; 72 oC 5 min.
- Purifez l'ADNc à l'aide de 18 l de perles magnétiques par puits (rapport de 0,7:1). Incuber la plaque sur un support magnétique pendant 5 min et laver les échantillons deux fois avec de l'éthanol fraîchement préparé à 80 %, 80 l par puits à chaque fois. Après le séchage de la plaque pendant 15-20 min, élifier l'ADNc avec 20 l de tampon d'élution par puits.
REMARQUE: Pour le contrôle de la qualité, utilisez un analyseur de fragments (analyse de fragments de séquençage de nouvelle génération à haute sensibilité, 1 à 6 000 pb) pour vérifier les distributions de taille et les concentrations d'ADNc, et ne traitez que d'autres échantillons avec un frottis compris entre 500 et 5 000 pb, et supérieur à 0,05 ng/L. - Pour générer des bibliothèques, mélanger 0,4 L de chaque échantillon d'ADNc avec 1,2 L de réactifs tn5 de tagmentation du kit de préparation de la bibliothèque (Table of Materials) dans une plaque de 384 puits à l'aide d'une machine à pipetage nanolitre, à 55 oC 10 min.
REMARQUE: Ici, 1/12.5 du volume de réaction suggéré (5 échantillons ll et 15 l de réactifs de tagmentation) est ajouté afin de réduire les coûts et, entre-temps, d'augmenter le débit. Une machine de pipetage de nanolitre (Table des matériaux)est employée pour transférer des réactifs (ceci et les étapes suivantes) des plaques et à 384 puits. - Ajouter 0,4 L de tampon de neutralisation pour arrêter la réaction de tagmentation à RT pendant 5 min.
- Ajouter 384 index(tableau des matériaux, 0,4 L à l'avant et 0,4 l inverse), 1,2 l de mélange PCR aux échantillons (2 l chacun), et amplifier les bibliothèques en utilisant la condition suivante : 72 oC 3 min; 95 oC 30 s; 10 cycles de 95 oC 10 s, 55 oC 30 s, 72 oC 1 min; 72 oC 5 min.
- Regroupez toutes les bibliothèques individuelles (prendre 1 l chacune) à partir de la même plaque de 384 puits ensemble, et utilisez des perles magnétiques(tableau des matériaux,0,7:1 ratio) pour purifier les bibliothèques finales mises en commun.
- Utiliser un fluoromètre (Tableau des matériaux) pour mesurer les concentrations et un bioanalyseur (Tableau des matériaux) pour examiner les distributions de taille des bibliothèques mises en commun avant le séquençage. Ciblez la profondeur de séquençage à 1 million de lectures brutes par cellule.
- Suivez les procédures bioinformatiques standard pour filtrer et couper les lectures de séquençage et effectuer l'alignement2. Utilisez le tableau de comptage et les métadonnées comme entrées pour effectuer l'analyse de clustering avec le paquet Seurat15.
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Résultats
Ce protocole décrit une méthode pour isoler et trier les microglies de différentes régions du cerveau dans un hémisphère cérébral perfused adulte, suivie de scRNA-seq. Nous utilisons le douncing pour créer une suspension à cellule unique et aussi comme première étape pour enrichir les microglies. L'insuffisance ou le sur-douncing réduit le rendement. En outre, les cerveaux adultes de souris contiennent des niveaux élevés de myéline, qui peut également réduire l'efficacité de tri et le rendement s'il n'est pas enlevé corr...
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Discussion
Les microglies interagissent activement avec d'autres types de cellules du SNC, et elles sont très sensibles aux stimuli environnementaux. Afin de minimiser les réponses inflammatoires et les changements aberrants dans leur expression génique au cours du processus d'isolement, ce protocole a été simplifié à partir d'une méthode publiée précédemment9, et il est maintenant approprié d'isoler les microglies de plusieurs régions d'un seul hémisphère du cerveau de souris en parallèle. Les tissus et les...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Nous remercions Mariko L. Bennett, Liana Nicole Bonanno et Spyros Darmanis pour leur aide lors de l'élaboration de ce protocole. Nous remercions également le Stanford Shared FACS Facility, en particulier Meredith Weglarz et Lisa Nichols; Yen Tran, Michael Eckart de Stanford Protein and Nucleic Acid Facility (PAN) pour leur grand soutien pour le tournage. Ce travail est financé par la Fondation JPB et la Fondation Vincent J. Coates.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 5 M Bétaïne | Sigma-Aldrich | Cat# B0300-5VL | |
| 10 mM dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# R0192 | |
| 0,5 M EDTA, pH 8,0 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15575020 | |
| 10X Hanks' Solution saline équilibrée | Thermo Fisher Scientific | Cat# 14185-052 | |
| 1 M HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| 1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix | Kapa Biosciences | Cat# KK2602 | |
| Tube en polystyrène à fond rond de 5 mL, avec capuchon de filtre de cellule | Corning | Cat# 352235 | |
| AATI, kit d’analyse de fragments NGS haute sensibilité (1 bp – 6 000 bp) | Analytique avancée | Cat# DNF-474-1000 | |
| Albumine sérique bovine | Sigma Aldrich | Cat# A8806 | |
| DNase I | Worthington | Cat# LS002007 | Solution de travail : 12500 unités/ml |
| DTT, Grade moléculaire | Promega | Cat# P1171 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4456740 | |
| Sérum fœtal bovin | Thermo Fisher Scientific | Cat# 10437-028 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 index) | Illumina | Cat# FC-131-2001 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 index) | Illumina | Cat# FC-131-2002 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 index) | Illumina | Cat# FC-131-2003 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 index) | Illumina | Cat# FC-131-2004 | |
| Exonucléase lambda (5 U/&mu ; l) | New England BioLabs | Cat# M0262S | |
| Mouse Fc block | BD Pharmingen | Cat# 553142 | |
| billes d’élimination de la myéline | Miltenyl Biotec | Cat# 130-096-433 | |
| Nextera XT DNA Sample Prep Kit | Illumina | Cat# FC-131-1096 | |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 cycles) | Illumina | Cat# 20024907 | |
| PBS ( 10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 70011044 | |
| PCRClean DX billes | Aline Biosciences | Cat# C-1003-50 | |
| Iodure de propidium | Thermo Fisher Scientific | Cat# P3566 | Coloration : 1:1000 |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermal Fisher Scientific | Cat# Q32851 | |
| Rat monoclonal anti souris/humain CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101236 ; RRID : AB_11203704 | Coloration : 1:300 |
| Rat monoclonal anti souris CD45, PE / Cy7 (clone 30-F11) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 25-0451-82 ; RRID : AB_469625 | Coloration : 1:300 |
| Inhibiteur de la RNase recombinante | Takara Bio | Cat# 2313B | |
| SMARTScribe Transcriptase inverse (100 U/&mu ; l) | Clontech | Cat# 639538 | Contenant 5x Tampon Premier brin |
| Oligonucléotides | |||
| 0.1 &mu ; M ISPCR Oligo : 5' - AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3' | (Picelli et al., 2014) | ||
| Oligo-dT30VN primer : 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3' | (Picelli et al., 2014) | ||
| TSO 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' (« r » est les forribobases et « + » est pour une base LNA) | (Picelli et al., 2014) | ||
| Solutions | |||
| Tampon FACS | Recette : filtre stérile 1 % FBS, 2 mM d’EDTA, 25 mM HEPES dans 1X tampon | ||
| PBS MCS | Recette : filtre stérile 0,5 % BSA, 2 mM EDTA dans 1X PBS | ||
| Medium A | Recette : 15 mM HEPES, 0,5 % glucose dans 1X HBSS sans phénol red | ||
| Plates | |||
| 384 puits Rigi-Plate PCR Microplaques, Axygen Scientific | VWR | 89005-556 | |
| Plaques PCR à coque dure 96 puits | Bio-Rad | HSP9631 | |
| Others | |||
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Homogénéisateur Dounce, 2 ml | Wheaton | ||
| Grande colonne d’épuisement | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Grande colonne de sélection | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Séparateur QuadroMACS | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RNAzap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Passoire (70 &mu ; m) | Falcon | 352350 | |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II | BD Biosciences | http://www.bdbiosciences.com/ | |
| Bioanalyseur | Agilent | 2100 | |
| Analyseur de fragments | Agilent | 5300 | |
| Mosquito HTS robot de pipetage nanolitre | TTP Labtech | https://www.ttplabtech.com/ | |
| Qubit 4 Fluorimètre | Thermo Fisher Scientific | Q33226 |
Références
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